产生清洁味道的酶制剂的制作方法

专利名称：：产生清洁味道的酶制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用酶制剂处理底物的方法、新颖的酶制剂和用于制备酶制剂的过程。本发明还涉及乳糖酶。
背景技术：
：酶改善食品级别产物的化学性质、物理化学性质或感官觉(organoleptic)性质的用途是广泛的。在对牛奶和其它动物衍生的底物的加工中，酶的使用使最终产物增加了显著的价值。例子是用乳酸酶孵育使得奶能被乳糖不耐受个体接受，对酪蛋白和乳清蛋白的蛋白水解来减轻变应原性，并促进泡沫特性，使用磷脂酶A2修饰卵磷脂来改善烘焙性能并稳定蛋黄酱，对肉和鱼制品使用转谷氨酰胺酶来改善硬度和弹性，以及通过添加葡萄糖氧化酶从蛋制品或搓碎的乳酪中去除氧。另外，酶处理被用于增强多种动物衍生食品的香味。例如，蛋白酶被用于加速鱼和肉提取物中的香味发生。另外，在乳酪中加速香味发生是公知的目标。尽管EMC(经酶改良的乳酪)是其中最初使用多种脂酶的成熟制品，但是通过添加少量的胞外蛋白酶(exoprotease)、脂酶或酯酶来加速乳酪老化中涉及的细微的味道改变是更近期的发展。本发明还涉及乳糖酶。乳糖酶或j8-半乳糖苷酶(E.C:3.2丄23)是催化乳糖(一种二糖)水解为其组分——单糖葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖存在于乳制品中，更特别地存在于奶、脱脂奶、奶油和其它乳制品中。天然存在的乳糖酶对乳糖的降解发生在人体(和其它哺乳动物)肠壁中。乳糖在缺乏乳糖酶的大部分种群中引起的营养和功能问题是公知的，并且被描述过。这类种群的成员不能够水解乳糖，乳糖在这类情况下进入大肠，在那里导致脱水、弱的钙吸收、腹泻、肠胃气胀、嗳气和痛性痉挛(cramp)，甚至在严重的情况下导致水样爆炸性腹泻(wateryexplosivediarrhoea)0乳糖酶的一种重要的工业应用是生产供乳糖不耐受个体用的、乳糖经水解的乳制品。这类经水解的乳制品包括巴氏灭菌奶、UHT-奶和从其所有或部分的最初组分经过或不经过中间加工步骤(如蛋白质水解)重建的奶。用乳糖酶的处理可以在对奶进行热处理之前或之后进行。可以通过向奶中添加所述酶进行乳糖酶处理。乳糖的可溶性特性使其可导致结晶，导致砂质(sandy)或砂样(gritty)结构。这类不期望的结构可存在于一些乳制品(如炼乳、淡奶、奶粉、冰冻奶、冰激凌)中和具有高乳含量的糖果制品中。乳糖酶对乳糖的完全或部分水解解决了该问题，提供了具有均一质地的制品，且使得消费者更能接受。乳糖酶的另一工业应用是提高含乳糖制品如奶或酸奶中的甜味。这类制品中，乳糖的水解产生了葡萄糖，从而导致甜味提高。乳糖酶的另一工业应用是水解含有乳成分的乳糖制品如面包。将乳糖添加进这类制品中以增加香味、保持水分、提供褐色和改善烘烤特性。在例如增强外皮颜色发生、改善香味和风味、改变结构、延长保质期(shdflife)和增强面包结构的方面，经水解的乳糖糖浆是有希望的。发酵的乳制品(如酸奶)中，通过乳糖酶进行的乳糖水解将增加甜味。然而，当在开始发酵加工前添加乳糖酶时，其可能提高酸发生的速率，从而减少加工时间。对奶或奶衍生制品(如乳清)的乳糖酶处理使得这类制品适用于在针对乳糖不耐受动物(如猫)的动物饲料和宠物饲料中应用。乳糖水解允许制造更高浓度的乳清，同时预防与前文针对乳糖缺陷患者所述相似的肠道问题。经乳糖酶水解的乳清被浓縮，产生含70-75。％固体的糖浆，其被用作为冰激凌、烘焙制品和糖果制品中的食物成分。乳糖酶已经被描述过，其分离自大量生物，包括微生物。乳糖酶通常是微生物如《/w_yveram_ycas禾口万ac/〃w的细胞内成分。《/w;;veram_yc&s和特别是I/ragz'fo和K/acto，和其它酵母如Ca"AJa、7brw/a禾QTbrw/o;^;属的酵母是酵母酶乳糖酶的常见来源，而AcoagM/a^或S">ct//a"s是细菌乳糖酶的公知来源。可以获得来自这些生物的若干种商业乳糖酶制剂，如Maxilact(来自尺/acfc，由DSM,Deflt，荷兰生产)。所有这些乳糖酶是7所谓的中性乳糖酶，因为它们具有pH-6和pH-8之间的pH最适度。