专利名称：：用于辅助抗根结线虫n基因选择的分子标记的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种可用于辅助抗根结线虫N基因选择的分子标记。
背景技术：
：我国是世界辣椒种植面积最大的国家，2002年的栽培面积达到了130万公顷，产量约2819万吨。根结线虫严重危害辣椒。根结线虫主要危害我国南方的辣椒生产，但近年来随着北方保护地生产面积的增加、复种指数的提高、连作重茬现象普遍，使得线虫病害向北方地区迅速蔓延。根结线虫引起的农作物损失中90%以上都是由南方根结线虫(M./"cogmY")、花生根结线虫(M.we"an'fl)、爪哇根结线虫(M./flw"/cfl)及北方根结线虫/^p/fl)四个最常见种引起的，以南方根结线虫危害最重。辣椒根结线虫防治化学防治容易污染环境、物理防治高耗能并效果不明显。因此培育抗病品种是防治线虫的一种有效的方法。利用传统的育种方法一般容易受环境影响、选择效率低。开发与抗病基因连锁的分子标记，利用分子标记辅助选择育种是近年发展起来的高效育种手段。目前，在辣椒上已经发现并且命名的抗线虫的基因至少有6个，基因w,Me2，Afe3，Afe4,Me5,均为显性单基因控制，其中Afe3与Me4连锁，Me3对温度稳定(黄三文，2000,园艺学报，27(增刊):515-521)。2001年C.Djian-Caporalino等人利用AFLP技术和材料"YoloWonder""PM687"的DH群体完成了对Me3与Me4的分子遗传定位，将其定位到同一条染色体上，相差9.9cM,并开发了一个与紧密连锁的AFLP标记，与之间的遗传距离仅lhi;/cM。(Djian-CaporalinoC.,PijarowskiL.,FazariA.,SamsonM"GaveauL.,O'ByrneC.,LefebvreV.，CarantaC.,PalloixA.,AbadP..2001.High-resolutiongeneticmappingofthepepper(Cfl—caw/w,L.)resistancelociMe3andMe4conferringheat-stableresistancetoroot-knotnematodes(Meloidogynespp.).TheorApplGenet,103:592-600)基因《的分子遗传定位还没有报道，因为N基因发现较早，抗病性强(接近免疫)，因此对该基因的分子标记的研究和利用更有意义。
发明内容本发明的目的在于提供一种可用于辅助抗根结线虫N基因选择的分子标记。本发明利用含"N"基因的自交系CarolinaWonder(Fery，R.L.Dukes,P.D.Sr.Thies,J.A.1998."CarolinaWonder'and'CharlestonBelle,:southernrootknotnematode-resistantbellpeppers.Hortscience，33(5):900-902)与感病自交系茄门(购自北京中蔬园艺良种开发中心)组建的F2群体，釆用人工接种根结线虫，结合BSA(BulkedSegregatedAnalysis,分离组群分析法)和AFLP技术开发分子标记。获得的分子标记是E39/M41-527。分析群体的母本是"N"基因的自交系CarolinaWonder;父本是感病自交系茄门；二者杂交获F1代，再自交获F2代。BSA(BulkedSegregatedAnalysis,分离组群分析法)根据抗病性鉴定结果，将F2群体中病级指数最高和最低的极端抗、感植株各选10株，每株取100ngDNA进行混合，建立抗池和感池。以抗池和感池的DNA为模版，按AFLP方法进行扩增，查找两个池的差异片段，然后以F2群体的个体DNA为模版进行AFLP扩增，探求差异片段在F2群体中的分布。下面是对F2代的AFLP分析。1、基因组DNA的酶切和连接基因组DNA的双酶切和接头的连接采用一步完成，酶体系为五coWI/M化I,反应体系如表1所示，37°C下反应8小时。表l辣椒基因组DNA的￡coM/A^eI酶切及连接体系体系组分浓度25ul20u/ul0.15MsellOu/ul0.3EcoRI接头5pm/ul1.0Msel接头50pm/ul1.0ATP10mM2.0BufferlOxNECBuffer22.5BSAlOOx0.2T4连接酶6u/ul0.2基因组DNA50ng/ul3H2014.652、预扩增将步骤l的连接产物，进行预扩增。反应体系如表2所示。_表2预扩增反应体系_体系组分i5iil引物序列EOO:GACTGCGTACCAATTCMOO:GATGAGTCCTGAGTAA扩增程序94°C3min;25个循环(94°C30s;56°C30s;72°Clmin)，72°C7min补平末端，4。C保存。取5ul预扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。其余预扩增产物稀释30倍，-20°(:保存备用。3、选择性扩增将步骤2的扩增产物稀释30倍后进行选择性扩增，扩增体系如表3所示。