专利名称：水稻花分生组织控制基因eg1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻EG1(EXTRA GLUME 1)基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因物对水稻花分生组织和花的发育进行改良，提高水稻的产量。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是单子叶植物发育分子生物学研究的理想模式植物。单子叶植物的花分生组织及花器官组成的许多特征明显不同于双子叶植物(双子叶植物的花从外到内依次花萼、花瓣、雄蕊和心皮四轮花器官组成)。水稻花序分生组织的单位是小穗，小穗由小花和两个颖片组成，小花从外到内依次由外颖、内颖、2个浆片、6枚雄蕊和1个雌蕊。近年来，花器官的发育受到人们的广泛关注并成为现代分子生物学研究的焦点之一。这不仅是因为花在植物的生长发育中处于中心位置，而且花器官的发育过程为研究基因表达调控与器官的形态发生之间的关系提供了一个非常独特的系统。通过对花发育机制的理解，我们就能通过基因工程的手段改变花分生组织和花的发育，控制作物的开花时间。禾本科植物的花器官雄蕊和雌蕊是保守的；浆片被认为是双子叶植物花瓣的同源器官也已得到许多实验结果的证实。有人认为外颖和内颖都是与双子叶植物花萼一致的器官。然而外颖和内颖在形态上存在差异，而且排列上也不同，外颖和内颖与双子叶植物花器官之间是怎样的关系，目前仍不清楚。因此，利用水稻颖壳突变体，研究水稻花发育的分子调控机制，完善水稻花发育的模型，具有重要意义。
本发明利用水稻多颖突变体，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了EG1基因，该基因编码一类lipase蛋白，控制水稻花分生组织的形成，并影响水稻花器官的数目。Lipase是一类水解酶，在植物中通过分解脂质在细胞新陈代谢中起重要作用，目前也有研究发现lipase具有控制花药开裂及推迟叶片衰老的功能，但是目前还未发现lipase影响花分生组织发育的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种能影响水稻小花发育及穗部结构的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻小花及穗部进行改造的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种水稻花分生组织控制基因EG1编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种改进上述氨基酸序列还包括在SEQ ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
本发明还提供一种编码上述两种蛋白质的基因，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
作为本发明的一种改进上述核苷酸序列还包括在SEQ ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因或衍生物。
本发明还提供一种包含上述基因的植物表达载体。
本发明还提供一种包含上述两种核酸的转基因植物细胞。
本发明还提供一种对水稻花分生组织进行改造的方法，包括用具有SEQID No1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
进一步具体的说本发明的目的是提供一种从水稻突变体extra glume 1中克隆的新基因EG1，如图6和SEQ ID No1所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID No2和图7所示的蛋白质属于lipase脂肪酶，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID No1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。
本发明的另一个目的是提供一种用EG1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID No1和图6所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300-EG1，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。
本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻花分生组织发育的方法。
实现本发明的具体技术步骤如下一、水稻多颖突变体eg1的分离和遗传分析通过大量筛选突变体，本发明获得了一个水稻多颖突变体eg1，通过与野生型水稻正反交实验，我们获得了一个符合单基因控制的遗传规律的隐性突变体，如图1所示。
二、图位克隆控制水稻花分生组织的EG1基因1)、EG1基因的初步定位为了分离EG1基因，本发明采用图位克隆的方法，首先创建了一个F2定位群体，由EG1纯合体(粳稻中花11)为母本，选用籼稻浙辐802为父本杂交获得的F2中的隐性个体组成。并利用SSR分子标记对EG1位点进行初步定位见图2。定位结果表明，EG1初步定位在第1染色体短臂介于RM1361和RM3482两个标记之间。
2)、EG1基因的精细定位通过对RM1361和RM3482两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS和CAPS标记将EG1精确定位于BAC P0035F12上P4和P2标记之间约31kb范围之内，并且与分子标记P3共分离(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因。
3)、EG1基因的鉴定和功能分析通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)，证明了本发明正确克隆了EG1基因(图6)，氨基酸序列分析表明EG1编码一类lipase蛋白(图7)。
我国是稻米生产和消费大国，随着人口的增长，对稻米需求将呈上升趋势。但目前存在耕地面积减少的趋势，因此迫切需要培育高产水稻品种。基因工程技术的发展使得应用EG1基因调整水稻花发育方式和穗部结构成为可能。本发明的eg1(extra glume 1)突变体，是单基因隐性突变，符合孟德尔方式遗传规律。eg1突变体由本发明者分离获得。本发明通过图位克隆技术获得控制花分生组织的基因EG1，并通过转基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。因而本发明能对水稻花分生组织和花的发育进行改良，最终能提高水稻产量。