若干禾中生物如JwergW/Mm'ger禾口^sperg77ws能够生产细胞夕卜乳糖酷，US专利5,736,374描述了这类乳糖酶的一个例子，其由Aspe/^z7//1^oo^e生产。乳糖酶的特性如pH和温度最适度在物种之间变化。然而，通常，被分泌的乳糖酶显示pH=3.5到pH=5.0的较低pH最适度；而细胞内乳糖酶通常显示在pH=6.0到pH=7.5区域内的较高pH最适度，但是这些一般规则有例外发生。对中性或酸性乳酸酶的选择取决于应用中的pH模式。在中性pH的应用中，中性乳酸酶通常是优选的；这类应用包括奶、冰激凌、乳清、乳酪、酸奶、奶粉等。酸性乳酸酶更适合于在酸性范围内应用。合适的乳酸酶浓度取决于最初的乳糖浓度，所需的水解程度、pH、温度和水解时间。尽管酶处理的目的在于改善食品的功能性和/或味道模式，但是偶然地，酶处理可能具有意外的和不希望的副作用。不希望的副作用的一个例子是酶处理导致的异味的发生。Mettallet.al，TheAustralianJournalofDairyTechnology,(1991)，46-48描述了用乳糖酶处理乳时发生异味的问题。根据该出版物，高水平的蛋白酶会导致异味的快速产生。因此生产操作被最优化，以使得蛋白水解副活性最小化，从而降低异味形成的风险。针对《衍生的乳糖酶的纯化操作的一个例子被描述于WO02/081673中。人们发现，甚至具有低蛋白酶活性的乳糖酶制剂仍然能够引起异味形成。在来自酵母细胞质的中性乳糖酶的情况下尤其如此。与乳糖酶制剂使用相关的异味形成对于乳糖水解的UHT奶来说是特别关键的。用于该情况的乳糖酶是中性乳糖酶，因为它们具有对奶来说良好的pH最适度。UHT奶接受高热处理，以获得室温下若干月的保质期。冰箱外的长时间储存使得这些制品特别容易形成异味即使是非常慢的异味形成速率也能够在几个月的储存后导致显著的异味形成，使得产物对消费没有吸引力。
发明内容目前，我们惊奇地发现，用酶制剂处理底物时，酶制剂中作为污染副活性存在的芳基硫酸酯酶(即便是非常低的水平)能够在产物中导致异味的强烈发生，而使用没有芳基硫酸酯酶活性或有降低的芳基硫酸酯酶活性的酶制剂则导致异味发生的强烈减少。因此，本发明提供了一种工艺，在一个方面，包括用酶制剂处理底物的工艺，其中所述酶制剂基本不含芳基硫酸酯酶。本发明其它方面还提供了基本不含芳基硫酸酯酶的酶制剂。本发明在一个具体的方法还提供了相对于每NLU乳糖酶活性而言包含少于40个单位的芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶。根据本发明的乳糖酶制剂可有利地用于食品和饲料制品中，以水解乳糖，而不形成异味化合物。我们惊奇地发现芳基硫酸酯酶是负责异味形成的决定性酶活性。我们通过对UHT奶添加芳香族硫酸酯酶发现了确定的证据，所述添加导致该单种酶能够模拟通常在乳糖酶处理的UHT奶中观察到的异味。虽然不希望受任何科学理论束缚，但是我们相信芳香族硫酸酯酶对代谢缀合物(尤其是用硫酸酯基团取代的烷基苯酚)的水解是导致异味发生的机制。因此，根据本发明的酶制剂特别有利于处理含有用硫酸酯基团取代的烷基苯酚的底物。发明详述本发明的一个方面提供了相对于每NLU乳糖酶活性而言包含少于40单位芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶。优选地，该乳糖酶相对于每NLU乳糖酶活性而言包含少于30个单位的芳基硫酸酯酶活性，更优选地相对于每NLU乳糖酶活性而言少于20单位的芳基硫酸酯酶活性，最优选地相对于每NLU乳糖酶活性而言少于IO单位的芳基硫酸酯酶活性。芳基硫酸酯酶单位在实施例2中有定义，并针对以NLU表达的乳糖酶活性(也在实施例2中定义)对其进行了标准化。乳糖酶可以是细胞内或细胞外生产的乳糖酶。在一种优选的实施方案中，乳糖酶是细胞内生产的乳糖酶。在一种优选的实施方案中，乳糖酶是中性乳糖酶。中性乳糖酶具有pH=6和pH=8之间的pH最适度。中性乳糖酶制剂通常来自微生物的细胞质。对它们的生产包括微生物的(大规模)发酵，随后是乳糖酶的分离。后者要求破坏细胞壁从而将酶从细胞质中释放。