专利名称：加强促进有机肥堆肥发酵菌剂的制备方法
技术领域：
生物技术领域，本发明涉及一种加强促进有机肥堆肥发酵过程的菌剂的制备方法。
背景技术：
在有机肥大量需要的今天，将鸡粪、污泥和生活垃圾经过堆肥化，转化成腐熟的有机肥是发展趋势。但是，在自然堆肥化过程中往往需要几个月甚至几年，不仅不能完全腐熟而且不断散发出恶臭，污染周边的环境，残存有害病菌、虫卵，直接施用，会造成土传病害、虫害。为了改变这种现状，利用能降解含氨(胺)的菌群，把产生恶臭的物质降解除去，同 时在堆肥化过程的各阶段(室温-中温-高温)，细菌与真菌配合促进好氧发酵过程，即腐熟化的完成。在堆肥化过程完成后有效活菌数仍然有lX108cfu/g。采用细菌-真菌配合加强促进鸡粪、污泥和垃圾堆肥化的菌剂及其高密度、高活性的生产エ艺还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种高密度、高活性的加强促进堆肥化过程的菌剂的制备方法。本发明解决该技术问题所采用的技术方案是利用枯草芽孢杆菌CGMCC1.775 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌CGMCC1. 91 (BaciIIusIicheniformis)、沼泽红假单胞菌 CGMCC I. 2181 (Rhodopseudomonas palustris)、酿酒酵母 CGMCC2. I (Saccharomyces cerevisiae)和热带假丝酵母 CGMCC2. 563 (Candidatropicalis)，都是能产生氧化物酶、脱氢酶等和脂多糖类表面活性剂的菌，能够在接近堆肥物料颗粒的同时逐步降解含氨(胺)组分，从而达到除臭、促进堆肥化的目的；因为这五种菌都源于土壤，所以在进入物料后能很快形成优势菌群，占据一定生态位。将五种菌经优化组合组成复合菌群，经活化和三级液体扩大培养并吸附、固定化于草炭上制备成固体菌齐U。其中各组分的质量配比基本上是I :1:1:1:1.这五种菌都是农业部允许使用的安全、无害的菌。五株菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。加强促进堆肥化的菌制剂的制备方法包括下述步骤I.将冰箱2-4°C保存的各斜面菌种活化，分别试管-摇瓶培养；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养(配方牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水lOOOmL，pH值7. 2-7. 4)。酿酒酵母和热带假丝酵母用马铃薯-蔗糖培养基培养(配方去皮、去残马铃薯200g，切丝或切片，用约IOOOmL自来水，80-100°C煮30min，双层纱布过滤，得到IOOOmL滤液(不足部分用自来水补充)，加入蔗糖20g，自然pH值)。培养基灭菌:0. lMpa，121°C，灭菌30min ;接种后，150_200r/min振摇，28 30°C培养24-48h ；2.将上述摇瓶培养的各种子菌液混合，ニ级液体扩大培养(30L发酵罐)，以玉米面-豆柏培养基扩大培养(配方玉米面30g，豆柏20g，硝酸钾10g，硫酸镁0. 5g，磷酸氢ニ钾0. 5g，氯化钠0. 5g，硫酸亚铁0. OOlg,自来水lOOOmL，用氢氧化钙调节pH值7. 4-7. 8)。培养基灭菌0. IMpa, 121 °C，灭菌30min ;接种量按质量百分比5 % 10 %，300r/min搅拌，6-8L/min通气量，28 30°C培养20 24h ;用显微计数法(稀释100倍，用血球计数板计数)和分光光度法測定发酵液的吸光值(稀释100倍，在660nm波长下，測定吸光值)，以检测菌群生长情況。达到吸光值最大或菌群数最多，停止培养，转入下ー级培养。3.培养基同上，再经三级液体扩大培养(300L发酵罐)，接种量按质量百分比5% 10%，200r/min搅拌，10_15L/min通气量，28 30°C培养20 24h ;用显微计数法和分光光度法測定发酵液的吸光值和菌群数，以检测菌群生长情況。达到吸光值最大，菌液达到 1-5X 10lclcfu/mL，停止培养。