专利名称：一种香港海鸥型菌快速检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及淡水鱼肠道中的病原菌的检测试剂盒及检测方法，主要适用于淡水鱼产品中香港海鸥型菌的快速检测。
背景技术：
香港海鸥型菌属原核细菌(Proteobacteria)β亚纲，奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)，学名为香港海鸥型菌(Laribacter.hongkongensis)，有关该菌的报道最先发表于2001年，由港大医学院微生物学系袁国勇教授和胡钊逸副教授等在一名因高烧和呼吸短促入院的肝硬化病人的血液和胸腔浓汁中首先分离得到。经过一系列生物化学分析和分子生物学检测表明该菌表型特征和基因型特征与目前所有已知细菌均存在差异，属新发现细菌菌属，最初将之命名为HKU1。随着对该菌的进一步研究深入，又相继在多名香港腹泄病人的粪便中分离到该菌的不同菌株，加之其形态上的特殊性而被命名为香港海鸥型菌。
相关研究表明香港海鸥型菌只存在淡水鱼中，在其它肉类食品未被发现有该菌的存在。约有25％的淡水鱼中存在香港海鸥型菌，其中含该菌最多的是草鱼和鳙鱼。怀疑人是由于食入未经煮熟的鱼肉或是被交叉污染的食物而被感染，导致可以在血液或粪便中被分离出来。目前该菌在香港、中国内地、日本、瑞士、非洲及中美洲相继被发现，显示病菌已于全球广泛存在。随着各大传播媒体的报道，香港海鸥型菌的发现及研究现状引起人们极大的关注，有关人士认为该菌是水产品质量安全出现的新情况新问题，需要引起重视，对其进行密切监控成为当前一大主要工作。我省作为水产品出口大省，缺少该菌相关基础性数据，在水产品贸易中处于极其不利的地位。目前，关于香港海鸥型菌的检测方法还不成熟，方法不统一，也给监管带来一定的困难，因此，研究该菌的检测方法及时提供快速的检测方法，提高水产品质量安全性。
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)PCR技术是一项体外基因扩增技术，可将目标检测基因片段在短时间内基因扩增放大几百万倍，从而可以使得检测目标很容易被检测出来，该项技术现已应用于分子生物学、生物工程、医学、法医学和农学等领域。传统的致病菌检测首先经过长时间的培养，费时费力，应用PCR技术则非常迅速、准确。检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒(乙肝)，细菌(如结核、厌氧菌)和原虫(如梅毒螺旋体)等来说尤为适用。检测范围包括细菌、病毒(SARS及禽流感病毒H5N1等)、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。
发明内容
目前认识到的香港海鸥型菌有不同的种，但其16s RNA具有保守性，可作为检测的依据，根据该菌的16s RNA保守片段设计引物，用链式聚合酶反应(Polymerases Chain Reaction，PCR)方法在生物体外对该菌特有片段进行扩增，PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上可显示特异谱带，以此达到对香港海鸥型菌定性鉴定的要求。
本发明的目的是利用香港海鸥型菌的保守片段序列设计的一对引物，建立香港海鸥型菌PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供香港海鸥型菌的检测试剂盒。
本发明的香港海鸥型菌检测试剂盒，包括以下部件(1)裂解液1瓶，内含8～12mol/L Tris-HCl，1～3mmol/L EDTA，0.1～0.5％SDS，PH7.5～8.5。
(2)醋酸钾溶液1瓶，内含2～3mol/L醋酸钾溶液；(3)TE缓冲液1瓶，内含50mM EDTA，0.1～0.5mol/L pH7.0的Tris-HCl缓冲液；(4)PCR反应液1管，内含8～15％蔗糖、0.1～0.3mM甲酚红、1～3unit Taq酶、100～200μM dNTP、含Mg2+的10×缓冲液、0.2μM引物；(5)阳性对照液1管，内含较高浓度的香港海鸥菌总DNA；(6)盒子。
