专利名称：一种葡萄糖六磷酸脱氢酶(g6pd)测定试剂的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)测定试剂的制造方法，属生物化学、酶学和检验诊断试剂领域。
背景技术：
葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)是红细胞磷酸戊糖代谢途径的关键酶，是红细胞产生还原型辅酶II(NADPH)的唯一途径，还原型辅酶(NADPH)是谷胱甘肽还原酶的辅酶，还原型谷胱甘肽(GSH)是保持红细胞膜的完整性的必要条件。葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)的缺乏导致还原型辅酶(NADPH)生成减少，间接导致还原型谷胱甘肽(GSH)生成降低，使红细胞膜失去巯基的保护而功能受损发生溶血，间接导致间接胆红素升高。在医疗诊断过程中，检验患者红细胞中的葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)活性，可判断溶血性贫血以及男女婚前和妇女产前检查以预防遗传性葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)的缺乏导致的溶血，此种检验也是新生儿黄疸分类的重要医学指标。目前市场上检验葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)的试剂产品操作比较繁锁，不适合全自动生化分析仪使用；六磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)对速率法检测葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)有正干扰，一直是临床化学技术中的一个棘手的问题，给临床葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏病人杂合子的诊断带来很大困难。国内外未见有作者报导排除这一干扰的方法。本发明为了填补市场空白，开发适应全自动生化分析仪操作程序，利用样品速率空白法排除了6PGD的干扰，开发出本发明。
发明内容本发明的目的是提供一种葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)测定试剂的制造方法。本发明在检验过程中不用测定血红蛋白浓度；不用生理食盐水洗涤红细胞，直接用压积红细胞测定酶的活性，可以不受患者贫血程度的影响；在检测过程中，同时能排除患者本身的6PGD干扰，提高杂合子的检出率；试剂液体状态下在2～8℃下贮存，质量稳定时间长。
(一)发明原理本发明解决技术方案的依据原理是这样的检测样品中的葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)催化试剂中的葡萄糖六磷酸(G6P)生成六磷酸葡萄糖酸(6PG)，同时将试剂中的氧化型辅酶II(NADP+)转化为还原型辅酶II(NADPH)。由于氧化型辅酶II(NADP+)被还原成还原型酶II(NADPH)，从而使仪器中340nm处的吸光度上升。通过监测340nm处吸光度上升的速率，可以计算出样品中葡萄糖六磷酸脱氢酶的活性。由于样品中含有六磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)，它能催化六磷酸葡萄糖酸(6PG)生成五磷酸核酮糖，同时也把NADP+还原成NADPH，使吸光度上升，使检测结果假性升高。本发明采用两种试剂，即试剂(1)和试剂(2)中含有的双底物六磷酸葡萄糖酸(6PG)和葡萄糖六磷酸(G6P)同时作用于被检测样品后所产生的速率变化减去单独使用六磷酸葡萄糖酸(6PG)所产生的速率变化求出真正的葡萄糖六磷酸脱氢酶的活性。其反应过程于下
第一反应为第一步，连同第二反应为第二步，生化分析仪在完成第二反应后会自动减去第一步反应的变化速率，读出实测结果。
(二)组合物质及重量百分含量本发明由三种试剂组成试剂1、试剂2、试剂3、1、试剂1的组成物及重量百分含量氯化镁(MgCl2) 0.2％～2.0％乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 0.02％～0.2％氧化型辅酶II(NADP+)0.02％～0.2％六磷酸葡萄糖酸三钠(GPG) 0.01％～0.1％三羟甲基氨基甲烷(Tris) 1.5％～2.0％盐酸(HCl) 0.8％～2.0％乳化剂(OP) 0.2％～0.5％蒸馏水(H2O)97.25％～93％2、试剂2的组成物及重量百分含量氯化镁(MgCl2) 0.2％～2.0％乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 0.02％～0.2％氧化型辅酶II(NADP+)0.02％～0.2％葡萄糖六磷酸二钠(G6P) 0.2％～0.5％三羟甲基氨基甲烷(Tris) 1.5％～2.0％盐酸(HCl) 0.8％～2.0％乳化剂(OP) 0.2％～0.5％
