专利名称：一种龙血竭诱导剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种龙血竭诱导剂及其制备方法。
背景技术：
血竭为珍稀名贵中药，具有活血化瘀、消肿止痛，收敛止血，生肌敛疮、补血之功效，常用于各种血症，被喻为“和血之圣药”(见《本草纲目》)。血竭最初来源于西域，近代来自东南亚的苏门达腊。七十年代，中国科学院西双版纳热带植物园的蔡希陶教授在云南南部发现了产生血竭的植物资源——剑叶龙血树(Dracaena cochinchinensis)，并通过植物化学和药理学研究，开发出国产血竭，称为龙血竭。实验证明国产龙血竭与《本草纲目》中所记载的由西域来的血竭(dragon’s blood)最为接近，完全可以作为东南亚进口血竭的国产替代用品。我国现有龙血竭生产企业十余家，以剑叶龙血树含脂木为原料生产的血竭药物多达60多种，年产值达5亿多元。
在自然状态下，剑叶龙血树因雷电、风暴及植食性动物啃食而损伤后，由于微生物的侵入而产生出的防卫性化合物，即为龙血竭。但该过程十分缓慢，往往长达数十年乃至上百年，很难满足日益增长的市场需求。目前，对剑叶龙血树共生真菌及其与龙血竭形成的关系仅有少量的初步探讨，虽提出了利用真菌诱导龙血竭产生的假说，但现有技术中尚未见有龙血竭诱导微生物的分离培养及制剂方法成功的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种龙血竭诱导剂，通过人工诱导的方法加速龙血竭的形成，提高剑叶龙血树的栽培效益，保证龙血竭规模化生产的原料供应。
本发明的另一目的在于提供一种所述龙血竭诱导剂的制备方法。
本发明提供了一种龙血竭诱导剂，该诱导剂由以下方法制备获得将野生剑叶龙血树活体茎干上正在形成血竭的部位割下，经消毒、培养、分离和鉴定后得到龙血竭诱导菌株，并在4℃下保藏备用。该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，学名鉴定为Fusariumculmorum，菌株命名为龙血竭诱导菌株Brwg，保藏编号为CGMCC No 1621，保藏日期2006年2月20日。将剑叶龙血树的新鲜茎干风干后，粉碎成60～100目的粉末备用。将100份蒸馏水、20份马铃薯汁、2份葡萄糖、0.1份琼脂和0.1份剑叶龙血树茎干组织粉末搅拌均匀，制成菌株培养液，消毒后备用。将龙血竭诱导菌株置于活化培养基中使其活化。将活化的龙血竭诱导菌株加入上述菌株培养液中培养，在每1000ml的培养液中放入0.5～1.5g的菌丝体，在无光照、25～27℃恒温和280～320r/min下振荡培养7～10天后，得到每毫升含0.1～0.3g菌丝的具有活性的龙血竭诱导菌株悬浮液体，将其装瓶即得龙血竭诱导剂。
所述的活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的重量份配比为马铃薯汁20，葡萄糖2，琼脂1.5和蒸馏水76.5。
本发明提供了一种龙血竭诱导剂的制备方法，该方法由以下步骤组成1、龙血竭诱导真菌的采样和分离培养将野生剑叶龙血树活体茎干上正在形成血竭的部位割下，经消毒、培养、分离和鉴定后得到龙血竭诱导菌株，并在4℃下保藏备用；2、菌株培养液的制作将剑叶龙血树的新鲜茎干风干后，粉碎成60～100目的粉末备用。将100份蒸馏水、20份马铃薯汁、2份葡萄糖、0.1份琼脂和0.1份剑叶龙血树茎干组织粉末搅拌均匀，制成菌株培养液，消毒后备用；3、菌株的活化将龙血竭诱导菌株置于活化培养基中使其活化；4、龙血竭诱导剂的制作将活化的龙血竭诱导菌株加入上述菌株培养液中培养，在每1000ml的培养液中放入0.5～1.5g的菌丝体，在无光照、25～27℃恒温和280～320r/min下振荡培养7～10天后，得到每毫升含0.1～0.3g菌丝的具有活性的龙血竭诱导菌株悬浮液体，将其装瓶即得龙血竭诱导剂。
步骤3所述的活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的重量份配比为马铃薯汁20，葡萄糖2，琼脂1.5和蒸馏水76.5。
迄今为止，龙血竭的开发和利用都是依靠野生剑叶龙血树的采集，不仅价格昂贵，而且供应量也无法保证。应用本发明，能够极大地缩短龙血竭的形成时间，提高剑叶龙血树的栽培效益，保证龙血竭规模化生产的原料供应，而且在帮助山区农民脱贫致富的同时也保护了生态环境。其方法简便、成本低廉，具有良好的市场应用前景。
保藏生物材料的说明本发明涉及的龙血竭诱导菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，学名鉴定为Fusarium culmorum，菌株命名为龙血竭诱导菌株Brwg，保藏编号为CGMCC No 1621，保藏日期2006年2月20日。
图1为剑叶龙血树正在形成龙血竭的茎干组织和内生的真菌样品；图2为剑叶龙血树内生真菌的分离培养情况；图3为龙血竭诱导菌株Brwg(Fusarium culmorum)样品；图4为龙血竭诱导剂样品。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但它们不是对本发明的限定。
