专利名称：一种人类表皮生长因子受体(egfr)基因外显子20的t790m突变快速检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域。
背景技术：
2004年6月，美国学者Lynch和Paez等首先报道，非小细胞肺癌中表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶编码区基因突变是靶向药物奏效的一个必要前提，已证实对EGFR编码区基因突变型肿瘤，EGFR酪氨酸激酶抑制剂gefitinib(又称Iressa或ZD1839)的有效率高达80％以上，而对无突变的野生型肿瘤上述药物基本无效。再者，经gefitinib疗有效的患者，当EGFR基因编码区出现T790M(2369 C＞T)突变时则药物失效，需要及时更换新的有效抑制剂或应用其它治疗方法。因此，通过检测EGFR基因突变型，可以从晚期肺癌病人中筛选出最适治疗对象进行个体化治疗，从而显著提高药物疗效，节约资源。
本发明的优势PCR技术以其自身巧妙的原理有与众不同的特点，高特异性、高敏感性及简便快捷使其成为基因诊断首选的技术之一。
(1)高特异性，PCR扩增严格遵守碱基配对原则的半保留复制。半保留复制是世界上最严格的复制方式之一，其新合成的子链与模板形成完全互补的镜像结构，从而充分保证了复制的准确性。另外，由于碱基互补原则，只有当引物与目的基因完全互补时，反应体系中的引物才能与模板产生复性，引物的延伸才得以进行，因此引物与模板的互补是复制的最基本条件，这从另一方面规定了PCR反应的高特异性。在生物界中，某种基因总有它最保守的、最具特征性的基因区段，它是某些生物，或某些型、亚型等功能分型所特有的。若能正确地选择这一区域作为扩增的目的基因，联合探针杂交的特异性，便可以充分地保障PCR检测的高度特异性。
(2)高敏感性，在PCR反应中模板DNA以指数级迅速增加，扩增反应前期进入以指数级迅速增加，扩增反应后期进入平台反应期，一般经过30个循环即1-2小时内可以将靶序列增加百万倍以上，可以将微量的目标物(fg DNA)检测出来。过去采用的一些微量检测法，如酶联免疫吸附实验(ELISA)和放射免疫分析(RIA)其灵敏度分别为ng级和pg级，而PCR可达fg级，理论上可以检出病原体的单拷贝基因的存在。
(3)简便快捷，Taq酶的使用使PCR技术可以自动化完成，各种高效PCR仪相续问世使PCR操作可以在基层单位的实验室中顺利完成。在PCR的实际应用中，许多技术得到改进，扩增反应体积减少，多种成分预先混合减少加样步骤，这些简化步骤大多不影响PCR的扩增效果。特别是单管单人份的PCR试剂，使操作者节省时间精力，而且又不易污染，充分满足了临床快速诊断的要求PCR技术对样品要求低，不必严格纯化模板DNA，几乎所有的临床样本都能用于PCR扩增。
(4)经济实用，传统的SNP或点突变检测方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-SSO等，大多涉及电泳、酶切、显色及拍照等后处理，操作费时繁琐，特异性和敏感性较差，不能自动化及高通量检测，也容易造成交叉污染，测序及芯片技术则耗时昂贵。本发明结合了PCR及分子探针的特性，可精确快速检测EGFR基因外显子20的T790M(2369 C＞T)突变，尤其是PCR实时检测技术，可使扩增反应和分子杂交在一个封闭的系统中进行，无须PCR后处理步骤，避免了污染，并能分辨单碱基差异，灵敏度高，操作简便快速，适于大批量样本的检测，整个检测可在2小时完成。我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。现时各大中小医疗机构基本上均配置了荧光PCR仪，本发明具有极广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供一种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子20的T790M突变快速检测方法和试剂盒，其特征采用PCR扩增人类染色体7p12 EGFR基因外显子20的包含T790M(2369 C＞T)突变位点的基因序列，应用分子荧光探针与扩增产物杂交，应用荧光PCR仪实时测量PCR过程中反应液的特征性荧光信号强度变化，或PCR后应用荧光分光光度仪测量反应液的特异荧光强度，进行结果判断。
根据人表皮生长因子受体(EGFR)基因Seq ID NONM_005228的cDNA序列选择引物为可扩增EGFR基因外显子20的包含T790M(2369 C＞T)突变位点的基因序列的一对引物；选择探针为在两引物扩增片段内设计与靶序列互补的两条寡核苷酸探针，5’端分别用FAM或HEX修饰，3’端用氨基修饰并标记DABCYL。其序列为
上游引物F5’CCGCCTGCTGGGCATCTG 3’下游引物R5’GCGATCTGCACACACAGTTGAG 3’.