蒸馏水(H2O) 97.06％～92.6％3、试剂3为蒸馏水。
(三)物质分子式、结构式、性质及产地(1)氯化镁分子式MgCl2、6H2O白色易潮解的单科晶体，有苦咸味，易溶于水和乙醇。强电解质。
产地天津市福晨化学试剂厂(2)乙二胺四乙酸二钠结构式 性质无色结晶性固体，溶于水，络合剂。也用作解毒剂。
产地广东省台山市粤侨试剂塑料有限公司(3)氧化型辅酶II(NADP+)名称尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结构式
性质白色粉末，溶于水产地西格玛公司美国(中山宝骏公司代购)(4)六磷酸葡萄糖酸三钠(6PG)分子式C6H10Na3O10P结构式 性质白色粉末，溶于水产地西格玛公司 美国(中山宝骏公司代购)(5)三羟甲基氨基甲烷(Tris)结构式 性质白色结晶性固体，溶于水产地芬兰，厦前化学有限公司(中山宝骏公司代购)(6)盐酸(HCl)性质强酸产地广州化学试剂厂(7)乳化剂(OP)性质无色至黄棕色粘稠液体，溶于水、醇等溶剂。
产地广东省汕头市光华化学厂(8)葡萄糖六磷酸二钠(G6P)
分子式C6H11O9PNa2 结构式性质白色粉末，溶于水产地西格玛公司 美国(中山宝骏公司代购)(四)配制的工艺过程(1)配制试剂1在洁净的玻璃容器中首先加入已称量的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入称量的电解质氯化镁(MgCl2)，加入称量的络合剂(EDTA)，继续加入称量的氧化型辅酶II(NADP)，加入称量的六磷酸葡萄糖酸三钠(6PG)，再加入盐酸(HCl)溶液，使调节PH到一定值，然后搅拌过滤，再加入蒸馏水到一定容量；(2)配制试剂2与配制试剂(1)的工艺过程相同，只是不加入六磷酸葡萄糖酸三钠(6PG)，而加入葡萄糖六磷酸二钠(G6P)，最后加入蒸馏水到一定容量。
(3)配制试剂3用蒸馏设备制备纯净的蒸馏水，冷却备用。
(4)将上述所配制的试剂灌装分至小瓶，以作医疗检验用；将试剂1灌装45ml×1瓶备用，将试剂2灌装7ml×1瓶备用；将试剂3蒸馏水灌装125ml×2瓶备用。
(5)要求配制上述三种试剂的操作过程均在无菌车间里进行；三种试剂均为无色透明液体，2～8℃保存。
(五)本发明优点(1)各种厂家试剂性能与本发明试剂性能比较表
(2)本试剂用于测定G6PD具有操作简便、特异性好、灵敏度高、不受6PGD影响、适用于全自动生化分析器使用。
下面结合
和具体实施方式
来进一步了解本发明的制造方法。
附图1为本发明的制造工艺流程图；附图2为本发明三种试剂的灌装组装图。
具体实施方式对葡萄糖六磷酸脱氢酶定量检测是采用本发明的三种试剂来进行的。
试剂1 装瓶使用容积为1×45ml；试剂2 装瓶使用容积为1×7ml；试剂3 装瓶使用容积为2×125ml。
*庆大霉素的包被浓度是用于粪链球菌高水平氨基糖苷类耐药性筛选；表中的MIC指国际标准的最小抑菌浓度。
表5用链球菌阳性奶样和纯培养进行的EN液体培养法与标准纸片扩散法药敏试验结果
S代表敏感；R代表耐药；+和-分别代表在校正MIC及EN培养液中生长(耐药)和不生长(敏感)。
4、计算公式
式中ΔAS/min样品管平均每分钟的吸光度变化率ΔAB/min样品空白管平均每分钟的吸光度变化率TV 总反应体积(ml)ε NADPH在340nm处的毫摩尔分子消光系数为6.22SV 样品体积(ml)P 比色杯计算光径(cm)，绝大部全自动生化分析仪为11000变化因子51 样品稀释倍数5、参考范围成人压积红细胞G6PD活性＞1300U/L；新生儿或脐带血压积红细胞G6PD活性＞2500U/L。
6、具体检测实例(1)XXX医院检验报告单(生化杂项)姓名蔺淑平性别女年龄56样本号1打印科别 床号 病人ID诊断
收检2006-02-27送检XXX报告2006-02-2700:24检验XXX 审核XXX
(2)XXX医院检验报告单(生化杂项)姓名黄怡婷性别女年龄5样本号2打印科别 床号 病人ID 论断
收检2006-02-27送检XXX报告2006-02-2700:24检验XXX审核XXX(3)XXX医院检验报告单(生化杂项)姓名黄小芳性别女年龄样本号3打印科别 床号 病人ID 诊断
收检2006-02-27送检XXX报告2006-02-2700:24检验XXX审核XXX(4)XXX医院检验报告单(生化杂项)姓名杨丽萍性别女年龄56样本号4打印科别 床号 病人ID诊断