图1是水稻多颖突变体eg1与中花11野生型的穗部及小花表型；图2是EG1基因在水稻第1染色体上的初步定位图；图3是EG1基因的精细定位；图4是pCAMBIA1300-EG1载体图谱；图5是功能互补实验T0转基因水稻的表型；其中eg1为多颖突变体植株；EG1/eg1为T0代转基因水稻植株；图6是EG1基因的DNA核苷酸序列；图7是EG1基因编码的氨基酸序列。
具体实施例方式
实施例11、水稻材料水稻(Oryza sativa ssp.zhonghua11)突变体eg1(extra glume 1)，原始野生材料为中花11。
2、分析和定位群体纯合体eg1突变体和野生型品种浙辐802进行杂交，F1代自交，得到F2群体，在抽穗期从中选出713个eg1突变表型个体作为定位群体。在抽穗期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
3、通过SSR、STS和CAPS标记定位EG1基因采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻幼嫩叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中。每一个PCR反应用2μl DNA样品。
在EG1基因的初步定位试验中，对80个F2个体进行SSR分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，然后在5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将EG1初步定位在第1号染色体长臂RM1361和RM3482标记间。
在精细定位EG1基因时，对由713株F2个体组成的群体进行SSR、STS和CAPS分析。根据分子标记RM1361和RM3482之间的BAC序列，我们设计了1个STS分子标记(P4)、1个SSR分子标记(P3)和1个CAPS分子标记(P2)，引物序列为P2U-5’CTGTATGTAGGCAAGACGTGAG3’，P2L-5’TGATTGTTAGGAATGTGTGACTG3’(NdeI digestion)；P3U-5’CTCCCTCACTAACTTAACCTGC 3’，P3L-5’AGCCTCGCTCTTCTACCTACA 3’；P4U-5’AAGAAGAGGGTGTGACAGCC 3’，P4L-5’GTGTGTTCGGTTCACGCTAA 3’。
利用这3个分子标记对713株F2个体进行连锁分析。
5、基因预测和比较分析根据精细定位的结果，EG1基因位于BAC克隆P0035F12上P2和P4标记之间31kb范围之内。根据Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内有2个候选基因，然后设计10对引物，采用PCR方法分别从EG1和野生型中花11的基因组中扩增出这两个候选基因，(共10个DNA片段)，进行测序分析。发现其中1个基因的1个DNA片段中，突变体eg1扩增的产物与野生型中花11比较有一个碱基替换(T到A)。将这结果重复验证两次，发现突变体eg1基因与中花11比较都有这个碱基替换。根据BAC克隆P0035F12序列的基因注释信息(NCBI)，发现此基因编码lipase蛋白，与拟南芥控制花药开裂的基因DAD1同源性很高。
实施例2、植物转化将BAC克隆OSJNBa0089G14用BamH I完全酶切，电泳分离后，割取5.1kb的DNA片段连接到pCAMBIA1300中，该克隆覆盖了整个ORF的基因组区域，包括ATG上游804bp启动子序列和3506bp的下游序列。
这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用突变体幼胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有40mg/LHygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，在抽穗期发现穗部小花恢复了正常的形态，与同一生长阶段的突变体比较，多颖等突变表型消失，小花恢复正常(图5)。
以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式
，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO11 atgacgctcc cgaggcaatg cgcggcggcg tgtaggacag gcggcggcgg cggcggcgtg61gtgcggtgca gggcggtggc ggcggcgggt ggggcggtgg cggtgaggga tgcggtggtg121 gcgccggtgg cgaggcgagg ggcggcgagg aagacggcgg agacggtggc ggggatgtgg181 agggaggtgc aggggtgcgg ggattgggag gggatgctgg agccggcgcc gcacccggtg241 ctgagggggg aggtggcgcg gtacggcgag ctggtgggcg cgtgctacaa ggcgttcgac301 ctggacccgg cgtcgcggag gtacctcaac tgcaagtacg ggagggagag gatgctggag361 gaggtcggga tgggcggcgc cgggtacgag gtcacccgct acatctacgc ggcggcggac421 gtcagcgtgc cgaccatgga gccgtcgacg agcgggcgcg ggcggtggat cgggtacgtc481 gcggtgtcca ccgacgagat gtcgcggcgg ctcgggcggc gcgacgtgct cgtctcgttc541 cggggcacgg tcacccccgc cgagtggatg gccaacctca tgagctcgct ggaggcggcg601 cggctcgacc cgtgcgaccc gcgccccgac gtcaaggtgg agtccgggtt cctcagcctc661 tacacctccg ccgacaagac gtgccgcttc ggcggcgccg ggagctgccg ggagcagctc721 ctccgcgagg tgtcccgcct cgtcgccgcc tactccggcg gcggcgagga cgtcagcgtc781 acgctcgccg gccacagcat gggcagcgcg ctggcgctcc tctccgccta cgacctcgcc841 gagctcggcc tcaaccgcgc cgccccggtc accgtcttct ccttcggcgg gccgagggtg901 gggaacgcgg cgttcaaggc gcgctgcgac gagctcggcg tcaaggcgct ccgcgtcacc961 aacgtacacg acccgatcac caagctcccc ggcgtcttcc tcaacgaggc caccgccggc1021 gtgctccgcc cgtggcgcca ctcctgctac acccacgtcg gcgtcgagct ccccctcgac1081 ttcttcaagg tcggcgacct cgcctccgtc cacgacctcg ccacctacat ctccctcctc1141 cgtggcgccg acaagaagca gcccgccgcc gccgccgccg acgccggcgg cgtgctcgcc1201 aaggtgatgg acttcgtggg tcggcggcgc ggcggcggcg cattgccgtg gcacgacgcg1261 gcgatgatac agatgggcgg cttggtgcag acgctcgggc taatctga
