专利名称：一种微生物降解羽毛的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物降解羽毛的方法。
背景技术：
世界上，每年由家禽养殖产生的羽毛达400万吨，它们大多被当成废物或未充分利用。角蛋白可被微生物降解，多种角蛋白降解菌已被分离并得到深人研究。经微生物角蛋白酶处理，羽毛可转化为有营养价值的饲料。如果角蛋白酶开发成功，动物的羽毛和毛发将是一种新的蛋白质来源。此外，角蛋白酶还有其他很多的应用价值。在强调可持续发展的今天，角蛋白酶的研发和角蛋白废物的利用不失为一个很有前景的环保举措。从微生物中纯化的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白类，如胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白；因此，具有广泛的应用前景。首先，它可用于废物处理，促进角蛋白类废物的生物降解；其次，它可用于制备饲料；羽毛粉是一种很好的蛋白质来源，可用作饲料组成。但是，羽毛粉不能被动物直接吸收利用，往往需要预先进行高温蒸煮或化学处理。预处理不仅消耗大量的动力和能量，还会破坏一些氨基酸。利用微生物的角蛋白酶，可在相对温和的条件下水解角蛋白，既能提高羽毛的营养价值，取得与大豆粉几乎相同的效果，也能节省能源。
角蛋白的水解方法很多，目前在我国常用的有化学处理法、高温蒸煮法和微生物酶解法。
化学处理法包括酸解和碱解，即用盐酸、硫酸、过氧乙酸和氢氧化钠等酸碱溶液使角蛋白分解。酸碱处理都会破坏部分氨基酸，酸碱中和还会产生大量盐分，产品用作饲料或饲料添加剂后，会抑制动物生长。
高压加热水解法一般应用于角蛋白饲料生产中，其流程为羽毛清杂、投入水解罐，直接或间接通入蒸汽，水解成块状蛋白质凝胶，烘干粉碎后用作饲料。产品质量取决于时间、温度、压力等工艺参数。目前我国大多采用这种方法进行角蛋白饲料的生产。由于工艺设备落后，工艺参数不易控制，水解效果不佳，产品质量不稳定，氨基酸消化率低或蛋白严重变性。生产过程中需要锅炉、水解罐、烘干等设备，生产成本偏高。持续过度的蒸汽加热处理不仅会破坏一些热敏氨基酸(半胱氨酸、赖氨酸等)，而且会降低某些氨基酸的消化率或利用率。
先热压处理，再用角蛋白降解菌水解，这是角蛋白废物资源化的另一类方法，但国内外争议较大，至今未见产业化技术和产品。
角蛋白具有不溶于水和抗分解的性质，这些性质主要决定于如下几个方面胱氨酸残基所提供的分子间双硫键的高度交叉连接；氢键的作用分子间相互的疏水作用。根据氨基酸的组成，a-螺旋每前进四圈，双硫键就出现一次。羊毛纤维被拉伸以后就有抗拉伸力，双硫键可逆的氧化和还原作用是羊毛纤维抗拉伸力的来源。由于角蛋白稳定的化学结构，致使它不能被一般的蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)水解。然而，在自然界并没有发现角蛋白废弃物的积聚，这应归功于角蛋白降解菌的作用。迄今为止，已有多种角蛋白降解菌被分离并得到深入研究。从这些微生物中分离的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白类，如胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白。经微生物角蛋白酶处理，角蛋白废物可转化为十几种氨基酸。因此，发掘高活性的角蛋白酶是开发和利用动物羽毛和毛发的重要环节。
微生物之所以能够降解角蛋白是因为它们可合成一种特殊的酶-角蛋白酶。经过对细菌、放线菌、真菌的研究，目前普遍认为微生物降解角蛋白可分为几个彼此相关的步骤变性作用、水解作用和转氨基作用。国内对角蛋白酶的研究还基本停留在产角蛋白酶菌的分离、筛选、角蛋白酶的分离纯化及理化性质的研究，以及角蛋白酶的作用机制的初步研究。而且，研究的对象也极其有限，主要集中于对弗氏链霉菌的研究。
发明人认为生物法降解羽毛资源极具有开发前景，关键在于能否找到高效降解菌株并设计出一套适合这种高效降解菌株的水解工艺。如果解决了上述问题，微生物水解技术可望成为角蛋白资源化的有效方法。因此，需要完成以下两个问题A、分离获得角蛋白降解菌，并通过动力学分析，选出高效降解菌株；B、针对高效降解菌株，探索营养条件和环境条件，确定合适的水解工艺和控制参数。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种工艺简单、降解率高的微生物降解羽毛的方法，该方法所得的产物能用作饲料。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种微生物降解羽毛的方法，包括以下步骤1)、配制羽毛待转化底物按照2克羽毛放入100ml无菌水的比例组成反应体系，用浓度为2M的氢氧化钠调节上述反应体系的pH至7.5～8.0，再于110℃下处理5～10min后冷却，形成待转化底物待用；