4.以草炭粉末为载体将混合菌群均匀吸附、固定化于4 5倍草炭上，做成固体菌齐U。 5.菌剂密封于内衬聚こ烯的包装袋内，室温保存，避暴晒、避高温、高湿。6 保质期I年。本发明的有益效果I)将复合菌固定化于草炭上，使每克菌剂的有效菌菌落数(Cfu)可高达10个亿以上(即I 5X 109cfu/g)，几乎达到了最大可能数，至今还未见如此高含菌量菌制剂的报道.草炭不仅能为所扩大培养菌提供一些营养成分，还由于其网状结构，具有较大的比表面积，所以能在単位体积内附着、吸附固定化较多的菌体。因此，一定量的有效菌菌剂一旦均匀加入堆肥物料中就可以很快形成优势菌群，发挥除臭、促进堆肥化过程的作用。2)因为堆肥物料中的恶臭组分成分复杂，单ー的菌或少量的菌是难以完全转化、降解的。恶臭组分的完全降解必须由多种微生物产生多种酶才能最終降解、转化为水和ニ氧化碳。3)恶臭的測定方法文字描述法(《水和废水监测分析方法》，中国环境科学出版社，2002，第四版)。
具体实施方案实施例I按下列步骤进行I)将4°C保存的五支菌种斜面活化，分别试管-摇瓶培养。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌三支细菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养(配方牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化钠5g,蒸懼水lOOOmL, pH值7. 2-7. 4)。酿酒酵母和热带假丝酵母ニ支真菌用马铃薯-蔗糖培养基培养[配方去皮、去残马铃薯200g，切丝或切片，用约IOOOmL自来水，80-100°C煮30min，双层纱布过滤，得到IOOOmL滤液(不足部分用自来水补充)，加入蔗糖20g,自然pH值]。培养基灭菌0. IMpa, 121°C,灭菌30min ；接种后，200r/minz振摇，28 V 培养 24h。2) ニ级液体扩大培养(30L)，以玉米面-豆柏培养基扩大培养(配方玉米面30g，豆柏20g，硝酸钾10g，硫酸镁0. 5g，磷酸氢ニ钾0. 5g，氯化钠0. 5g，硫酸亚铁0. OOlg,自来水IOOOmL,用氢氧化钙调节pH值7. 4-7. 8)。培养基灭菌0. IMpa，121°C，灭菌30min ;接种量5% 10%，300r/min搅拌，6-8L/min通气量，28 30°C培养20 24h ;用显微计数法(稀释100倍，用血球计数板计数)和分光光度法測定发酵液的吸光值(稀释100倍，在660nm波长下，測定吸光值)，以检测菌群生长情況。达到吸光值最大或菌群数最多，停止培养，转入下ー级培养。3)培养基同上，再经三级液体扩大培养(300L)，接种量5% 10%，200r/min搅拌，10L/min通气量，28 30°C培养20 24h ;用显微计数法和分光光度法测定发酵液的吸光值和菌群数，以检测菌群生长情況。达到吸光值最大，菌液达到l-5X101(lCfu/mL，停止培养。4)以草炭粉末为载体将混合菌群均匀吸附、固定化于4 5倍草炭上，做成固体菌齐U。有效菌菌群数达3*108cfu/g.5)菌剂密封于内衬聚こ烯的包装袋内，室温保存，避暴晒、避高温、潮湿。实施例2按下列步骤进行I)将4°C保存的五种菌种斜面活化，分别试管-摇瓶培养。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌三支细菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养(配方牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化钠5g,蒸懼水lOOOmL, pH值7. 2-7. 4)。酿酒酵母和热带假丝酵母ニ支真菌用马铃薯-蔗糖培养基培养[配方去皮、去残马铃薯200g，切丝或切片，用约IOOOmL自来水，80-100°C煮30min，双层纱布过滤，得到IOOOmL滤液(不足部分用自来水补充)，加入蔗糖20g,自然pH值]。培养基灭菌0. IMpa, 121°C,灭菌30min ；接种后，200r/minz振摇，28 V 培养 24h。