专利名称：一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种能快速分解纤维质有机物的木霉属菌株(Trichoderma sp.)。
背景技术：
在农作物栽培过程中使用生物制剂为现今栽培所使用的新技术，其中生物制剂的种类包括(1)促进植物生长者，如菌根菌、固氮菌及根圈有益微生物群；(2)病虫害生物防治者，如苏力菌、木霉菌及枯草杆菌；(3)改善农作物生长环境者，如溶磷菌。生物制剂的功用主要在促进植物生长、增加产量及减少病虫害，而其它功能尚包含促进植物激素产生、诱发植物抗病反应、延缓土壤酸化、减低土壤盐类累积及诱使其它有益微生物产生。这些生物制剂近年来已有相当多的研究投入。
生物制剂的定义如以广泛的生物种类区分，除包含农作物本身外，尚包含与农作物发生反应/作用的各种生物。如仅以微生物制剂而言，则生物制剂只包含微生物体本身或其相关代谢产物。微生物制剂施用在农作物生长上的效益可粗分为直接效益及间接效益。具直接效益的微生物包括亚科共生根瘤菌(Rhizobium)、与森林作物共生的放线菌(Frankia)、促进植物生长的固氮细菌、囊丛枝菌根菌(vesicualar-arbuscularmycorrhizal fungi)及外生菌根菌(ectomycorrhizal fungi)，其皆能直接促进植物的营养吸收。而具间接效益的微生物包括对植物病原菌、植物害虫及杂草竞争的生物控制作用者，其具有减轻影响农作物生长的不良环境因子作用的间接机制。无论该机制为何，这些微生物在实验过程中均能显现促进农作物生长潜能，取代无机肥料及化学杀虫剂，降低生产成本及减少环境污染，并能确保农作物产量。
一般农业废弃物均兼具污染性及资源性。利用微生物可妥善处理农业废弃物，将其适当地转化为农业生产所需的养分源(如氮、磷及钾)及能量源(如碳)。若能将农业废弃物回归于农田，则不仅合乎资源再利用的自然法则，并且亦是现今处理大量有机废弃物的重要方向。
微生物在堆肥发酵过程中担任有机物分解与堆肥稳定化的角色。接种适当的微生物可加速堆肥发酵。为达到有效率的堆肥化作用，除添加适当的微生物外，在堆积环境中，维持适合微生物生长的条件使其能充分活动与繁殖，更能加速堆肥的发酵与分解。堆肥发酵用的微生物的繁殖可利用自然堆肥法，即依照堆肥化条件，于木屑、豆粕堆肥材料中，调整适当的材料大小、水分含量及通气性等，再进行堆积腐熟，使自然界中微生物滋生于该堆肥材料中，最后该腐熟堆肥中即含有多种能分解有机物的微生物菌种。该等微生物菌种可作为下一批堆肥制作的微生物菌种。但为了增进堆肥材料发酵的分解效率，针对不同有机物的特性，添加适当的微生物菌种将是堆肥制作过程中的重要步骤。其中有关利用微生物菌种的关键机制应包括筛选适当的微生物菌种、建立有效率的菌种培养及繁殖方法以及应用于堆肥材料中的接种方法等。
已发现木霉菌(Trichoderma sp.)除可拮抗某些植物病原菌(诸如猝倒病菌(Pythium sp)及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等)以减少农作物死亡外，其部分菌株尚可与农作物根系共生以克服环境逆境，达到保护其根系、增进养份吸收、促进生长及提高产量等效果。利用基因转殖技术可将抗病基因导入植物体内而达到抗病功能。由于木霉菌有诸多功能上的优点，目前已有将该菌开发成生物防治用的生物制剂。常用的木霉菌包括T.virens、T.harzianum、T.atroviride及T.asperellum，且应用的农作物包括蔬菜、果树、花卉及草皮。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株。