2)、细菌细胞的获得和收集将保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410按照3g/100ml的接种量放入发酵培养基内，于37℃发酵温度、200r/min转速下发酵培养24小时得培养物；所述每100ml发酵培养基是由葡萄糖7.4g、酪蛋白1.13g、0.62g玉米提取物、磷酸氢二钾0.21g和硫酸镁0.034g，用蒸馏水溶解定容后，再调节pH为7.5，于115℃下灭菌20分钟制成；将上述培养物在6000rpm的转速下离心30min，去除上清液，收集细胞；采用无菌水洗涤离心后的细胞，获得无发酵培养基组成的细胞；再将所获细胞悬浮于无菌水中形成细胞悬浮液备用，此细胞悬浮液中细胞浓度为0.1克/ml；3)、羽毛的生物细胞转化处理在无菌条件下，在待转化底物中接入细胞悬浮液，于40℃、120r/min转速下处理48～144小时；待转化底物与细胞悬浮液的体积比为100∶1。
本发明所选用的菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJUEL31410，该菌株的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2005年06月23日，保藏号CGMCC 1397。该菌株本申请人已于2005.9.20申请了发明专利，申请号为200510060829.1。
发明人建立了检测羽毛降解菌的方法，包括检测可溶性蛋白质含量和分泌的角蛋白酶活方法；该方法不仅快速、简便，而且具有稳定的优点。传统的采用羽毛作为底物的检测方法往往由于酶活变化很不稳定，因此导致试验结果的不可靠性。而本检测方法是利用平板方法验证了能在选择性平板上的生长，然后再选择生长情况比较好的菌株直接进行发酵测定其酶活和羽毛降解后的蛋白质含量。具体的检测方法见下所示角蛋白酶活力的定义以每1mL发酵液在pH8.5、温度40℃、150r/min的条件下水解酪蛋白，每分钟生产酪氨酸的微克数为1个酶活力单位(U)，即U的单位为U/mL·min。
酪氨酸标准曲线的配制精密称取100mg酪氨酸溶液置100mL容量瓶中，加水溶解溶置刻度，摇匀。分别吸取0、1、2、3、4、5ml酪氨酸溶液置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，使之成为每1mL溶液含酪氨酸的量分别为0、20、40、60、80、100μg。在各瓶溶样中分别准确吸取1ml加入试管中，再分别加入0.4mol/L Na2CO3溶液5ml和Folin试剂工作液1ml，充分摇匀，于40℃水浴锅上保温发色20分钟。冷却后于岛津120紫外可见分光光度计680nnl处比色，测定吸光度(A)。
角蛋白酶活力的测定先将发酵液和1％的酪蛋白溶液(pH 8.5)分别在水浴上预热5分钟，然后准确吸取1mL酪蛋白溶液加入到1ml的发酵液中，在40℃、150r/min的条件下酶解10分钟，再加入2mL三氯乙酸溶液终止反应，继续水浴15分钟，过滤。滤液稀释40倍按标准曲线配制以下的方法，测定吸光度(A)，并换算成酶活力。
Folin-酚快速蛋白浓度测定法配制以下四种溶液，即1、4％碳酸钠；2、0.2mol/L氢氧化钠；3、1％硫酸铜溶液；4、2％酒石酸钾钠溶液。使用前将1和2等体积混合，3和4等体积混合，然后将两液以50∶1混合(溶液甲)。标准曲线测定方法使用经过凯氏定氮测定蛋白质浓度的大米蛋白水解物作为标准蛋白，并配制成500μg/ml的溶液。在试管中加0、0.20、0.40、0.60、1.00ml标准蛋白液，加水补足1毫升，配制成不同浓度的标准蛋白液。每个试管加入5ml试剂(甲)，摇匀，室温置放10分钟，再依次加入0.5ml的Folin----酚试剂，摇匀，30℃保温30分钟。然后在分光光度机上比色测定(A500)，进行线性回归可以获得标准曲线方程。待测样品如上反应和测定，对照标准曲线，得出蛋白质含量。