实施例1将野生剑叶龙血树活体茎干上正在形成血竭的部位割下，用0.1％升汞(HgCl2)进行5分钟的表面消毒和6次蒸馏水漂洗；在超净工作台上将消毒后的剑叶龙血树组织切成0.8×0.5×0.3厘米的小块后，放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(20％马铃薯之汁，2％葡萄糖和1.5％琼脂，其余为蒸馏水)中培养；经分离、鉴定真菌后得到龙血竭诱导菌株Brwg(Fusarium culmorum)，并在4℃下保藏备用。将剑叶龙血树的新鲜茎干风干后，粉碎成80目的粉末备用。将100份蒸馏水溶液、20份马铃薯之汁、2份葡萄糖、0.1份琼脂和0.1份剑叶龙血树茎干组织粉末搅拌均匀，制成菌株培养液，消毒后备用；将龙血竭诱导菌株置于活化培养基(20％马铃薯之汁，2％葡萄糖和1.5％琼脂，其余为蒸馏水)中，使其活化。将活化的龙血竭诱导菌株Brwg(Fusariumculmorum)加入上述菌株培养液中培养，每1000ml培养液中放入1g菌丝体，在无光照、26℃恒温和300r/min下振荡培养9天后，得到每毫升含0.1～0.3g菌丝的具有活性的龙血竭诱导菌株悬浮液体，将其装瓶即得龙血竭诱导剂。龙血竭诱导剂为活性菌株，需尽快使用，在室温下可保持活力7天，在4℃下可保持活力3个月。
实施例2重复实施例1，有以下不同点每1000ml培养液中放入0.5g菌丝体，在无光照、25℃恒温和280r/min下振荡培养10天。
实施例3重复实施例1，有以下不同点每1000ml培养液中放入1.5g菌丝体，在无光照、27℃恒温和320r/min下振荡培养7天。
实施例4重复实施例1，有以下不同点剑叶龙血树茎干组织粉末为60目。
实施例5重复实施例1，有以下不同点剑叶龙血树茎干组织粉末为100目。
权利要求
1.一种龙血竭诱导剂，该诱导剂由以下方法制备获得将野生剑叶龙血树活体茎干上正在形成血竭的部位割下，经消毒、培养、分离和鉴定后得到龙血竭诱导菌株，并在4℃下保藏备用；将剑叶龙血树的新鲜茎干风干后，粉碎成60～100目的粉末备用；将100份蒸馏水、20份马铃薯汁、2份葡萄糖、0.1份琼脂和0.1份剑叶龙血树茎干组织粉末搅拌均匀，制成菌株培养液，消毒后备用；将龙血竭诱导菌株置于活化培养基中使其活化；将活化的龙血竭诱导菌株加入上述菌株培养液中培养，在每1000ml的培养液中放入0.5～1.5g的菌丝体，在无光照、25～27℃恒温和280～320r/min下振荡培养7～10天后，得到每毫升含0.1～0.3g菌丝的具有活性的龙血竭诱导菌株悬浮液体，将其装瓶即得龙血竭诱导剂。
2.权利要求1所述龙血竭诱导剂的制备方法，该方法由以下步骤组成(1)龙血竭诱导真菌的采样和分离培养将野生剑叶龙血树活体茎干上正在形成血竭的部位割下，经消毒、培养、分离和鉴定后得到龙血竭诱导菌株，并在4℃下保藏备用；(2)菌株培养液的制作将剑叶龙血树的新鲜茎干风干后，粉碎成60～100目的粉末备用；将100份蒸馏水、20份马铃薯汁、2份葡萄糖、0.1份琼脂和0.1份剑叶龙血树茎干组织粉末搅拌均匀，制成菌株培养液，消毒后备用；(3)菌株的活化将龙血竭诱导菌株置于活化培养基中使其活化；(4)龙血竭诱导剂的制作将活化的龙血竭诱导菌株加入上述菌株培养液中培养，在每1000ml的培养液中放入0.5～1.5g的菌丝体，在无光照、25～27℃恒温和280～320r/min下振荡培养7～10天后，得到每毫升含0.1～0.3g菌丝的具有活性的龙血竭诱导菌株悬浮液体，将其装瓶即得龙血竭诱导剂。
3.根据权利要求1或2所述的龙血竭诱导剂，其特征在于所述的活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
4.根据权利要求3所述的龙血竭诱导剂，其特征在于所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的重量份配比为马铃薯汁20，葡萄糖2，琼脂1.5和蒸馏水76.5。
全文摘要
本发明公开了一种龙血竭诱导剂及其制备方法。将野生剑叶龙血树活体茎干上正在形成血竭的部位割下，经消毒、培养、分离和鉴定后得到龙血竭诱导菌株，在每1000ml的菌株培养液中放入0.5～1.5g的菌丝体，在无光照、25～27℃恒温和280～320r/min下振荡培养7～10天后，得到具有活性的龙血竭诱导菌株悬浮液体，将其装瓶即得龙血竭诱导剂。本发明方法简便，能够显著缩短龙血竭的形成时间，提高剑叶龙血树的栽培效益，具有良好的市场应用前景。
文档编号C12N5/04GK1821387SQ20061001073
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月9日 优先权日2006年3月9日
发明者宋启示, 杨晓虹, 陈定芳 申请人:中国科学院西双版纳热带植物园