本发明的木霉菌株的特征为分生孢子柄具有复数的侧生枝，每一分枝可分岔，较常形成对生小分枝；每一小枝上可产生2～3个轮生或对生排列的产孢细胞；产孢细胞为瓶梗形，其型态多为直立，部分稍微弯曲，中间较宽状似葫芦形，大小为6.9～11.8×1.5～3.11μm；分生孢子为近球形至宽椭圆形，部分稍微呈卵形，大小为3.1～4.6×2.4～3.7μm，呈绿色；成熟孢子表面平滑至粗糙，具不明显刺状饰物；孢子壁表面饰物在扫描电子显微镜下呈尖塔形或梯形平台状，分布于整个孢子表面。
本发明提供的一种纤维分解能力强的木霉菌株，该菌株可于堆肥反应的初期即能快速扩散至整个堆肥材料，以使堆肥材料等有机物在堆肥发酵过程中迅速分解，并可作为有机堆肥材料酸酵添加剂使用。
本发明筛选出的木霉菌株对有机堆肥具有高分解力，且可以加速堆肥腐熟，减少堆肥化时程，降低堆肥制作成本。
图1是为本发明的木霉菌株在25℃于含2％麦芽萃取物的培养基中生长第七天的菌落形态图；图2是为本发明的木霉菌株在25℃时于马铃薯葡萄糖-洋菜培养基中生长第七天的菌落形态图；图3是为本发明的木霉菌株的产孢区域在63倍放大倍率下呈现苞状突起的外观形态图；图4是为本发明的木霉菌株的分生孢子柄及分枝在200倍放大倍率的外观形态图；图5是为本发明的木霉菌株的分生孢子柄及分枝在200倍放大倍率的另一外观形态图；图6是为本发明的木霉菌株的分生孢子柄及分枝在1000倍放大倍率的外观形态图；以及图7是为本发明的木霉菌株的分生孢子柄在2000倍放大倍率的外观形态图。
具体实施例方式
本发明的木霉菌株可分离自天然来源，例如土壤、农作物根系及农家自制的堆肥，其中利用2％水琼脂(Wateragar，W.A.)洋菜平板法进行微生物分离。经土壤分离者，称取1g土壤置于10c.c.无菌水中，经振荡后取出滤液进行平板划线分离。对农作物根系分离者采用根段分离法，将根段洗净后切取0.5公分小段，将其中5小段置于水琼脂中；将各堆肥材料先细分成0.5公分后，取其中5小段置于水琼脂中，以上每种材料准备5个培养皿，经于28℃培养箱中不照光培养三天后，挑取片段菌丝尖端，将其移至马铃薯葡萄糖培养基上，经培养7天后观察各菌丝生长状态，由其中挑取木霉菌菌丝形态的菌株，经二次纯系分离后，切取0.5cm2的菌丝块置于5c.c.无菌水的螺旋试管中保存；各分离菌株经马铃薯葡萄糖洋菜培养基(PDA)培养七天后，切取菌丝块，置于10g培养基中培养，观察各个菌株的菌丝缠绕及生长情形，并观察其产孢情形，据以挑选能快速缠绕稻谷培养基并能产孢的菌株。
经挑选出可适用于牛粪堆肥的菌株经BCRC鉴定后是为Trichodermaasperellum(TCT301)，其特征为分生孢子柄具有复数的侧生枝，每一分枝可分岔，较常形成对生小分枝；每一小枝上可产生2～3个轮生或对生排列的产孢细胞(如图3至图5所示)，产孢细胞为瓶梗形，其型态多为直立，部分稍微弯曲，中间较宽状似葫芦形，大小为6.9～11.8×1.5～3.1μm；分生孢子为近球形至宽椭圆形，部分稍微呈卵形，大小为3.1～4.6×2.4～3.7μm，呈绿色；成熟孢子表面平滑至粗糙，具不明显刺状饰物；孢子壁表面饰物于扫描式电显下呈尖塔形或梯形平台状，分布于整个孢子表面(如图6及图7所示)。
以下是测试所得木霉菌于不同生长条件下的菌株特性。
将前述菌株接种于MA2培养基(含2％麦芽萃取物的培养基)，置于25℃下生长快速，3～4天后菌丝可扩展至整个9公分培养皿(如图1所示)；产孢细胞于培养皿外围形成束状小丛，为粉状或颗粒状；成熟孢子团呈现深绿色；菌落背面呈白色。