野生型探针序列Probe-wtFAM-5’-GCGACATCACGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL突变型探针序列Probe-muHEX-5’-GCGACATCATGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL检测T790M(2369 C＞T)突变的试剂盒包括反应混合液；突变型对照；野生型对照；样品提取液；使用说明书。试剂盒突变型对照为T790M(2369 C＞T)突变型DNA序列；野生型对照为T790M(2369 C＞T)野生型DNA序列。试剂盒反应混合液为1×PCR缓冲液(0.1％TritonX-100；2.0～6.0mmol/L MgCl2；8mmol/L(NH4)2SO4；50mmol/L KCl；10mmol/L Tris-HCl(pH8.0))；内含两引物各0.3μmol/L，Probe-wt0.2μmol/L，Probe-mu0.3μmol/L；dNTP各250μmol/L，HotTaq酶1.5U，反应总体积50μl。
本发明保护所设计的引物及探针序列应用于杂交芯片检测人类染色体7p12EGFR基因外显子20的T790M(2369 C＞T)突变。
图1为PCR扩增条件参数；图2为荧光PCR仪检测时可能出现的荧光信号增长曲线形式。
具体实施例方式
本发明试剂盒组成如下反应混合液1×PCR缓冲液(0.1％TritonX-100；2.0～6.0mmol/L MgCl2；8mmol/L(NH4)2SO4；50mmol/L KCl；10mmol/LTris-HCl(pH8.0))；内含两引物各0.3μmol/L，Probe-wt0.2μmol/L，Probe-mu0.3μmol/L；dNTP各250μmol/L，HotTaq酶1.0U，反应总体积50μl。阳性对照为T790M(2369 C＞T)突变型DNA序列；阴性对照为其野生型DNA序列。
样品提取液(1).二甲苯；(2).无水乙醇；(3).1.5％三乙醇胺月桂酸硫酸盐(TLS)；(4).氯仿∶异戊醇(24∶1)；(6).TE(pH8.0)。
野生型探针序列Probe-wtFAM-5’-GCGACATCACGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL突变型探针序列Probe-muHEX-5’-GCGACATCATGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL委托上海申友生物技术有限公司合成。
PCR引物由大连宝生物工程有限公司合成。
上游引物F5’CCGCCTGCTGGGCATCTG 3’下游引物R5’GCGATCTGCACACACAGTTGAG 3’.
HotTaq酶购自大连宝生物工程有限公司。
dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)购自上海生工生物工程公司。
PCR薄壁反应管购自大连宝生物工程有限公司，200μl。
检测步骤(一)组织DNA提取切片脱腊取300mg左右3～5um厚组织切片放入1.5ml的eppendorf管，加1ml二甲苯，涡旋振荡，离心5分钟，弃上清；再重复二甲苯抽提两次。用1ml无水乙醇洗涤沉淀片，涡旋振荡，离心5分钟，弃上清，重复洗涤一次。充分干燥。
充分剪碎或研浆适量组织(300mg左右)，石蜡包埋或切片须常规脱腊，移入5ml的eppendorf管，加入生理盐水200ul，1.5％三乙醇胺月桂基硫酸盐(TLS)200ul，0℃1小时，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)，充分振摇10min，3000r/min 10min，吸出上层水相入新管，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)，充分振摇10min，3000r/min 10min，吸出上层水相，加入等体积冷乙醇，混匀离心离心10000r/min 1min，弃上清，取沉淀，溶于TE(pH8.0)20～30ul即为高纯度DNA，4℃待用。
(二)PCR扩增反应(1)PCR扩增反应混合液取2ul上述DNA提取液作为模板，加入1×PCR缓冲液(0.1％TritonX-100；2.0～6.0mmol/LMgCl2；8mmol/L(NH4)2SO4；50mmol/L KCl；10mmol/LTris-HCl(pH8.0))；内含两引物各0.3μmol/L，Probe-wt0.2μmol/L，Probe-mu0.3μmol/L；dNTP各250μmol/L，HotTaq酶1.0U，反应总体积50μl 。
(2)PCR扩增条件(如图1所示)