若干种技术已经被用于获得细胞裂解物，包括通过有机溶剂(如辛醇)、超声波处理或弗氏细胞压碎器(FrenchPressing)使细胞壁可透过。除乳糖酶外的其它酶(包括蛋白酶)同时从细胞质中被释放。在一种优选的实施方案中，乳糖酶具有相对于每NLU乳糖酶活性而言少于0.5RFU/分钟的蛋白酶活性。已经针对大量生物(包括微生物)描述了可以根据本发明的方法纯化的细胞内乳糖酶，并从所述生物中分离出来。乳糖酶通常是微生物如K/wverawycas禾卩5ac/〃ws的细胞内成分。《/w7veram少c&s禾Q特另U是K/acto、《marxz'wtw禾口足yhagz'fo，禾口其它酵母如Cawcf/fia、7brw/a禾口7brw/o;^s属的酵母是酵母酶乳糖酶的常见来源，而及co"gw/a朋或S"Vr"/^w是细菌乳糖酶的公知来源。可以获得来自这些生物的若干种商业乳糖酶制剂，如Maxilact⑧(来自《./acto，由DSM生产)。所有这些乳糖酶是所谓的中性乳糖酶，因为它们具有pH=6和pH=8之间的pH最适度。已经针对多个物种描述了细胞内乳糖酶，对它们中的若干种而言，它们的氨基酸序列和/或DNA序列是已知的。序列信息可由公众在序列数据库中获得，例如在GenBank(Bethesda，MarylandUSA)、EuropeanMolecularBiologyLaboratory'sEuropeanBioinformaticsInstitute(EMBL誦BankinHinxton，UK)、theDNADataBankofJapan(Mishima,曰本)禾口theSwissprot(瑞士)中获得。可以根据基因和/或蛋白质序列中的同源性在基因组中鉴定乳糖酶。细胞内酶的粗制剂的特征在于存在若干种仅存在于细胞的细胞质中的酶，例如涉及细胞中心代谢的酶，包括涉及糖酵解的酶。细胞外乳糖酶也已经被描述过。它们通常因为含有称作前导序列的肽序列而被认为是细胞外酶。所述前导序列以某些方式被生产酶的细胞识别为所述酶应当被输送至细胞外的信号。在分泌期间，前导序列通常被去除。已经针对多种物种描述了细胞外乳糖酶，例如oo^"细胞外乳糖酶的粗制剂特征在于不存在细胞内酶并且存在典型的细胞外酶，如蛋白酶。人们发现细胞外酶的种类随生物而不同，它们对于所述生物来说是典型的。因为发酵或加工期间的细胞裂解，故而这类细胞外酶制剂中可存在低水平的细胞内酶。因此，可以根据乳糖酶与其它己知乳糖酶的氨基酸序列比较为基础，将其分类为细胞外或细胞内的。原则上，细胞内乳糖酶可以与前导序列一起提供。这可能导致乳糖酶从细胞中分泌进入培养基。在存在典型的细胞外酶和不存在或以低水平存在典型的细胞内酶时，这类酶的粗制剂的特征将在于基于其氨基酸序列被归类为细胞内的乳糖酶。本发明使用的优选的细胞内乳糖酶为具有http:〃www.ebi.uniprot.org/entry/BGAL—KLULA所述的氨基酸序列的K/acfo乳糖酶，或具有与尺/acto的氨基酸序列至少90%、优选至少95%相同的氨基酸序列的乳糖酶。具有http:〃www.ebi.uniprot.org/entry/Q6QTF4—KLUMA所述氨基酸序列的Km^jdam^乳糖酶，或具有与AT./acto的氨基酸序列至少90%、优选至少95%相同的氨基酸序列的乳糖酶。具有http:〃www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.doproteinId=031341—BACCI&pager.offset=0http:〃www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.doproteinId=Q45092—BACCI&pager.offset=0http:〃www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.doproteinId=Q45093_BACCI&pager.offset=0中所述氨基酸序列的及"Vcw/ara乳糖酶，或具有与5.cz'mz/fl似的氨基酸序列至少90%、优选至少95%相同的氨基酸序列的乳糖酶。术语"同源性"或"相同性百分比"在本文可互换使用。