所述香港海鸥型菌检测试剂盒中所述的一对引物是根据该菌16s RNA保守片段序列设计的，其DNA序列分别如下上游引物序列为GAGTGGCGAACGGGTGAGTA下游引物序列为TGTCTCCCAGCGATTCGGCG所述的裂解液主要是提供细菌细胞壁破裂的环境减少杂质的产生；醋酸钾溶液则是用于沉降SDS及蛋白质结合的大片段；TE缓冲液是用于保存提取获得的DNA提取液一个稳定的pH值体系，保持DNA的活性不受损害。
所述的PCR反应液中的蔗糖是作为Taq酶的保护剂，上样稳定剂；甲酚红仅作为电泳点样指示剂，而又不影响PCR反应进行；Taq酶起到DNA链延伸的作用；dNTP是新DNA合成需要的碱基；含Mg2+的缓冲液主要是提供PCR反应缓冲体系及所需要的离子强度，该缓冲液含有2～3mM KCl、0.1～1mM Tris-HCl(pH8.4)、0.1～0.5mMMgCl2所述的阳性对照液具有海鸥菌的总DNA浓度达500ng以上，加入到上述PCR管后可直接在PCR仪反应，反应产物可作为电泳样品的阳性对照。并用适宜pH值的缓冲液保存，室温保存可达15天，4℃可保存半年，-20℃可保存1年。
本发明的另一个目的是公开使用上述试剂盒快速检测香港海鸥型菌方法，按下列步骤进行a.样品的预处理取样品适量，按料水比1∶4加入无菌水，充分振荡悬浮，离心，弃去上清夜；b.在沉淀物中加入0.5～1ml裂解液，充分悬浮沉淀，精确沸水浴2～5min；c.加入200μl醋酸钾溶液漩涡振荡，冰浴2min，12000r/min离心5～10min；d.上清液转移至载有500μl异丙醇的离心管，振荡充分混合，以12000r/min的速度离心3～5min，弃去上清液；e.加入0.5ml70％乙醇，振荡30s，12000r/min离心3～5min，吸去上清液，室温干燥5min，加入20～50μl TE缓冲液漩涡振荡，得样品PCR模板。
f.PCR反应将PCR反应液加入到中反应管，再分别取模板和阳性对照液，将已载样的反应管置于PCR仪上，反应管的管数等于样品数n加上阳性对照数；g.按下列条件进行扩增94℃3～5min预变性→94℃变性30～50s→57℃复性50s→72℃延伸1min→(第二步至第四步25～35个循环)→72℃延伸5～10min→4℃保存h.反应结束后取上述PCR产物5～10μl直接点样于浓度为1～1.5％琼脂糖凝胶上，以100V电泳约30min-60min；
i.将胶片浸于EB染色液或EB代用品染色15～30min，在紫外灯下观察，若在与阳性对照同位置的1200bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，，否则为阴性。
所述的步骤a样品预处理的具体步骤为取0.5～2g样品于经灭菌5mLEppendorf管。用剪刀将管中组织剪至均匀，加入2mL无菌水，充分振荡悬浮，于离心机3000r/min离心3min，取上清液1mL转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，12000r/min离心5-10min，去上清。
本发明公开的检测试剂盒包含了目标菌的特殊引物、上样染色液及反应稳定剂和PCR反应的所有必需其它特定最适浓度的试剂成分，使用者只需将样品总基因提取液加入便可进行PCR反应，然后直接进行电泳，无需与上样混合液再进行点样。简化了实验步骤，提高检测限的目的，为检测部门及科研单位相关研究提高便利。
图1是香港海鸥原菌不同浓度的菌液的检测结果。
图2是淡水鱼肠混入香港海鸥型菌样品检测结果。
图3是罗非鱼鱼肠道样品检测结果。