本发明所选用的芽孢杆菌菌株ZJUEL31410，在羽毛蛋白选择性培养基上能进行生长和产生水解圈，并能在牛奶-琼脂培养基上产生明显的透明圈。该菌株既可以在葡萄糖、酪蛋白合成培养基上生长，也可以在羽毛、葡萄糖培养基上生长，但两种培养基中都需要添加生长因子——玉米提取物，其主要代谢产物为角蛋白酶。产物-角蛋白酶能显著分解羽毛等毛发废弃物，明显高于目前国内报道的真菌分泌的角蛋白酶；因此能促进羽毛等毛发资源的综合利用，显示着很好的应用潜力和市场应用价值。
本发明所选用的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410产酶水平较高，酶活要显著高于同类国内外报道的产酶水平；而且产酶周期短，分解羽毛效果显著。本发明所选用的芽孢杆菌菌株及其代谢产物——角蛋白酶，不产生有害物质，能安全地作为食品级添加剂。
角蛋白酶可采用以下方法获得1、菌种的分离和来源见申请号为200510060829.1的《一种芽孢杆菌菌株及其用途》。
2、该微生物的培养方法或繁殖方法该地衣芽孢杆菌产生角蛋白酶的种子培养方法和发酵培养方法见下所示，首先采用种子培养基进行增殖培养，随后接入发酵培养基中在一定条件下培养一定时间后测定其酶活。产酶发酵培养基可以采用葡萄糖、2％羽毛为发酵基质，其发酵过程中需要添加一定量的玉米提取物、无机盐类为辅助营养成分。
2.1种子培养方法培养基(g/L)牛肉膏4.0，蛋白胨6.0，酵母膏2.0，氯化钠5.0，其余为水，pH7.0。
培养方法接种量为3g/100ml，发酵温度为37℃，转速为150r/min，培养到对数生长期16-18h接入发酵培养基中进行培养。
2.2摇瓶发酵培养方法发酵培养基(g/100ml)葡萄糖1-3，羽毛粉2，玉米提取物0.2-1.0，磷酸氢二钾0.05-0.15，硫酸镁0.005-0.015，采用蒸馏水溶解并定容，pH7.0-8.0。
培养方法接种量为4g/100ml，发酵温度为37℃，转速为120-160r/min，发酵培养48小时后下停止发酵，分析其角蛋白酶活性。
2.3改良后的摇瓶发酵培养方法采用优化统计方法，对原始发酵培养基组成进行了优化和改进，获得改良后的培养方法为(g/100ml)葡萄糖2.0，羽毛粉2，玉米提取物0.7，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.01，采用蒸馏水溶解并定容，pH7.5。接种量4％(即接种量为4g/100ml)，发酵温度为37℃，转速为150r/min，发酵培养48小时后下停止发酵，分析其角蛋白酶活性。
相对于上述2.3改良后的摇瓶发酵培养方法，发明人还进行了如下的不同发酵条件下的对比实验对比1、不同培养温度对芽孢杆菌ZJUEL31410生产角蛋白酶的影响发酵所用培养基为(g/100ml)葡萄糖4，羽毛粉2，玉米提取物0.2，磷<p>作用24小时后，记录幼虫死亡数实验结果见表3。
表3 溴氰菊酯及其代谢产物对淡色库蚊四龄幼虫的毒力测定
实施例3本发明的牛源性糜蛋白酶对溴氰菊酯的降解作用在四份样品中，分别各加入5，10，50，100U的牛源性糜蛋白酶(Ameresco公司产品)和5ug的溴氰菊酯加水定容至1ml，29℃孵育24h。样品液中加入1ml的丙酮，旋涡振荡30s。加2ml环己烷充分混匀、提取，2,000rpm/min离心10min，吸取上层液；用环己烷重复提取2次后，合并所有上层液，在60℃水浴中用氮气吹干溶剂。用0.2ml环己烷浸润、溶解残留物，以0.6ul进样量上色谱测定溴氰菊酯的含量，发现溴氰菊酯的降解率与酶浓度在5-100U范围内呈现良好的相关性。GC/MS分析，表达蛋白NYD-Ch能使溴氰菊酯降解为Br2CA和3-PBA。实验结果见表4。
表4 不同剂量牛源性糜蛋白酶对溴氰菊酯的降解率
实施例4按与实施例2基本相同的方法，用淡色库蚊糜蛋白酶分别作用于马拉硫磷、二嗪农、高效氯氰菊酯后，测定不同杀虫剂及其降解产物对淡色库蚊4龄幼虫的毒性作用，均表现出与实施例2相似的良好的降解效果。
实验蚊虫为敏感品系，终体积为200ml。
表3外加氮源对角蛋白酶合成的影响(48h)
上表结果可以看出，外加无机氮源并不利于羽毛的分解和角蛋白酶合成，因此在实际过程中并不需要外加无机氮源。
对比4、不同浓度的玉米提取物对角蛋白酶活的影响在上述2.3改良后的摇瓶发酵培养方法中将玉米提取物的浓度分别设定为的浓度分别设定为0.2g、0.7g、1.2g和2.0g。发酵48小时测定其酶活和可溶性蛋白质含量。具体结果见表4。
表4生长因子-玉米提取物对角蛋白酶分泌的影响(48h)
从上表看出，玉米提取物对于羽毛的降解具有显著促进作用，但是过高浓度的玉米提取物并不利于羽毛的分解，因此采用0.7％(W/V)的玉米提取物可以促进羽毛的分解和角蛋白酶合成。
