生物发光微生物数量抗干扰快速检测试剂盒的制作方法

专利名称：生物发光微生物数量抗干扰快速检测试剂盒的制作方法
专利说明生物发光微生物数量抗干扰快速检测试剂盒 本发明涉及一种利用ATP生物发光法进行微生物数量快速检测的方法及检测试剂盒，属生物技术领域。生物发光法检测微生物细胞数量具有快速简单的优点，整个过程仅为十几分钟，而常规的细菌、酵母和霉菌总数测定采用平板培养计数法，从开始培养到肉眼可见的菌落需要几天，因此在微生物数量快速检测方面具有很强的优势。通过ATP生物发光法进行的微生物数量测定技术由于不需要培养过程，具有较高的灵敏度，可用于工厂在生产过程进行微生物总数的在线检测，为产品的质量控制提供快速检测手段。目前国外少数发达国家已有灵敏的生物发光仪和很高纯度的检测试剂盒，然而不论高灵敏度的发光检测仪还是高纯度的发光检测试剂，其价格都非常之高，简单的仪器一般为5～10万元/台，稍好的其价格达到10～40万元/台，与仪器配套的试剂盒价格为30～50元/次，这对于我国的情况来说，检测成本太高，因此在国内完全未得到应用。要实现ATP生物发光法在我国的大规模应用，必须解决仪器和发光试剂两大核心问题，本研究近年来一直致力于生物发光检测技术和生物发光检测仪器的研究与开发，目前生物发光检测仪已研制出样机，因此构建生物发光检测试剂盒和建立程序化的检测技术对于推广应用显得特别重要。本发明的目的在于构建高灵敏度的ATP生物发光检测试剂盒，建立标准化的细菌、酵母、霉菌及饮用水中微生物及藻类细胞数量的检测技术，实现微生物总数的快速检测，为卫生监督和食品生产质量控制提供关键技术。
本发明提供了一种利用生物发光法快速检测微生物数量的快速检测试剂盒，该检测试剂盒包括荧光素酶及其保护剂、D-荧光素、标准ATP、发光检测缓冲液、非细胞ATP去除剂、微生物细胞ATP抽提剂等试剂。(1)荧光素酶须经纯化，活力本底比达到50～500，活力要求在0.5mL发光检测系统中加入0.1mL 1×10-7mol/L ATP的发光脉冲值CP6S不低于7000，活力检测在0.5mL发光检测系统中加0.1mL荧光素酶、0.1mL 1×10-7mol/L ATP和0.3mL 25mmol/L pH7.8的发光检测缓冲液进行，本底以无菌超纯水代替标准ATP在0.5mL发光检测系统中进行。(2)酶保护剂采用海藻糖、PEG6000和BSA的混合系统，含10～100mg/L海藻糖、5～100mg/L PEG、1～20mg/L BSA。酶液与酶保护剂按10∶1比例混合。(3)发光检测缓冲液(简称GB)可采用甘氨酰甘氨酸、Tricine、Tris、Glycine amide、Phosphate、MOPS、TES等缓冲盐中的一种配制成浓度为25mmol/L、pH7.2的缓冲液，优选甘氨酰甘氨酸，将其配制为含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2的缓冲液。(4)D-荧光素的发光活力须达到相当于Sigma L9504的水平。(5)非目的细胞ATP去除剂AE用含有50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgSO4，1mmol/LEDTA，1mg/mL BSA，pH6.8的缓冲液配制焦磷酸酶至浓度为0.1～10mg/mL。(6)微生物细胞ATP释放剂Ec含1～30g/L TritonX-100、0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵(CTAB)、0.1～3.0g/L二甲亚砜(DMSO)、0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.01～0.1g/L硫酸镁(MgSO4)。