SEQ ID NO21 Met Thr Leu Pro Arg Gln Cys Ala Ala Ala Cys Arg Thr Gly Gly16Gly Gly Gly Gly Val Val Arg Cys Arg Ala Val Ala Ala Ala Gly31Gly Ala Val Ala Val Arg Asp Ala Val Val Ala Pro Val Ala Arg46Arg Gly Ala Ala Arg Lys Thr Ala Glu Thr Val Ala Gly Met Trp61Arg Glu Val Gln Gly Cys Gly Asp Trp Glu Gly Met Leu Glu Pro76Ala Pro His Pro Val Leu Arg Gly Glu Val Ala Arg Tyr Gly Glu91Leu Val Gly Ala Cys Tyr Lys Ala Phe Asp Leu Asp Pro Ala Ser106 Arg Arg Tyr Leu Asn Cys Lys Tyr Gly Arg Glu Arg Met Leu Glu121 Glu Val Gly Met Gly Gly Ala Gly Tyr Glu Val Thr Arg Tyr Ile136 Tyr Ala Ala Ala Asp Val Ser Val Pro Thr Met Glu Pro Ser Thr151 Ser Gly Arg Gly Arg Trp Ile Gly Tyr Val Ala Val Ser Thr Asp166 Glu Met Ser Arg Arg Leu Gly Arg Arg Asp Val Leu Val Ser Phe181 Arg Gly Thr Val Thr Pro Ala Glu Trp Met Ala Asn Leu Met Ser196 Ser Leu Glu Ala Ala Arg Leu Asp Pro Cys Asp Pro Arg Pro Asp211 Val Lys Val Glu Ser Gly Phe Leu Ser Leu Tyr Thr Ser Ala Asp226 Lys Thr Cys Arg Phe Gly Gly Ala Gly Ser Cys Arg Glu Gln Leu241 Leu Arg Glu Val Ser Arg Leu Val Ala Ala Tyr Ser Gly Gly Gly256 Glu Asp Val Ser Val Thr Leu Ala Gly His Ser Met Gly Ser Ala271 Leu Ala Leu Leu Ser Ala Tyr Asp Leu Ala Glu Leu Gly Leu Asn286 Arg Ala Ala Pro Val Thr Val Phe Ser Phe Gly Gly Pro Arg Val301 Gly Asn Ala Ala Phe Lys Ala Arg Cys Asp Glu Leu Gly Val Lys
316Ala Leu Arg Val Thr Asn Val His Asp Pro Ile Thr Lys Leu Pro331Gly Val Phe Leu Asn Glu Ala Thr Ala Gly Val Leu Arg Pro Trp346Arg His Ser Cys Tyr Thr His Val Gly Val Glu Leu Pro Leu Asp361Phe Phe Lys Val Gly Asp Leu Ala Ser Val His Asp Leu Ala Thr376Tyr Ile Ser Leu Leu Arg Gly Ala Asp Lys Lys Gln Pro Ala Ala391Ala Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val Leu Ala Lys Val Met Asp Phe406Val Gly Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ala Leu Pro Trp His Asp Ala421Ala Met Ile Gln Met Gly Gly Leu Val Gln Thr Leu Gly Leu Ile
权利要求
1.一种水稻花分生组织控制基因EG1编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻花分生组织控制基因EG1编码的蛋白质，其特征在于所述氨基酸序列还包括在SEQ ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
3.一种编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征在于该基因具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因或衍生物。
5.一种含有权利要求3或4所述基因的植物表达载体。
6.一种含有权利要求3或4所述基因的转基因植物细胞。
7.一种改良水稻花分生组织的方法，其特征在于包括用具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻花分生组织控制基因EG1编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码上述蛋白质的基因，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本发明同时公开了含有上述基因的植物表达载体，以及含有上述基因的转基因植物细胞。本发明还公开了改良水稻花分生组织的方法，包括用具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。本发明能对水稻花分生组织和花的发育进行改良，最终能提高水稻产量。
文档编号C12N15/29GK1911961SQ200610053180
公开日2007年2月14日 申请日期2006年8月28日 优先权日2006年8月28日
发明者钱前, 薛勇彪, 薛大伟, 李浩戈, 李美娜, 张光恒, 曾大力, 郭龙彪 申请人:中国水稻研究所