收检2006-02-27送检XXX报告2006-02-2700:24检验XXX审核XXX(5)XXX医院检验报告单(生化杂项)姓名顺发青性别男年龄56样本号1打印科别 床号 病人ID诊断
收检2006-02-27送检XXX报告2006-02-2700:24检验XXX审核XXX初步判断从以上具体检测实例中，有三位被检人认为正常人，一位重度缺乏G6PD(56U/L)，一位患者为G6PD中度缺乏(765U/L)。
可初步判断为“蚕豆病”患者。
结束语本试剂系采用双底物(G6P和6PG)，以生化分析仪的样品速率空白法或速率B法测定G6PD的活性(此法不受G6PD的活性干扰，检测出真正的G6PD的活性)。目前国内未见有测定一定体积的压积红细胞G6PD活性的试剂报导及试剂产品的销售，因此，该试剂制备方法的提出具有前瞻性。
权利要求
1.一种葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)测定试剂的制造方法，它包括蒸馏水试剂(3)，其特征是由试剂(1)和试剂(2)组成(一)试剂(1)的组成及重量百分比如下氯化镁(MgCl2) 0.2％～2.0％乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 0.02％～0.2％氧化型辅酶II(NADP+) 0.02％～0.2％六磷酸葡萄糖酸三钠(GPG) 0.01％～0.1％三羟甲基氨基甲烷(Tris) 1.5％～2.0％盐酸(HCl)0.8％2.0％乳化剂(OP) 0.2％～0.5％蒸馏水(H2O) 97.25％～93％(二)试剂(2)的组成及重量百分比如下氯化镁(MgCl2) 0.2％～2.0％乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 0.02％～0.2％氧化型辅酶II(NADP+) 0.02％～0.2％葡萄糖六磷酸二钠(G6P)0.2％～0.5％三羟甲基氨基甲烷(Tris) 1.5％～2.0％盐酸(HCl)0.8％～2.0％乳化剂(OP) 0.2％～0.5％蒸馏水(H2O) 97.06％～92.6％(三)配制的工艺过程如下配制试剂(1)在洁净的玻璃容器中首先加入已称量的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入称量的电解质氯化镁(MgCl2)，加入称量的络合剂(EDTA)，继续加入称量的氧化型辅酶II(NADP)，加入称量的六磷酸葡萄糖酸三钠(6PG)，再加入盐酸(HCl)溶液，使调节PH到一定值，然后搅拌过滤，再加入蒸馏水到一定容量；配制试剂(2)配制试剂(2)与配制试剂(1)的工艺过程相同，只是不加入六磷酸葡萄糖酸三钠(6PG)，而加入葡萄糖六磷酸二钠(G6P)，最后加入蒸馏水到一定容量。配制试剂(3)在洁净的玻璃容器中装入制成的蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的一种葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)测定试剂的制造方法，其特征是将试剂(1)灌装45ml×1瓶备用；将试剂(2)灌装7ml×1瓶备用；将试剂(3)蒸馏水灌装125ml×2瓶备用。
3.根据权利要求1或2所述的一种葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)测定试剂的制造方法，其特征是配制试剂过程均在无菌车间里进行；试剂(1)、试剂(2)和试剂(3)均为无色透明液体。
全文摘要
本发明是一种葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)测定试剂的制造方法，属生物化学、检验试剂领域，本发明它直接用压积红细胞测定酶的活性，不受患者贫血程度的影响，排除患者本身的6PGD的干扰，提高G6PD杂合子的检出率。试剂液体状态在2～8℃下贮存，质量稳定。测定吸样后10分钟出结果，随到随做。它包括蒸馏水3，其特征是由试剂1和试剂2组成，试剂1包含氯化镁0.2～2.0％；乙二胺四乙酸二钠0.02～0.2％；氧化型辅酶II 0.02～0.2％；六磷酸葡萄糖酸三钠0.01～0.1％；三羟甲基氨基甲烷1.5～2.0％；盐酸0.8～2.0％；乳化剂0.2～0.5％；蒸馏水97.25～93％；试剂2不含六磷酸葡萄糖酸二钠，而含有葡萄糖六磷酸二钠0.2～0.5％。试剂均为无色透明液体，灌装成单瓶使用。
文档编号C12Q1/32GK1858239SQ200610034659
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日
发明者黄文东, 邱河, 许庆春 申请人:黄文东