2) ニ级液体扩大培养(50L发酵罐)，以玉米面-豆柏培养基扩大培养(配方玉米面30g,豆柏20g,硝酸钾IOg,硫酸镁0. 5g,磷酸氢ニ钾0. 5g,氯化钠0. 5g,硫酸亚铁0. OOlg,自来水lOOOmL，用氢氧化钙调节pH值7. 4-7.8)。培养基灭菌:0. IMpa，121°C，灭菌30min ;接种量5%，300r/min搅拌，8L/min通气量，28 30°C培养20h ;用显微计数法(稀释100倍，用血球计数板计数)和分光光度法測定发酵液的吸光值(稀释100倍，在660nm波长下，測定吸光值)，以检测菌群生长情況。达到吸光值最大或菌群数最多，停止培养，转入下ー级培养。3)培养基同上，再经三级液体扩大培养(500L发酵罐)，接种量10%，200r/min搅拌，14L/min通气量，28 30°C培养23h ;用显微计数法和分光光度法測定发酵液的吸光值和菌群数，以检测菌群生长情況。达到吸光值最大，菌液达到l-5X101(lCfu/mL，停止培养。4)以草炭粉末为载体将混合菌群均匀吸附、固定化于4 5倍草炭上，做成固体菌齐U。有效菌菌群数达5*108cfu/g.5)菌剂密封于内衬聚こ烯的包装袋内，室温保存，避暴晒、避高温、潮湿。实施例3按下列步骤进行I)将4°C保存的五支菌种斜面活化，分别试管-摇瓶培养。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌三支细菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养(配方牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化钠5g,蒸懼水lOOOmL, pH值7. 2-7. 4)。酿酒酵母和热带假丝酵母ニ支真菌用马铃薯-蔗糖培养基培养[配方去皮、去残马铃薯200g，切丝或切片，用约IOOOmL自来水，80-100°C煮30min，双层纱布过滤，得到IOOOmL滤液(不足部分用自来水补充)，加入蔗糖20g,自然pH值]。培养基灭菌0. IMpa, 121°C,灭菌30min ；接种后，200r/minz振摇，28 V 培养 24h。2) ニ级液体扩大培养(20L)，以玉米面-豆柏培养基扩大培养(配方玉米面30g，豆柏20g，硝酸钾10g，硫酸镁0. 5g，磷酸氢ニ钾0. 5g，氯化钠0. 5g，硫酸亚铁0. OOlg,自来水IOOOmL,用氢氧化钙调节pH值7. 4-7. 8)。培养基灭菌0. IMpa，121°C，灭菌30min ;接种量5%，300r/min搅拌，8L/min通气量，28 30°C培养24h ;用显微计数法(稀释100倍，用血球计数板计数)和分光光度法測定发酵液的吸光值(稀释100倍，在660nm波长下，測定吸光值)，以检测菌群生长情況。达到吸光值最大或菌群数最多，停止培养，转入下ー级培养。3)培养基同上，再经三级液体扩大培养(200L)，接种量10%，200r/min搅拌，15L/min通气量，28 30°C培养22h ;用显微计数法和分光光度法測定发酵液的吸光值和菌群数，以检测菌群生长情況。达到吸光值最大，菌液达到l-5X101(lCfu/mL，停止培养。 4)以草炭粉末为载体将混合菌群均匀吸附、固定化于4 5倍草炭上，做成固体菌齐U。有效菌菌群数达5*108cfu/g.5)菌剂密封于内衬聚こ烯的包装袋内，室温保存，避暴晒、避高温、潮湿。实验效果以鸡粪堆肥化为例。实验时间、地点2011年7-8月，新疆喀什叶城县金秋实业生物肥有限公司实验设计将10吨鲜鸡粪，加入适量草炭，调节鸡粪含水率至60% (经验法用手攥手指缝之间无液体滴出，松手后鸡粪团落地能自然散开)，用铲车堆积成条垛状，加入IOOkg促进堆肥发酵的固体菌剂(约1% )，再用翻抛机翻倒I次，使菌剂与鸡粪混合均匀。室温放置。同时，另将10吨鲜鸡粪只加入草炭调节含水率至60%，井比实验组多加IOOkg草炭，同样用翻抛机翻倒I次，与实验组在完全相同的场地，室温放置，作为对照组。实验结果实验组堆肥第二天温度升至70°C，第三天升至75°C，臭味全无(多人嗅闻，文字描述法)。为减少氮损失，从第三天开始，每天用翻抛机翻倒I次，至第七天温度才开始下降，完成堆肥过程。发酵后的鸡粪有机肥养分含量和卫生条件都符合农业部有机肥标准NY525-2011 标准。对照组堆肥的第五天温度才升至65°C，翻倒后温度很快降低，臭味仍然很浓(方法同，多人嗅闻)。堆肥发酵七天后检验，卫生条件仍然达不到NY525-2011标准。结果通过实验证实菌剂确有除臭、促进堆肥发酵过程的作用。