在本文中定义为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的相同性百分比，将序列就最佳比较的目的进行比对(例如可向第一条氨基酸或核酸序列中引入缺口，用于与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的一个位置与第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸一样时，分子在该位置上是相同的。两条序列间的相同性百分比是序列共享的相同位置数的函数(即相同性％=相同位置数/位置总数(即重叠位置)x100)。优选地，所述两条序列是相同长度。技术人员应当明白下述事实可获得若干种不同的计算机程序来测定两个序列间的同源性。例如，两个序列间序列的比较和相同性百分比的测定可以使用数学算法完成。在一种优选的实施方案中，使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列之间的相同性百分比，所述算法已被整合进GCC软件包中的GAP程序中(可得自http:〃www.gcg.com)，其中使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、或4的缺口权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。技术人员应当明白，所有这些不同的算法会产生轻微差异的结果，但是使用不同的算法时两个序列的总体相同性百分比不会显著改变。对细胞内乳糖酶的制备需要破坏细胞以释放乳糖酶。同时，其它细胞质酶被释放。通过副活性对乳糖酶活性的比例来确定乳糖酶工业制剂的品质。特别地，蛋白酶是关键的副酶，因为已知它们将导致应用中不需要的副作用，例如奶中的乳凝块或异味形成。异味形成在具有长保质期并储存于室温下的制品中特别关键。一种这样的制品为UHT奶，异味形成是乳糖酶水解的UHT奶的一个已知问题。UHT奶对异味形成非常敏感；当乳糖酶制剂不在UHT奶中产生异味时，其通常也不在其它应用中产生异味。在奶(特别是UHT奶)中与异味形成相关的化合物与蛋白质水解和Maillard反应二者相关(Valeroetal(2001)FoodChem.72,51-58)。乳糖酶制剂中作为副活性存在的任何蛋白酶可能增强异味形成；需要何种水平的蛋白酶是不清楚的，但是在数月的储存时间下，即便是非常低的蛋白质水解活性也可能是很重要的。UHT奶对异味形成非常敏感；当乳糖酶制剂不在UHT奶中产生异味时，除所述异味以外(如例如Valeroetal(2001)FoodChem.72，51-58中所述)，其通常也不会在其它应用中产生异味。因此，UHT应用是关于乳糖酶制剂的异味潜能评价其品质的一种好方法。因为蛋白酶至少部分地负责异味形成，所以人们已努力降低乳糖酶制品的蛋白酶水平。然而，我们已经发现蛋白酶水平的降低不能导致UHT奶中异味形成的完全去除。我们已经惊奇地发现，芳基硫酸酯酶是负责异味形成的一种决定性的酶活性。我们已经发现了确定的证据向UHT奶中添加芳基硫酸酯酶，这导致该单种酶能够模拟通常在经乳糖酶处理过的UHT奶中观察到的异味。根据本发明，公开了从乳糖酶中去除芳基硫酸酯酶的色谱工艺，所述乳糖酶优选来自《/acto。我们进行了对多种UHT奶样品的详细的感觉分析，所述样品不含有异味或不含有显著水平的异味(实施例1)。这些感觉分析与样品化学组成的详细分析组合起来。若干种化合物被鉴定为关键性香味化合物，它们中的大部分先前已经被描述为与UHT奶相关。令人惊奇的是，对甲酚也被鉴定为关键性的异味化合物。该化合物之前未被描述为UHT奶中的异味化合物(Valeroetal(2001)FoodChem.72，51-58)。其可由芳基硫酸酯酶从其硫酸酯缀合物产生，所述硫酸酯缀合物以非常低的量(ppb水平)存在于奶中(V.Lopez,R.C.LindsayJAgric.FoodChem.(1993),41,446-454;M.Killic&R.C.Lindsay,JDairySci(2005)88，7-12;MKilic&R.C.LindsayJAgricFoodChem(2005)53，1707-1712)。