具体实施例实施例1香港海鸥型菌的检测试剂盒(1)裂解液1瓶50mL，内含10mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.1％SDS，PH8.0；(2)醋酸钾溶液1瓶20mL，内含2.5mol/L醋酸钾溶液；(3)TE缓冲液1瓶10mL，内含50mM EDTA，0.1mol/L pH7.0的Tris-HCl缓冲液；(4)PCR反应液1管500uL，内含12％蔗糖、0.2mM甲酚红、2unit Taq酶、200μM dNTP、含Mg2+的10×缓冲液、0.2μM引物；(5)阳性对照液1管1mL，内含500ng以上的香港海鸥菌总DNA该试剂盒中的PCR反应引物的DNA序列如下上游引物GAGTGGCGAACGGGTGAGTA下游引物TGTCTCCCAGCGATTCGGCG含Mg2+的10×缓冲液2.5mM KCl、0.5mM Tris-HCl(pH8.4)、0.1mM MgCl2取PCR扩增反应液体系 20ul实施例2香港海鸥型菌的检测试剂盒(1)裂解液1瓶100mL，内含12mol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，0.3％SDS，PH8.0(2)醋酸钾溶液1瓶40mL，内含3mol/L醋酸钾溶液；(3)TE缓冲液1瓶20mL，内含50mM EDTA，0.3mol/L pH7.0的Tris-HCl缓冲液；(4)PCR反应液1管1000uL，内含15％蔗糖、0.3mM甲酚红、3unit Taq酶、150μM dNTP、含Mg2+的10×缓冲液、0.2μM引物；(5)阳性对照液1管，1mL，内含香港海鸥菌总DNA该试剂盒中的一对引物的DNA序列如下上游引物GAGTGGCGAACGGGTGAGTA下游引物TGTCTCCCAGCGATTCGGCG含Mg2+的10×缓冲液3mM KCl、1mM Tris-HCl(pH8.4)、0.3mM MgCl2取PCR扩增反应液体系 8ul实施例3罗非鱼肠道中的香港海鸥型菌的检测使用实例1试剂盒或实例2试剂盒，按下列步骤进行a.将罗非鱼处死后，置于解剖盘上，用75％酒精棉球消毒体表，用手术刀及剪刀配合将鱼肠完整取出，小心处理避免肠道破裂，导致肠道内含物遗漏造成污染。用摄子去除附着在肠上的脂肪。无菌条件下解剖取1g样品于经灭菌5mLEppendorf管。用剪刀将管中组织剪至均匀，加入2mL无菌水，充分振荡悬浮，于离心机3000r/min离心3min，取上清液1mL转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，12000r/min离心5min，去上清；b.在沉淀物中加入0.8ml裂解液，充分悬浮沉淀，精确沸水浴3min；c.加入200μl醋酸钾溶液漩涡振荡，冰浴2min，12000r/min离心5min；d.上清液转移至载有500μl异丙醇的离心管，振荡充分混合，以12000r/min的速度离心3min，弃去上清液；
e.加入0.5ml70％乙醇，振荡30s，12000r/min离心5min，吸去上清液，室温干燥5min，加入50μl TE缓冲液漩涡振荡，得样品PCR模板；f.PCR反应将PCR反应液加入到中反应管，再分别取模板和阳性对照液，将已载样的反应管置于PCR仪上，所述的反应管的管数等于样品数n加上阳性对照数；g.按下列条件进行扩增94℃4min预变性→94℃变性30s→57℃复性50s→72℃延伸1min→(第二步至第四步30个循环)→72℃延伸6min→4℃保存h.反应结束后取上述PCR产物6μl直接点样于浓度为1.5％琼脂糖凝胶上，以100V电泳约60min；i.将胶片浸于EB染色液染色15min，在紫外灯下观察并拍照，在与阳性对照同位置的1200bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，否则为阴性。(见图3)实施例4使用实施例3的检测方法，检测香港海鸥型原菌，不同浓度的菌液(见图1)结果说明1号通道为带鱼肠阳性样品电泳图谱，2号阴性样品电泳图谱，3-7通道为不同浓度菌量DNA提取液PCR产物电泳图谱。8号通道为DNA分子量标记，可见阳性样的被扩增的分子量约1200bp。
实施例5使用实施例3的检测方法，检测淡水鱼肠混入香港学海鸥型菌样品(见图2)结果分析1号通道为阳性对照样品的电泳结果，2号通道为DNA分子量标记，3-6为掺入不同浓度菌液的肠道样品提取液，其浓度从105-102，7-8通道为10-1浓度菌液的检测结果，表明用该方法可以检测到样品中102浓度的菌量。当样品中菌量低于此值时将不被检出。
权利要求