将前述菌株接种于麦芽萃取物洋菜培养基(MEA)中，置于25℃下生长快速，3天后菌丝可扩展至整个9公分培养皿(如图1所示)，菌落平展，产孢浓密，产孢细胞散生分布于整个培养皿，为粉状或颗粒状；成熟孢子团呈现暗绿色；菌落背面呈白色至乳黄色。
将前述菌株接种于马铃薯葡萄糖洋菜培养基(PDA)中，置于25℃下生长快速，3天后菌丝可扩展至整个9公分培养皿(如图2所示)，菌落平展，产孢浓密，产孢细胞散生分布于整个培养皿，为粉状或颗粒状；成熟孢子团呈现橄榄绿至深绿色；菌落背面呈白色至乳黄色。
本发明的木霉菌株可以是分离自天然来源的木霉菌株的变异体，例如经紫外线(UV)照射、甲磺酸乙脂处理或亚硝酸处理所得到的变异体，亦可以是利用细胞融合或重组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)技术经基因工程改造所产生的重组菌株。
以下实施例是用于进一步说明本发明，但本发明的范围并非限于下述的实施例实施例1.使用木霉菌制作堆肥的温度效应牛粪有机堆肥材料的各成分干物重用量比例依序为(牛粪1000kg、稻壳500kg、米糠100kg)；将堆肥材料混合均匀后再取用适量本发明所述的木霉菌(菌数约1×1012spore/ml)，先加水稀释200倍成菌悬液，再将菌稀释液混入堆肥材料中，最后将堆肥材料水分含量调整至60％，堆积高度维持约1.5～2.0m，尔后立即进行堆积制作，堆肥腐化期间约5～7日利用铲装机每日翻堆乙次，持续至堆肥腐熟为止。
在接种木霉菌的牛粪堆肥材料制作堆积的第0-5日，堆肥体温度上升到60℃以上，最高可达到67℃，此高温期(＞60℃)维持至约第15日，尔后温度逐渐降低，约第31～35日，堆肥温度降低至约44℃，约第36～45日，堆肥温度可降低至约41℃；未接种木霉菌的牛粪堆肥，在堆积制作第6～10日，堆肥体温度上升到60℃以上，最高可达61℃，约第36-35日，堆肥温度约48℃，约第36～45日，堆肥温度才降低至约44℃，显示接种木霉菌处理的牛粪堆肥可以促进堆肥高温(＞60℃)，最后提早4～6日达到腐熟阶段。
使用木霉菌制作堆肥的温度效应如表一所示表一、接种木霉菌对牛粪堆肥材料温度的影响
单位(℃)实施例2.使用木霉菌对堆肥养分含量的影响堆肥制作同实施例1，由牛粪堆肥的养分含量分析结果显示如下表二，利用木霉菌接种的牛粪堆肥氮含量约2.51％、磷含量约1.27％、钾含量约2.70％、钙含量约1.59％、镁含量约1.67％、有机质含量约60.7％、锌含量约85ppm、铜含量约32ppm、木霉菌数6.2×105spore(孢子)/g。
未接种木霉菌的牛粪堆肥氮含量约2.44％、磷含量约1.25％、钾含量约2.62％、钙含量约1.39％、镁含量约1.61％、有机质含量约64.7％、锌含量约84ppm、铜含量约30ppm、木霉菌数1.1×102spore(孢子)/g。
显然有接种木霉菌的牛粪堆肥的氮、磷、钾、钙、镁、锌及铜等含量均略高于未接种处理，且其养分含量较稳定。有接种木霉菌菌种于堆肥制作过程中，以及牛粪堆肥等制成品中，均可分离出所添加的菌种，分离率约为1×105至1×106spore/g，显示所添加的木霉菌菌种可在堆肥化过程及堆肥成品中存活。
表二、接种木霉菌对牛粪堆肥温度的影响
本发明的实施方法已详述于前述实施例中，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
综上所述，本发明筛选出的木霉菌株对牛粪堆肥材料配方具高分解力，且可以加速堆肥腐熟，减少堆肥化时程，降低堆肥制作成本。
权利要求