我们惊奇地发现芳基硫酸酯酶是乳糖酶制剂中的一种酶活性，并负责异味形成。我们这样证实了上述内容向UHT奶中添加芳基硫酸酯酶，我们发现该单种酶的确能够模拟通常在乳糖酶处理过的UHT奶中观察到的异味。我们随后开发了一种从乳糖酶中去除芳基硫酸酯酶的色谱方法，所述乳糖酶来自K/flcto。如从品尝小组试验(trialswithtastepanels)中所概括的，我们发现对芳基硫酸酯酶的去除也导致UHT奶中异味形成的去除。最终的乳糖酶产物中芳基硫酸酯酶水平<20单位芳基硫酸酯酶，优选<10单位芳基硫酸酯酶，进一步更优选地<8单位芳基硫酸酯酶，最优选地0单位芳基硫酸酯酶。芳基硫酸酯酶单位在实施例2中有定义，并针对乳糖酶活性对其了标准化，所述乳糖酶活性以NLU表达，并也在实施例2中定义过。已经描述了(例如在WO02/081673中)若干种用于乳糖酶的纯化途径，但是这些纯化方法不旨在去除芳基硫酸酯酶。本文结果显示均来自《/acto的芳基硫酸酯酶和乳糖酶在离子交换(Q-琼脂糖)和疏水性相互作用(丁基-琼脂糖)色谱上具有非常相似的洗脱行为。因此，我们认为，已描述过的现有技术途径不能产生不含芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶制剂。除了降低乳糖酶制剂中芳基硫酸酯酶水平外，还存在从乳糖酶制剂中降低或消除芳基硫酸酯酶活性的其它方式。它们是l)向生长培养基中添加硫酸酯。已知硫酸酯能抑制芳基硫酸酯酶表达(Beiletal.(1995)Eur.J.Biochem.229，385-394)，因此预料到向培养基中添加硫酸酯会降低芳基硫酸酯酶水平；2)使用例如本领域技术人员己知的分子生物学技术，通过随机诱变技术或定点手段，从生物的基因组中消除或打断芳基硫酸酯酶基因，3)筛选和选择是芳基硫酸酯酶活性的天然低生产者或不生产者的菌株，4)添加酶的抑制剂。例如已知某些种类的芳基硫酸酯酶能被磷酸根离子抑制。代谢缀合物如硫酸酯、葡糖苷酸和磷酸盐存在于来自多种物种的奶中，包括牛奶(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41，446-454;Killicetal(2005)JDairySci88，7-12)。代谢缀合是被广泛接受的在哺乳动物中解毒并增强外来物质水溶性的手段。缀合物最有效地由肝和肾形成，它们主要在尿和胆汁中消除之前在血流中循环。己经在来自例如牛、山羊和绵羊的乳中发现了烷基苯酚和多种其它化合物的缀合物(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41，446-454)。代谢缀合物的性质和多样性是非常宽泛的，其包括苯硫酚、苯酚、o-甲酚和p-甲酚。缀合能够导致硫酸、磷酸或葡糖苷酸基团的附着。这些基团可以由酶(如芳基硫酸酯酶、磷酸酯酶和葡糖苷酸酯酶)从缀合物中释放，导致毒素化合物的释放。已经在来自牛、绵羊和山羊的奶中证实了若干类型缀合物的存在；缀合物的相对丰度在制剂之间有所变化，并至少部分是物种相关的(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41,446-454)。在牛奶中，硫酸酯缀合物被证明为是最丰富的缀合物，但是在绵羊乳中，磷酸酯缀合物比硫酸酯更丰富(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41，446-454)。在本申请中展示出存在于奶中的缀合物是中性乳糖酶制剂中副活性的底物。已知这些缀合物的浓度水平对一个物种而言可随时间变化(Kilicetal，(2005)JdairySci88，7-12)和在物种间变化(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem41，446-454)。我们预计，这可能影响对乳糖酶制剂的要求。例如，我们预计，对于山羊奶(其中磷酸酯缀合物非常丰富)而言，对乳糖制剂中磷酸酯酶水平的耐受与将相同的乳糖酶制剂用于牛奶(具有非常低的磷酸酯缀合物水平)的情况相比要低得多。在该方面，细胞内乳糖酶或细胞外乳糖酶制剂之间不存在差异。另一方面，本发明提供了用酶制剂处理底物的工艺。