本发明检测试剂盒可预先按比例取荧光素酶100mL，加入酶保护剂10mL、含50～150mgD-荧光素的发光检测缓冲液(含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2)10mL，得到120mL的ATP生物发光试剂，用棕色瓶装。
为提高该生物发光试剂盒的抗干扰能力，还可以增加抗干扰培养基。抗干扰培养基包括抗防腐剂型、抗消毒剂型及抗臭氧型液体大样检测培养基，它们可分别消除防腐剂山梨酸及山梨酸钾、苯甲酸及苯甲酸钠，消毒剂二氧化氯、过氧乙酸、次氯酸钠和过氧化氢以及臭氧和余氯的干扰，在检测含有干扰的样品时，与普通液体培养基相比，可大大提高检测的灵敏度，具体用法见表1。
表1 抗干扰微生物液体培养基可以消除的干扰物质及其浓度
应用该检测试剂盒进行微生物数量快速测定的标准方法是通过在选定的生物发光仪和选定的系统中做ATP标准曲线，取对数后得到线性回归方程，将经过非目的ATP去除和微生物ATP抽提的样品液，在同样的仪器和系统中用同一批酶进行ATP生物发光检测，同时做空白对照，得到样品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的净相对发光值取对数后，通过建立的回归方程得到样品的ATP浓度，根据细菌、酵母、霉菌和单细胞微藻等微生物的ATP含量可换算成细菌、酵母、霉菌孢子或单细胞微藻的细胞数，或只计相当于细菌数量。如同一样品中既有细菌、酵母、霉菌或微藻且须分别计量时，则须有一个依细胞大小分级过滤的过程。
应用该检测试剂盒建立微生物数量快速检测程序化的具体方法为1.标准ATP曲线的制作在生物发光仪0.5mL检测系统中，用ATP生物发光试剂盒进行10-12～10-6mol/L系列标准ATP浓度发光检测，并做出对数曲线和线性回归方程。检测系统为0.1mL荧光素酶(FL)+0.1mL ATP+0.3mL发光检测缓冲液，在发光仪上进行系列标准ATP和用无菌水代替不加ATP的空白的发光脉冲值(CP6S或CPM值测量)，去除空白值的净相对发光值(ΔCP6S或ΔCPM)在双对数坐标上做折线图、趋势线和回归方程。
2.样品的预处理样品的预处理包括非目标ATP的去除，微生物细胞的分级过滤，样品中干扰成份的去除，样品稀释或浓缩到适合ATP生物发光法的检测范围等，依样品的形态、性质和内含物及检测目标进行相应处理。非目标ATP的去除联合采用微孔滤膜和ATP去除剂的办法，可以节省试剂。微生物细胞的分级过滤依样品所含杂质情况，先采用20μm大孔经微孔滤膜去除杂质，然后在真空条件下通过8μm、3μm、0.45μm和0.22μm的无菌微孔滤膜过滤。样品中干扰成份的去除可通过离心加无菌超纯水洗涤方法或用微孔滤膜过滤的办法进行。对于含有防腐剂、消毒剂或臭氧的食品、饮料等样品，需要较高的检测灵敏度的时候可用与抗干扰培养基进行预孵育以提高抗干扰能力和检测灵敏度。样品稀释或浓缩可用无菌超纯水稀释，浓缩可通过8000～12000r/min离心方法进行，亦可用微孔滤膜分级过滤的办法。
3.微生物细胞ATP的抽提将经过预处理的样品用微生物细胞ATP抽提剂Ec进行ATP的提取，具体过程为Ec与液体样品按1∶1比例加入后，室温作用1.5～2.0min；滤膜上微生物细胞ATP提取则加入1～2ml Ec，室温作用1.5～2.0min即可。其中ATP抽提剂Ec的制备方法为每升无菌超纯水中加入1～30g TritonX-100、0.1～5.0g CTAB、0.1～3.0g DMSO、0.01～0.1g EDTA、0.01～0.1g MgSO4，加热使其溶解，振匀即成。