表3选择性扩增反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>引物序列EcoRI引物5'-GACTGCGTACCAATTCAGA-3'Msel引物5'-GATGAGTCCTGAGTAAAGG-3'扩增程序预变性94°C5min，12个循环(94°C30s;65°C(-0.7°C/cycle)30s;72°Clmin),25个循环(94°C30s;56°C30s;72°Clmin),72°C5min补平末端，4。C保存。4、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将选择性扩增的产物中加入变性上样缓冲液6ul(9S%甲酰胺、10mMEDTA、0.25%嗅酚蓝、0.25%二甲苯青)，95。C变性5min，然后在冰浴中迅速冷却。在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上釆用恒功率70W电泳lh5min,加样量为5ul。结果发现，E39/M41-527在这两组中存在显著差异。(如图1)用上述方法对所有320个单株进行鉴定，并重复三次，结果稳定。标记中有282株可用，有带株数230株，无带株数52株，交换株数15株，不确定株数26株。经Joinmap3.0作图软件分析，遗传距离为6.258cM。说明标记E39/M41-527与N基因紧密连锁，以此其可作为辅助抗根结线虫N基因选择的分子标记。本发明提供了N基因的分子标记E39/M41-527,及其AFLP分析的方法，为辣椒抗根线虫N基因提供了选择依据。图1是AFLP分析的银然检测结果，图中R1-R10为抗病池的IO个单株；S1-S10为感病池的10个单株；M:分子量标记；箭头指示位置为标记，抗病单株均含有此带(2个图中没有显示)，感病单株不含此带。图2是AFLP标记(E39m41-527)在F2群体中的分布，其中1~17为F2群体单株，M:分子量标准(PBR322/MspI);图3是Joinmap3.0作图软件分析结果。具体实施方式实施例1BSA(BulkedSegregatedAnalysis,分离组群分析法)分析群体的母本是"N"基因的自交系CarolinaWonder;父本是感病自交系茄门；二者杂交获F1代，再自交获F2代。根据抗病性鉴定结果，将F2群体中病级指数最高和最低的极端抗、感植株各选10株，每株取lOOngDNA进行混合，建立抗池和感池。以抗池和感池的DNA为模版，按AFLP方法进行扩增，查找两个池的差异片段，然后以F2群体的个体DNA为模版进行AFLP扩增，探求差异片段在F2群体中的分布。表4显示了F2群体的抗病性鉴定的情况。表4&群体抗病性鉴定情况<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>8()001160002290009()001170002300001000011800023100011251131190()023200012()00120000233000130001216222340001400()122000235000150001230002360001600()124000237148317000125000238000180001263584239176319000]2700024000020()0012800()24200021000129195324300022()0()1300002441723230001310002460002-40()01320()02470002500()3300024800026205313441224900027000135000250()002800013600025100029424137000252000300113800025300031()()()139000254000:200014056214255()00331333141000256003'41883142103225700035()00143000258000367421414400025962237()0014500026000038()0014600026100039(:)0014700026200040()001480002630004(,00149251132640004240941501863265000430()0151000266000.44314415200026746184451873t53000268000■46()0015400026900047(■)00155123327000048()0015613232710004900015700027200050()00158000273173351()0015900027400053000160852275000553114416100()276000560001670002770005700017400027826735800017500027900059()(〕0176()0()28000060000177102522810006100017800028200062000183000283000630()0186651342840006400018700028500066000188000286156367000189000287()00680()01901453288000690()01912163289000701022192000290()