(三)结果判定(1)荧光PCR仪的实时检测PCR过程中设定于58℃退火时同时检测FAM及HEX荧光素的特征荧光信号增长，如果仅有FAM荧光素的信号呈特征性指数增长并穿过域值则说明该标本为纯合野生型；如果仅有HEX荧光素的信号呈特征性指数增长并穿过域值则说明该标本为T790M(2369 C＞T)纯合突变型；如果FAM及HEX荧光素的信号均呈特征性指数增长并穿过域值则说明该标本为T790M(2369 C＞T)杂合突变型。(如图2所示)(2)荧光分光光度计检测若没有PCR反应完成后，荧光分光光度计于58℃分别检测反应管FAM及HEX荧光素的荧光强度，分别以阴性及阳性对照的相应荧光强度为对照，将荧光强度高于相应本底荧光强度4倍标准差作为有意义判断。最终判断模板DNA的突变性别。
权利要求
1.一种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子20的T790M突变快速检测方法，其特征采用PCR扩增人类染色体7p12 EGFR基因外显子20的包含T790M(2369 C＞T)突变位点的基因序列，应用分子荧光探针与扩增产物杂交，应用荧光PCR仪实时测量PCR过程中反应液的特征性荧光信号强度变化，或PCR后应用荧光分光光度仪测量反应液的特异荧光强度，进行结果判断。
2.根据权利要求1的一种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子20的T790M突变快速检测方法，其特征在于选择引物为可扩增EGFR基因外显子20的包含T790M(2369 C＞T)突变位点的基因序列的一对引物上游引物F5’CCGCCTGCTGGGCATCTG 3’下游引物R5’GCGATCTGCACACACAGTTGAG 3’。
3.根据权利要求1的一种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子20的T790M突变快速检测方法，其特征在于其检测T790M(2369 C＞T)突变的分子荧光探针在两引物扩增片段内设计与靶序列互补的两条寡核苷酸探针，5’端分别用FAM或HEX修饰，3’端用氨基修饰并标记DABCYL。其序列为野生型探针序列Probe-wtFAM-5’-GCGACATCACGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL突变型探针序列Probe-muHEX-5’-GCGACATCATGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL。
4.根据权利要求1的一种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子20的T790M突变快速检测方法，其特征在于荧光探针PCR检测T790M(2369 C＞T)突变的试剂盒包括反应混合液；突变型对照；野生型对照；样品提取液；使用说明书。
5.根据权利要求1的一种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子20的T790M突变快速检测方法，其特征在于检测T790M(2369 C＞T)突变的试剂盒反应混合液为1×PCR缓冲液(0.1％TritonX-100；2.0～6.0mmol/L MgCl2；8mmol/L(NH4)2SO4；50mmol/L KCl；10mmol/L Tris-HCl(pH8.0))；内含两引物各0.3μmol/L，Probe-wt0.2μmol/L，Probe-mu0.3μmol/L；dNTP各250μmol/L，HotTaq酶1.5U，反应总体积50μl。
6.根据权利要求1的一种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子20的T790M突变快速检测方法，其特征在于所设计探针序列应用于杂交芯片检测人类染色体7p12EGFR基因外显子20的T790M(2369 C＞T)突变。
全文摘要
本发明是一种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子20的T790M突变快速检测方法。属于分子生物学领域。根据人类染色体7p12 EGFR基因外显子20的DNA序列设计一对引物，采用聚合酶链式反应(PCR)技术特异性扩增包含T790M(2369 C＞T)突变位点的一段DNA序列，应用一对分子荧光探针与扩增产物杂交，通过荧光PCR仪实时检测反应管特征性的相应荧光强度变化，或PCR后通过荧光分光光度仪直接测量反应管的特异性荧光强度，检测标本是否存在T790M突变，该方法简便快速，特异性强，适于大批量样本快速检测，经济实用。本发明还提供了适于临床应用的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101041850SQ20061003429
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月20日 优先权日2006年3月20日
发明者吕成伟 申请人:吕成伟