4.ATP生物发光测试取0.1mL ATP提取液，加入含0.3mL发光检测缓冲液的发光管中，摇匀，加入ATP生物发光试剂0.1ml，摇匀后立即置发光检测仪中进行发光检测，读取发光脉冲计数值CP6S或CPM，同时进行空白样品的对照测试。其中发光检测缓冲液(GB)含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2。ATP生物发光试剂按比例取荧光素酶100mL，加入酶保护剂10mL、含100mg D-荧光素的发光检测缓冲液10mL，得到120mL的ATP生物发光试剂。
5.样品中相应微生物细胞ATP含量的计算ATP生物发光测试后的样品发光值去除空白后的净相对发光值取对数后，通过回归方程(lg[ATP]＝A+Blg(ΔCP6S)或lg[ATP]＝A+Blg(ΔCPM)，相关性R大于0.98为好，其中A和B为回归方程的系数)，计算样品中相应的ATP浓度。
6.样品中细菌、酵母、霉菌和单细胞藻类数量或以细菌计的微生物总数的计算根据本发明前期研究结果，细菌细胞的ATP含量为3×10-16g/cell；酵母菌的ATP含量为3×10-14g/cel；霉菌孢子的平均ATP含量为3×10-15g/cell；单细胞藻的ATP含量为3×10-14g/cell换算成细菌、酵母、霉菌和单细胞藻类的细胞数，或只计相当于细菌的总数量。
注式中505为ATP的分子量。

图1在上海上立生物发光仪SHG-C和广东环凯微生物科技公司研制的发光仪HKM-NRD(1)机上0.5mL系统中，检测系统为0.1mL生物发光试剂(FL)+0.1mL标准ATP+0.3mL发光检测缓冲液(GB)。横坐标为所加标准ATP浓度(在10-12～10-6mol/L范围)的Lg[ATP]，纵坐标为对应的相对发光值的LgΔCP6S1。实施例1生物发光法快速检测试剂盒的构建(发光试剂为FL04113)(1)试剂的预先配制荧光素酶保护剂取500mg海藻糖、500mg PEG6000及15mg BSA，溶解于10mL无菌蒸馏水中，摇匀后通过0.22μm的无菌微孔滤膜过滤除菌即可。
标准ATP溶液采用Sigma公司的二钠盐A-2383 55.1mg，溶解于10mL无菌馏水中，配成浓度为1×10-2mol/L，用1.5ml无菌离心管装，每管0.1ml。
非细胞ATP去除剂AP其具体成份和制作过程是用含50mmol/L Tris-HCl，10mmol/LMgS04，1mmol/L EDTA，1mg/mL BSA，pH6.8的缓冲液配制焦磷酸酶至浓度为5mg/ml，并通过0.22μm的无菌微孔滤膜过滤。
微生物细胞ATP提取液Ec每升无菌超纯水中加入20g TritonX-100、2.0g CTAB、2.0gDMSO、0.05g EDTA、0.05g MgSO4，加热使其溶解，振匀即成。
发光检测缓冲液(简称GB)含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/LDTT，pH7.2。
(2)生物发光试剂(FL04113)的配制取纯化的荧光素酶100mL，加入酶保护剂10mL、含100mg D-荧光素的发光检测缓冲液10mL，得到120mL溶液，分装到60个小的棕色瓶中，每瓶2mL，冻干。
(3)生物发光法快速检测试剂盒的构建该检测试剂盒包括生物发光试剂(FL04113)4瓶，每瓶2mL；0.1mL浓度为1×10-2mol/L的标准ATP溶液10管；无菌蒸馏水4瓶，每瓶25mL；发光检测缓冲液4瓶，每瓶20mL；1瓶20mL微生物细胞ATP提取液Ec；1个棕色瓶装非细胞ATP去除剂AP 5mL。
该试剂盒用于实施例2～6的检测。
实施例2FL04113 ATP生物发光标准ATP曲线在上海上立生物发光仪SHG-C和广东凯微生物科技公司研制的发光仪HKM-NRD(1)机上0.5mL系统中，检测标准浓度范围在10-12～10-6mol/L的ATP发光值，检测系统为0.1mL FL+0.1mL标准ATP+0.3mL GB，并做出对数曲线和线性回归方程，结果见表1和附图1。