007100019300029100072()0019400029200073()001954]229300074()()01960002942483750001970002957123476()00198000296()0077000199305329700078()()020262229800079000203000299000800002043815430000081000205214330100082000206532]43020008311232070003030008455220800030400085125320900030500086()00210000306000870()021100030800088()002120003090008900021300031000092()0021400031100093()0021500031200094()0021600031400095932217412315000%302218000316000<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>将单株2、3、4、5、6、7、8、9、10、12的DNA各100ng混合组成抗病池，将单株29、36、42、55、126、140、186、206、267、295的DNA各lOOng混合组成感病池。用于AFLP分析。AFLP分析1、材料的准备辣椒种子放入65度水中浸泡20分钟，取出后放入28"C的培养箱催芽。播种，育苗土灭菌170度2小时，苗盘育苗，覆土lcm,保持湿度和温度，小苗2叶1芯时，提取DNA。2、DNA的提取提取方法采用CTAB小量法提取。步骤如下(1)取1.51111离心管加入新鲜的嫩叶一片；(2)液氮制冷后研磨成碎沬，加入700ul2%CTAB(2ulBME0.4%)提取液；(3)将离心管置于65。C水洛锅中l.Oh，期间每隔10min轻轻摇动一次。注意样品的量不能太多，否则由于提取缓冲液加入的量太少，细胞裂解不充分；(4)取出后冷却至室温，然后加入700ul氯仿/异戊醇(24:l)轻轻转动摇匀后静置10min;(5)保持4。C下10000rpm离心10min;(6)用宽口枪头缓慢吸取上清液加入到预先加好500ul异丙醇的1.5ml的离心管中，轻轻上下颠倒混匀；(7)保持4。C下10000rpm离心10min;(8)缓慢倒掉全部液体，分两次加入lml70呢的乙醇漂洗DNA,室温放置5min,8000rpm离心5min,弃上清；(9)室温下风干，约2~3h后加入lxTE100ul(lul10mg/mlRNase)溶解DNA;(10)在37"C水浴中保温lh除RNA;(11)取2ulDNA,以XDNA为对照进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度，均稀释为50ng/ul，_2(TC保存用于AFLP分析。3、AFLP分析及反应体系的优化A、基因组DNA的酶切和连接基因组DNA的双酶切和接头的连接釆用一步完成，酶体系为五coM/iVfsel,反应体系如表5所示，37°C下反应8小时。表5辣椒基因组DNA的￡coiI/MseI酶切及连接体系体系组分浓度25ul&'虚20u/ul0.15lOu/ul0.3￡coiI接头5pm/ul1.0M.s-d接头50pm/ul1.0ATPlOmM2.0BufferlOxNECBuffer22.5BSAlOOx0.2T4连接酶6u/ul0.2基因组DNA50ng/ul3H2014.65B、预扩增将步骤l的连接产物，进行预扩增。反应体系如表6所示。表6预扩增反应体系体系组分浓度20ulH2011.1Buffer微PCRReactionBuffer2.0dNTP2mM2.0Mg2+25mM1.2E0050ng/ul0.8MOO50ng/ul0.8TaqE5u/ul0.1模板2引物序列:EOO:GACTGCGTACCAATTCMOO:GATGAGTCCTGAGTAA扩增程序94°C3min;25个循环(94°C30s;56°C30s;72°Clmin),72°C7min补平末端，4。C保存。取5ul预扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。其余预扩增产物稀释30倍，-2(TC保存备用。C、选择性扩增将步骤2的扩增产物稀释30倍后进行选择性扩增，扩增体系如表7所示。表7选择性扩增反应体系体系组分浓度20ulH2010.7Buffer10xPCRReactionBuffer2.0dNTP10mM2.0Mg2+25mM1.2EcoRI引物50ng/ul1.0Msel引物50ng/ul1.0Taq酶5u/ul0.1模板稀释30倍2.0引物序列EcoRI引物5'-GACTGCGTACCAATTCAGA-3，Msel引物5'-GATGAGTCCTGAGTAAAGG-3，扩增程序预变性94°C5min,12个循环(94°C30s;65°C(-0.7°C/cycle)30s;72°Clmin)，25个循环(94°C30s;56°C30s;72°Clmin),72°C5min补平末端，fC保存。