1.一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，该菌株的特征为分生孢子柄具有复数的侧生枝，每一分枝可分岔，较常形成对生小分枝；每一小枝上可产生2～3个轮生或对生排列的产孢细胞，产孢细胞为瓶梗形，其型态多为直立，部分稍微弯曲，中间较宽状似葫芦形，大小为6.9～11.8×1.5～3.1μm；分生孢子为近球形至宽椭圆形，部分稍微呈卵形，大小为3.1～4.6×2.4～3.7μm，呈绿色；成熟孢子表面平滑至粗糙，具不明显刺状饰物；孢子壁表面饰物于扫描电子显微镜下呈尖塔形或梯形平台状，分布于整个孢子表面。
2.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述的木霉菌株接种于含2％麦芽萃取物的培养基并置于25℃时可生长快速，3～4天菌丝可扩展至整个9公分培养皿；产孢构造于培养皿外围形成束状小丛，为粉状或颗粒状；成熟孢子团呈现深绿色；菌落背面呈白色。
3.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述的木霉菌株接种于麦芽萃取物洋菜培养基培养基并置于25℃时可生长快速，3天菌丝可扩展至整个9公分培养皿，菌落平展，产孢浓密，产孢构造散布于整个培养皿，为粉状或颗粒状；成熟孢子团呈现暗绿色；菌落背面呈白色至乳黄色。
4.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述的木霉菌株接种于马铃薯葡萄糖洋菜培养基，置于25℃，生长快速，3天后菌丝可扩展至整个9公分培养皿，菌落平展，产孢浓密，产孢构造散布于整个培养皿。
5.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述产孢构造为粉状或颗粒状。
6.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述成熟孢子团呈现暗橄榄绿至深绿色。
7.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述菌落背面呈白色至乳黄色。
8.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述木霉菌株是分离自天然来源的木霉菌株的变异体。
9.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述木霉菌株是经紫外线(UV)照射、甲磺酸乙脂处理或亚硝酸处理所得到的变异体。
10.按权利要求1所述的一种能将动物性的有机堆肥材料分解发酵的木霉菌株，其特征在于所述木霉菌株是利用细胞融合或重组脱氧核糖核酸技术经基因工程改造所产生的重组菌株。
全文摘要
本发明关于一种能将富含纤维质的有机堆肥(诸如牛粪)分解发酵的木霉菌株，该菌株的特征为分生孢子柄具有复数的侧生枝，每一分枝可分岔，较常形成对生小分枝；每一小枝上可产生2～3个轮生或对生排列的产孢细胞；产孢细胞为瓶梗型，其型态多为直立，部分稍微弯曲，中间较宽状似葫芦形，大小为6.9～11.8×1.5～3.1μm；分生孢子为近球形至宽椭圆型，部分稍微呈卵形，大小为3.1～4.6×2.4～3.7μm，呈绿色；成熟胞子表面平滑至粗糙，具不明显刺状饰物；孢子壁表面饰物于扫描式电显下呈尖塔形或梯形平台状，分布于整个孢子表面。
文档编号C12R1/885GK101050425SQ200610034868
公开日2007年10月10日 申请日期2006年4月5日 优先权日2006年4月5日
发明者萧松溪 申请人:萧松溪