从表1可见在SHG-C发光仪上进行发光检测，当ATP浓度在10-10～10-6mol/L时线性较好，在0.5mL发光系统中的回归曲线为Lg[ATP]＝-12.4792+1.0374LgΔCPM，R＝0.9977，n＝5；在HKM-NRD(I)发光仪上，当ATP浓度在10-10～10-6mol/L时线性较好，回归曲线为Lg[ATP]＝-10.8382+0.9547LgΔCP6S1，R＝0.9951，n＝5。两台仪器上的检测灵敏度均为10-10mol/L。
表1 FL041130在SHG-C和HKM-NRD(I)机上检测的ATP的发光值
实施例3酵母人工样品的发光检测(SHG-C)(1)在SHG-C上的发光检测在0.5mL系统中于SHG-C上进行酿酒酵母样品检测，人工酵母样平板培养结果为1.44×107cfu/mL(原液简为Y0)，检测系统0.1mL FL+0.1mL标准ATP或H2O样+0.3mL GB，发光检测结果见表2。
表2 酵母人工样品在SHG-C上发光检测结果
注酵母菌含ATP量按3×10-14g/cell计。标准ATP采用1×10-7mol/L。
结果表明当酵母菌样的浓度在103cells/m～107cells/mL时，用ATP生物发光法检测较能反应出真实的水平。
(2)在HKM-NRD(1)机上的发光检测在0.5ml系统中于广东环凯HKM-NRD(1)机上上进行酿酒酵母人工样品检测，人工酵母样平板培养结果为1.44×107cfu/mL(原液简为Y0)，检测系统0.1mL FL+0.1mLATP或H2O样+0.3mL GB，发光检测结果见表3。
表3 酵母人工样品在HKM-NRD(1)机上发光检测结果
注酵母菌含ATP量按3×10-14g/cell计。
结果表明两台仪器的检测结果比较接近，当酵母菌样的浓度在103cells/m～107cells/mL时，用ATP生物发光法检测较能反应出真实的水平。
实施例4细菌人工样品的发光检测(SHG-C)在0.5ml系统中于SHG-C上进行酿酒酵母样品检测，人工细菌样品ATCC25922平板培养结果为6.4×108cfu/mL(原液简为Y0)，检测系统0.1mL FL+0.1mLATP或H2O样+0.3mLGB，发光检测结果见表4。
表4 细菌人工样品在SHG-C上发光检测结果
注细菌的平均ATP含量为3×10-16g/cell，标准ATP采用1×10-7mol/L。
结果表明用ATP生物发光法检测微生物数量时，速度很快，具体的检测过程只需十几分钟，通过标准回归方程和细菌的ATP含量换算关系，可以得出细胞数，在细菌细胞数为104cells/mL~108cells/mL，较能反应出真实的水平。
实施例5霉菌人工样品的ATP发光检测在0.5mL系统中于SHG-C上进行霉菌MIG3.95孢子人工样品检测，MIG3.95孢子数显微计数值为9.45×107cfu/mL(原液简称M0)，检测系统0.1mL FL+0.1mLATP或H2O样+0.3mL GB，ATP发光检测结果见表4。
表5 霉菌人工样品的ATP发光测试结果
注霉菌孢子的平均ATP含量按3×10-16g/cell计算，标准ATP采用1×10-7mol/L。
结果表明用ATP生物发光法检测霉菌孢子数时，当孢子数在103～108cells/mL之间ATP生物发光法换算的结果和显微镜计数结果差异不算大。
实施例6；瓶装饮用水微生物数量的生物发光测定1、水样1#天然泉水厂储水池水、2#5加仑天然饮用泉水、3#5加仑饮用净水、4#矿泉水水处理过锰沙前水(1#～4#样品均由怀疑产品有藻类污染的瓶装饮用水厂家提供)、5#水库水、6#天台水池水。