所述酶制剂优选地不含芳基硫酸酯酶。本文使用的基本不含芳基硫酸酯酶的酶制剂可包括下述任何酶制剂，其中不存在或以足够低的水平存在芳基硫酸酯酶活性，所述足够低的水平使得在相关的生产过程中使用有效剂量的期望酶活性时，在所述生产过程中不发生与阴性感官效果相关的(associatednegativeorganolepticeffects)可观察到的烷基苯酚硫酸盐分解。本文使用的基本不含芳基硫酸酯酶的酶制剂可包括下述酶制剂，其中芳基硫酸酯酶活性除以感兴趣的酶活性的比值低于特定值。优选的比值可根据使用的酶和应用变化。芳基硫酸酯酶活性表示如针对EC3丄6.1所述的、能够将苯酚硫酸酯切割为苯酚和硫酸部分的硫酸酯水解酶活性。芳基硫酸酯酶单位的定义在本申请的材料和方法章节(和实施例2)中提供。其它酶的活性也可以参见本申请的材料与方法章节。在本发明的另一方面，本发明提供了包含羧肽酶的酶制剂，所述酶制剂含有相对每单位羧肽酶(CPG)而言少于10000个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。优选地，所述酶制剂含有相对每羧肽酶单位(CPG)而言少于5000个单位、更优选地少于1000个单位、更优选地少于500个单位、更优选地少于100个单位、更优选地少于50个单位、更优选地少于10个单位的芳基硫酸酯酶活性。另一方面，本发明提供了包含脯氨酸特异蛋白酶的酶制剂，所述酶制剂含有相对每单位脯氨酸蛋白酶(PPU)而言少于300*10E3个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。优选地，所述酶制剂含有相对每个蛋白酶单位(PPU)而言少于100*10E3个单位、优选地少于50*10E3个单位、优选地少于10*10E3个单位、优选地少于5000个单位的芳基硫酸酯酶。另一方面，本发明提供了包含(中性)乳糖酶的酶制剂，所述酶制剂含有相对每NLU乳糖酶活性而言少于40个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。优选地，所述酶制剂含有相对每NLU乳糖酶活性而言少于30个单位的芳基硫酸酯酶活性、更优选地相对每NLU乳糖酶活性而言少于20个单位的芳基硫酸酯酶活性、最优选地相对每NLU乳糖酶活性而言少于10个单位的芳基硫酸酯酶活性。另一方面，本发明提供了包含(酸性)乳糖酶的酶制剂，所述酶制剂含有相对每ALU乳糖酶活性而言少于40个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。优选地，所述酶制剂含有相对每ALU乳糖酶活性而言少于100个单位的芳基硫酸酯酶活性、更优选地相对每ALU乳糖酶活性而言少于30个单位的芳基硫酸酯酶活性、更优选地相对每ALU乳糖酶活性而言少于20个单位的芳基硫酸酯酶活性、最优选地相对每ALU乳糖酶活性而言少于10个单位的芳基硫酸酯酶活性。另一方面，本发明提供了包含氨肽酶的酶制剂，所述酶制剂含有相对每APU而言少于1000个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、优选地相对每APU而言少于300个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、优选地相对每APU而言少于100个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、优选地相对每APU而言少于30个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、优选地相对每APU而言少于10个单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。