D、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将选择性扩增的产物中加入变性上样缓冲液6111(98%甲酰胺、10mMEDTA、0.25%嗅酚蓝、0.25%二甲苯青)，95。C变性5min,然后在冰浴中迅速冷却。在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上釆用恒功率70W电泳lh5min,加样量为5ul。(1)玻璃板的清洗首先用自来水和洗涤灵将长板和短板洗干净，用蒸馏水冲洗板面，晾干。再用无水乙醇将玻璃板再擦拭干净；注意洗板时长板和短板应分开，避免相互污染。(2)涂板将配好的Repel溶液即均勾地涂在短板上，将配好的Binding液均勻地涂在长板上，放置20min以上。在涂板过程中，应避免两种溶液相互污染。Binding便于丙烯酰胺凝胶固定在长板上，Repel易于丙烯酰胺凝胶与短板分离。(3)灌胶将长板和短板装配好，调至水平，检查梳子是否合适，以及梳子插入的最佳位置。最好旁边放一钩子，用于钩出灌胶过程中产生的气泡。取60ml6呢的聚丙烯酰胺胶(根据不同型号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶方式)，300ulAPS和60ulTEMED轻轻混匀，把板的一边垫起一个小角度将胶缓缓的灌入。当胶到底部后迅速将板放置水平，将梳子插入适当位置，并用夹子夹紧，以防点样时漏样。聚合2h以上用于电泳；(4)预电泳将梳子小心拔出，用洗瓶将插梳子的一端清洗干净，然后擦干净玻璃板，将电泳槽装配好后，在电泳槽中加入lxTBE,用纸将电极擦干，以防电泳时短路。在恒功率70W条件下预电泳30min。(不同型号的电泳仪采用不同的恒定功率)；(5)变性将选扩的样品95。C变性5min，然后在冰洛中迅速冷却，使DNA保持单链状态；(6)电泳预电泳结東后，将胶面的气泡及杂质吹打干净，将梳子轻轻插入，其深度为刚进入胶面lmm，点样5ul，恒功率70W电泳lh5min;注意不同型号的电泳槽所使用的最佳恒定功率不同，以电泳时温度保持在6(TC左右为宜，电泳的时间以各条带能均匀区分开为宜。E、银染检测(1)脱色与固定将玻璃板从电泳槽取下，拔出梳子，并轻轻将长板取下，放入2L10%的冰醋酸溶液中，轻轻摇动20-30min，至指示染料消失为宜；(2)漂洗用2L蒸馏水轻轻振荡洗涤2次，每次3min;(3)染色将胶板放入2L染色液中，轻轻振荡30min;(4)显影染色液中取出后迅速在蒸馏水中漂洗一下放入预冷的显影液中，整个过程尽量不超过10s，充分震荡直至条带清晰；(5)固定当条带不再清晰时，将板取出放入固定液即冰醋酸溶液中，终止2min;(6)漂洗将玻板放入蒸馏水中漂洗10min以上，需要保存的板漂洗时间应更长，否则胶面容易变黄；(7)取出后自然晾干，扫描或照相保存。结果发现，E39/M41-527在这两组中存在显著差异。(如图l)用上述方法对所有320个单株进行鉴定，并重复三次，结果稳定。标记中有282株可用，有带株数230株，无带株数52株，交换株数15株，不确定株数26株。(如图2)经Joinmap3.0作图软件分析，遗传距离为6.258cM。(如图3)说明标记E39/M41-527与N基因紧密连锁，以此其可作为辅助抗根结线虫N基因选择的分子标记。实施例2标记E39/M41-527的应用用上述AFLP分析法对有抗有感的282个单株进行人工接种鉴定同时进行DNA标记分析，并重复三次，结果稳定。含有该标记的株数230株，不含标记的株数52株，与抗病结果不符株数15株，准确率94.6。序列表<110>中国农也科学院蔬菜花卉研究所〈120〉W丁'辅助抗根结线虫N基闪选择的分亍标记<130><160>2<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>19<:212>DNA<:213>人l:序列<400>1gactgcgtaccaattcaga19<210>2<211>19<212>DNA<213>人l:序列<:400>2gatgagtcctgagt,gg19权利要求1、用于辣椒抗根线虫N基因辅助选择的分子标记，其特征在于扩增该分子标记的引物具有SEQIDNO.1或2所示的寡核苷酸序列。2、如权利要求1所述的分子标记，其特征在于该标记与N基因的遗传距离为6.258cM。3、权利要求l所述的分子标记辣椒选育中的应用。全文摘要本发明提供了一种可用于辅助抗根结线虫N基因选择的分子标记。本发明利用含“N”基因的自交系CarolinaWonder与感病自交系茄门组建的F2群体，采用人工接种根结线虫，结合BSA和AFLP技术开发分子标记，获得分子标记E39/M41-527。扩增E39/M41-527的引物是如序列表SEQIDNO.1和2所示。通过AFLP分析表明，标记E39/M41-527在抗感池中出现多态性差异，经Joinmap3.0作图软件分析，与N基因的遗传距离为6.258cm。本发明为辣椒抗根线虫N基因提供了选择依据。文档编号C12Q1/68GK101153318SQ20061011353公开日2008年4月2日申请日期2006年9月29日优先权日2006年9月29日发明者张宝玺,毛胜利,王立浩,顾晓慧申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所