权利要求
1.一种加强促进有机肥堆肥发酵过程的菌剂，其特征在于该菌剂由枯草芽孢杆菌 CGMCC1. 775(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌 CGMCC1. 91(Bacilluslicheniformis)、沼泽红假单胞菌 CGMCC1. 2181 (Rhodopseudomonas palustris)、酿酒酵母 CGMCC2. I(Saccharomyces cerevisiae)和热带假丝酵母 CGMCC2. 563(Candidatropicalis)组合而成的复合菌群,其中各菌组分的质量比是I : I : I : I : I。
2.如权利要求I所述的能够加强促进有机肥堆肥发酵过程的菌制剂的制备方法，其特征在于它包括下述步骤 1)将冰箱2-4°C保存的各斜面菌种活化，分别进行试管-摇瓶培养；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养，牛肉膏蛋白胨培养基配方为牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水lOOOmL，pH值7. 2-7. 4 ;酿酒酵母和热带假丝酵母用马铃薯-蔗糖培养基培养，马铃薯-蔗糖培养基配方为去皮去残马铃薯200g，切丝或切片，用IOOOmL自来水，80-100°C煮30min，双层纱布过滤，得到IOOOmL滤液，不足部分用自来水补充，加入蔗糖20g，自然pH值；培养基灭菌:0. lMpa，121°C，灭菌30min ;接种后，150-200r/min 振摇，28 30°C培养 24_48h ； 2)将上述摇瓶培养的各菌种子液混合，二级液体扩大培养，用30L发酵罐，以玉米面-豆柏培养基扩大培养，玉米面-豆柏培养基配方为玉米面30g，豆柏20g，硝酸钾10g，硫酸镁0. 5g,磷酸氢二钾0. 5g,氯化钠0. 5g,硫酸亚铁0. OOlg,自来水IOOOmL,用氢氧化隹丐调节pH值7. 4-7. 8 ;培养基灭菌0. lMpa，121°C，灭菌30min ;接种量按质量百分比5% 10%,300r/min 搅拌，6_8L/min 通气量，28 30°C培养 20 24h ； 3)再经三级液体扩大培养，用300L发酵罐，扩大培养基同上，接种量按质量百分比为5% 10%，200r/min 搅拌，10_15L/min 通气量，28 30°C培养 20 24h ； 4)以草炭为载体将三级液体扩大培养的混合菌液均匀吸附、固定化于4-5倍的草炭上； 5)密封于内衬聚乙烯的包装袋内，室温保存，避暴晒、避高温、避潮湿，保质期I年。
全文摘要
本发明涉及一种加强促进有机肥堆肥发酵菌剂的制备方法。具有对鸡粪、污泥以及垃圾堆肥化促进作用的菌剂是由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、酿酒酵母和热带假丝酵母组成的复合菌群，其中各组分的质量配比基本上为1∶1∶1∶1∶1。本发明的积极效果在于加入0.5-1％的菌剂于堆肥物料(鸡粪、污泥或生活垃圾)后能很快形成微生态优势菌群。对于含水率50％-60％的堆肥物料，常温条件下，第二天就消除臭味(文字描述法测定)，堆肥化过程5-7天就完成。菌剂的有效活菌数高，适应性强，对消除臭味、促进堆肥化过程具有明显的作用。
文档编号C12R1/01GK102796668SQ201210286818
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月14日 优先权日2012年8月14日
发明者张清敏, 刘志军, 李明, 张彦峰 申请人:叶城县金秋实业生物肥有限公司