1 一种香港海鸥型菌快速检测试剂盒，其特征是该试剂盒包括以下部件a.裂解液1瓶，内含8-12mmol/L Tris-HCl，1-3mmol/L EDTA，0.1％-0.5％SDS，pH7.5-pH8.5；b.醋酸钾溶液1瓶，内含2-3mol/L醋酸钾溶液；c.TE缓冲液1瓶，内含50mM EDTA，0.1-0.5mol/L pH7.0的Tris-HCl缓冲液；d.PCR反应液1管，内含8-15％蔗糖、0.1-0.3mM甲酚红、1-3unit Taq酶、100-200μM dNTP、含Mg2+的10×缓冲液、0.2μM上下游引物，上游引物序列为GAGTGGCGAACGGGTGAGTA下游引物序列为TGTCTCCCAGCGATTCGGCG；e.阳性对照液1管，内含较高浓度的香港海鸥菌总DNA；f.盒子。
2 根据权利要求1所述的香港海鸥型菌快速检测试剂盒，其特征在于所述的含Mg2+的10×缓冲液包含2-3mM KCL、0.1-1mM Tris-HCl、0.1-0.5mM MgCl2。
3 一种香港海鸥型菌快速检测方法，其特征在于使用权利要求1的试剂盒，按以下步骤进行a.样品的预处理取样品适量，按料水比1∶4加入无菌水，充分振荡悬浮，离心，弃去上清夜；b.在沉淀物中加入0.5-1ml裂解液，充分悬浮沉淀，精确沸水浴2-5min；c.加入200μl醋酸钾溶液漩涡振荡，冰浴2min，12000r/min离心5-10min；d.上清液转移至载有500μl异丙醇的离心管，振荡充分混合，以12000r/min的速度离心3-5min，弃去上清液；e.加入0.5ml 70％乙醇，振荡30s，12000r/min离心3-5min，吸去上清液，室温干燥5min，加入20-50μl TE缓冲液漩涡振荡，得样品PCR模板；f.PCR反应将PCR反应液加入到中反应管，再分别取样品模板和阳性对照液，将已加样的反应管置于PCR仪上；g.按下列条件进行扩增94℃ 3-5min预变性→94℃变性30-50s→57℃复性50s→72℃延伸1min→(第二步至第四步25-35个循环)→72℃延伸5-10min→4℃保存；h.反应结束后取上述PCR产物5-10μl直接点样于浓度为1-1.5％琼脂糖凝胶上，以在TAE缓冲液中100V电泳约30min-60min；i.将胶片浸于EB染色液或EB代用品染色15-30min，在紫外灯下观察，若在与阳性对照同位置的1200bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，否则为阴性。
4 根据权利要求3中所述一种香港海鸥型菌快速检测方法，其特征在于所述步骤a中的样品预处理的具体步骤为取0.5-2g样品于经灭菌5mL Eppendorf管；用剪刀将管中组织剪至均匀，加入2mL无菌水，充分振荡悬浮，于离心机3000r/min离心5-10min，取上清液1mL转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，12000r/min离心5-10min，去上清。
全文摘要
本发明提供一种香港海鸥型菌快速检测试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以香港海鸥型16s RNA保守片段序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，反应产物在琼脂糖电泳上显示特异的谱带。对淡水鱼肠道中的香港海鸥型菌的特异性DNA片断进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于可致人严重肠胃炎的病原菌—香港海鸥型菌的检测，对提高我省淡水产品食用安全性有很大的社会经济效益，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/04GK1858250SQ20061003431
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月15日 优先权日2006年3月15日
发明者杨贤庆, 李来好, 岑剑伟, 郝淑贤, 刁石强, 吴燕燕, 石红, 周婉君, 陈胜军 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所