2、水样预处理参照常规取样方法取饮用水样100～1000mL(根据样品的洁净程度而定)，振摇使样品分散均匀，然后抽真空分别通过8μm、3μm及0.45μm经灭菌处理的微孔滤膜，并分别用50mL无菌去离子水洗涤过滤漏斗和微孔滤膜。
3.样品ATP的提取滤膜截留细胞ATP的提取将抽滤样品后的各种滤膜取下，分别置于50mL无菌小烧杯中，加入1mL无菌超纯水，再加入1mL细胞ATP抽提液Ec，用枪头轻轻吸打，作用1.5min。分别取1mL不同浓度的ATP标准品取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；空白微孔滤膜做同样处理作为空白样。
4.发光测试在0.5ml系统中于SHG-C上进行ATP生物发光测试。吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入0.3mL发光检测缓冲液中，再加入0.1mL配制好的生物发光试剂(FL04113)，立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数。同时作1×10-7mol/L ATP标准品和空白样的发光检测。
5.样品中ATP浓度计算依测试样品的净相对发光值ΔCP6S，根据回归方程计算样品的ATP浓度。
6.样品中相应微生物细胞数计算在分级过滤的滤膜上截留的不同微生物细胞内ATP含量后，根据不同细胞的ATP含量转化为相应的细胞数。
7.实验结果采用8μm、3μm和0.45μm的滤膜对饮用水样品进行分级过滤，检测滤膜截留ATP量换算成样品中的微藻细胞数及细菌数(表5)。结果表明，样品中的微藻主要由8μm的滤膜截留，3μm和0.45μm的滤膜截留的主要是细菌。从表5的检测结果看，样品在污染藻类的同时，亦污染了细菌和真菌，提示水处理工艺或包装材料的清洗消毒不完善。由于饮用水样品中存在的对发光检测造成干扰的物质较少，用滤膜截留微生物细胞发光检测结果与平板计数法较为相近，因此可以达到快速检测饮用水中污染的微生物的目的，有利于生产现场监控和产品分析。
表6 滤膜法截留饮用水中微藻和细菌分级检测结果
注表中A表示换算成微藻细胞的数量，B表示换算成细菌的数量。
权利要求
1.一种微生物数量的生物发光法抗干扰快速检测试剂盒，其特征在于包括荧光素酶及其保护剂、D-荧光素、标准ATP、发光检测缓冲液、非细胞ATP去除剂、微生物细胞ATP抽提剂。
2.一种微生物数量生物发光快速检测试剂盒，其特征在于按比例取荧光素酶100mL，加酶保护剂10mL、含50～150mg D-荧光素的发光检测缓冲液10mL，预先混合配制成ATP生物发光试剂。
3.权利要求1或2所述的一种微生物数量生物发光快速检测试剂盒，其中荧光素酶须经过纯化，活力本底比达到50～500，在1mL发光检测系统中加入0.1mL 1×10-7mol/L ATP的发光脉冲值CP6S不低于7000。
4.权利要求1或2所述的微生物数量生物发光快速检测试剂盒，其中D-荧光素的发光活力须达到相当于Sigma L9504的水平。
5.权利要求1或2所述的生物发光法快速检测试剂盒，其中荧光素酶保护剂含50～75％海藻糖、10～15％ PEG6000和10～15％的BSA。
6.权利要求1或2所述的生物发光法快速检测试剂盒，所用发光检测缓冲液采用甘氨酰甘氨酸、Tricine、Tris、Glycine amide、Phosphate、MOPS、TES等缓冲盐中的一种配制成浓度为25mmol/L、pH7.2的缓冲液。
7.权利要求6所述的生物发光法快速检测试剂盒，所用发光检测缓冲液含25mmol/L甘氨酰甘氨酸、0.5mg/mL BSA、0.5mmol/L EDTA、0.5mmol/L DTT、pH7.2。