培养基组成的优化采用了部分因子实验设计和响应面试验设计方法对培养基组成进行了全面优化，结果发现培养基为(g/100ml)葡萄糖2.0，羽毛粉2，玉米提取粉0.7，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.01，蒸馏水溶解定容，pH7.5。接种量3％，发酵温度为37℃，转速为150r/min，发酵培养48小时测定其发酵角蛋白酶活性为68U/ml·min-72U/ml·min。
具体实施例方式
一种微生物降解羽毛的方法，依次进行以下步骤1)、配制羽毛待转化底物将2克羽毛放入100ml无菌水的比例组成反应体系，在250ml反应容器中放入上述100ml反应体系，用浓度为2M的氢氧化钠调节上述反应体系的pH至7.5～8.0，再于110℃下处理5～10min后冷却至室温，形成待转化底物待用；2)、细菌细胞的获得和收集将保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410按照3g/100ml的接种量放入发酵培养基内，于37℃的发酵温度、200r/min转速下培养24小时得培养物；所述100ml发酵培养基是由葡萄糖7.4g、酪蛋白1.13g、0.62g玉米提取物、磷酸氢二钾0.21g和硫酸镁0.034g，用蒸馏水溶解定容后，再调节pH为7.5，于115℃下灭菌20分钟制成；将上述培养物在6000rpm的转速下离心30min，去除上清液，收集细胞；采用无菌水洗涤离心后的细胞，获得无发酵培养基组成的细胞；再将所获细胞悬浮于无菌水中形成细胞悬浮液备用，此细胞悬浮液中细胞浓度为0.1克/ml；3)、羽毛的生物细胞转化处理在无菌条件下，在待转化底物中接入细胞悬浮液，于40℃、120r/min转速下振荡处理48小时；待转化底物与细胞悬浮液的体积比为100∶1。
实施例2、将步骤3)的处理时间改成96小时，其余同实施例1。
实施例3、将步骤3)的处理时间改成144小时，其余同实施例1。
上述实施例1、实施例2以及实施例3中，芽孢杆菌ZJUEL31410细胞对羽毛的液体转化的结果具体如表5所示.
表5芽孢杆菌ZJUEL31410细胞对羽毛的液体转化在不同处理时间下的结果
因本发明所选用的芽孢杆菌ZJUEL31410是一种对氧需求兼性的芽孢杆菌，所以也可以采用液体细胞静态转化法实现羽毛的生物降解处理；只不过所需处理时间比有氧条件下要长，降解速率要慢。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种微生物降解羽毛的方法，其特征是包括以下步骤1)、配制羽毛待转化底物按照2克羽毛放入100ml无菌水的比例组成反应体系，用浓度为2M的氢氧化钠调节上述反应体系的pH至7.5～8.0，再于110℃下处理5～10min后冷却，形成待转化底物待用；2)、细菌细胞的获得和收集将保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410按照3g/100ml的接种量放入发酵培养基内，于37℃发酵温度、200r/min转速下培养24小时得培养物；所述每100ml发酵培养基是由葡萄糖7.4g、酪蛋白1.13g、0.62g玉米提取物、磷酸氢二钾0.21g和硫酸镁0.034g，用蒸馏水溶解定容后，再调节pH为7.5，于115℃下灭菌20分钟制成；将上述培养物在6000rpm的转速下离心30min，去除上清液，收集细胞；采用无菌水洗涤离心后的细胞，获得无发酵培养基组成的细胞；再将所获细胞悬浮于无菌水中形成细胞悬浮液备用，细胞悬浮液中细胞浓度为0.1克/ml；3)、羽毛的生物细胞转化处理在无菌条件下，在待转化底物中接入细胞悬浮液，于40℃、120r/min转速下处理48～144小时；待转化底物与细胞悬浮液的体积比为100∶1。
全文摘要
本发明公开了一种微生物降解羽毛的方法，包括以下步骤1)配制羽毛待转化底物；2)细菌细胞的获得和收集选用保藏号为CGMCC1397的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410；3)羽毛的生物细胞转化处理。本发明的微生物降解羽毛的方法，工艺简单、降解率高；该方法所得的产物能用作饲料。
文档编号A23J1/10GK1860904SQ20061005188
公开日2006年11月15日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者陈启和, 何国庆 申请人:浙江大学