8.权利要求1所述的生物发光法快速检测试剂盒，非细胞ATP去除剂的配制方法为将含有50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mg/ml BSA、pH6.8的缓冲液配制焦磷酸酶至浓度为0.1～10mg/mL。
9.权利要求1所述的生物发光法快速检测试剂盒，微生物细胞ATP去除剂含1～30g/LTritonX-100、0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵、0.1～3.0g/L二甲亚砜、0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸、0.01～0.1g/L硫酸镁。
10.权利要求1或2所述的一种微生物数量生物发光快速检测试剂盒，其特征在于还含有抗防腐剂型、抗消毒剂型或抗臭氧型液体大样检测培养基中的一种或几种抗干扰培养基。
11.利用权利要求1或2所述的生物发光法快速检测试剂盒进行快速检测的方法，按下述步骤进行(1)标准ATP曲线的制作在生物发光仪0.5mL系统中，进行10-12～10-6mol/L系列标准ATP浓度发光检测，并做出对数曲线和线性回归方程Lg[ATP]＝A+BLgΔCP6S或lg[ATP]＝A+Blg(ΔCPM)，其中A和B为回归方程的系数；(2)样品的预处理依样品的形态、性质和内含物及检测目标进行相应样品预处理包括非目标ATP的去除、微生物细胞的分级过滤、样品中干扰成份的去除、最后将样品稀释或浓缩到适合ATP生物发光法的检测范围等；(3)微生物细胞ATP的抽提将经过预处理的样品用微生物细胞ATP抽提剂Ec进行ATP的提取，具体过程为Ec与液体样品按1∶1比例加入后，室温作用1.5～2.0min；滤膜上微生物细胞ATP提取则是将抽滤样品后的各种滤膜取下，分别置于50mL无菌小烧杯中，加入1～2mL细胞ATP抽提液Ec，室温作用1.5～2.0min；(4)ATP生物发光测试取0.1mL ATP提取液，加入含0.3mL发光检测缓冲液的发光管中摇匀，再加入生物发光试剂0.1mL，摇匀后立即置发光检测仪中进行发光检测，读取发光脉冲计数值CP6S或CPM，同时进行1mL无菌去离子水空白样品的对照测试。(5)样品中相应微生物细胞ATP含量的计算ATP生物发光测试后的样品发光值去除空白后的净相对发光值取对数后，通过标准曲线回归方程，计算样品中相应的ATP浓度。(6)样品中细菌、酵母、霉菌和单细胞藻类数量或以细菌计的微生物总数的计算
全文摘要
本发明涉及一种利用ATP生物发光法进行微生物数量快速检测的方法及检测试剂盒，快速检测试剂盒包括荧光素酶及其保护剂、D－荧光素、标准ATP、发光检测缓冲液、非细胞ATP去除剂、微生物细胞ATP抽提剂等试剂。应用该检测试剂盒进行微生物数量快速测定的标准方法是通过在选定的生物发光仪和选定的系统中做ATP标准曲线，取对数后得到线性回归方程，将经过非目的ATP去除和微生物ATP抽提的样品液，在同样的仪器和系统中用同一批酶进行ATP生物发光检测，同时做空白对照，得到样品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的净相对发光值取对数后，通过建立的回归方程得到样品的ATP浓度，根据细菌、酵母、霉菌和单细胞微藻等微生物的ATP含量可换算成细菌、酵母、霉菌孢子或单细胞微藻的细胞数，或只计相当于细菌数量。
文档编号C12Q1/25GK1876829SQ20061003438
公开日2006年12月13日 申请日期2006年3月17日 优先权日2006年3月17日
发明者吴清平, 吴慧清, 张菊梅, 李程思 申请人:广东省微生物研究所, 广东环凯微生物科技有限公司