另一方面，本发明提供了包含酯酶和/或脂酶的酶制剂，所述酶制剂含有相对每BGE而言少于10"0E6单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、优选地相对每BGE而言少于3*10E6单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、优选地相对每BGE而言少于1*10E6单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、优选地相对每BGE而言少于300*10E3单位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。用基本不含芳基硫酸酯酶的酶制剂处理底物也可以包括下述底物处理，其中所述处理期间底物中芳基硫酸酯酶低于特定值。另一方面，本发明提供了用酶制剂处理底物的工艺，其中所述处理期间所述底物中芳基硫酸酯酶水平为每升底物至多500*10E3芳基硫酸酯酶单位，优选地每升底物至多250*10E3、优选地至多100*10E3、优选地至多50*10E3、优选地至多25*10E3芳基硫酸酯酶单位。我们发现当底物为奶(优选牛奶)时，将芳基硫酸酯酶水平维持在低于上述值是尤其有利的。基本不含芳基硫酸酯酶的酶制剂也可以包含通过纯化粗酶制剂获得的任何酶制剂，所述粗酶制剂含有感兴趣的酶和芳基硫酸酯酶，其中芳基硫酸酯酶与感兴趣的酶分离。因此，本发明还提供了用于制备酶制剂的工艺，所述工艺包括纯化粗酶制剂，所述粗酶制剂含有感兴趣的酶和芳基硫酸酯酶，其中芳基硫酸酯酶与所述感兴趣的酶分离。该工艺可有利地包括用经纯化的酶制剂处理底物。纯化步骤具有下述效果芳基硫酸酯酶的活性相对于感兴趣酶的活性而言被降低。优选地，所述纯化导致芳基硫酸酯酶活性降低至少50%、优选地至少80%、更优选地至少90%、更优选地至少95%、更优选地至少99°丄技术人员应当明白这应理解为表示优选地(aAs,纯/a^，纯)/(aAs,a/aenz,粗)《0.5、优选地《0.2、优选地《0.1、优选地《0.05、优选地《0.01，其中aAS，=经纯化的酶制剂中芳基硫酸酯酶的活性(单位/ml)aenz，=经纯化的酶制剂中感兴趣的酶的活性(单位/ml)aAS，ffl=粗酶制剂中芳基硫酸酯酶的活性(单位/ml)^-=粗酶制剂中感兴趣的酶的活性(单位/ml)纯化可以以任何合适的方式进行。在一种优选的实施方案中，纯化是通过色谱进行。用于使用色谱纯化酶制剂的工艺是本身己知的。根据存在的相关酶和相关芳基硫酸酯酶活性二者的分子特性，来选择最适当的色谱分离方法。相关分子特性是等电点、疏水性、分子表面电荷分步、相关酶的分子量和副活性以及若干种其它蛋白质化学特征。在选择适当的色谱分离工艺中使用这些特性的实践背景可见于a.o.蛋白质纯化手册(由AmershamPharmaciaBiotech,nowadaysGEHealthcareBio-Sciences,Diegem,比利时出版)。合适的色谱分离方法包括离子交换色谱、亲核色谱、尺寸排除色谱、疏水相互作用色谱等。对本发明而言，离子交换色谱或疏水相互作用色谱是优选的。在一种优选的实施方案中，纯化优选在单一色谱分离步骤中进行。在单一色谱步骤中可以将酶活性有效地与污染的芳基硫酸酯酶活性分离的事实对于本发明工艺的工业应用性来说是尤其有利的。酶制剂可包含任何合适的酶。在一种优选的实施方案中，所述酶(在下文也称作感兴趣的酶)是乳糖酶、蛋白酶、脂酶或酯酶。可以根据本发明使用的酶在下文中公开。用于所有酶的分类和命名的国际公认的流程由IUMB提供。针对EC成员的升级的IUMB文本可参见下述因特网站点-http:〃www.chem.qmw/ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/l1/。在该系统中，酶由它们催化单一反应的事实定义。这意味着若干种不同的蛋白质均被描述为相同的酶，催化多于一种反应的蛋白质被作为多于一种酶处理。根据该系统，蛋白酶可以被再分为内切和外切蛋白酶。另外，存在所谓的二肽基肽酶和三肽基肽酶。内切蛋白酶是水解内部肽键的酶，外切蛋白酶水解与末端a-氨基相邻的肽键("氨肽酶")，或末端羧基和次末端氨基酸之间的肽键("羧肽酶")。内切蛋白酶基于催化机制被分为亚-亚类。存在亚-亚类的丝氨酸内切蛋白酶(EC3.4.21)、半胱氨酸内切蛋白酶(EC3.4.22)、天冬氨酸内切蛋白酶(EC3.4.23)、金属内切蛋白酶(EC3.4.24)和苏氨酸内切蛋白酶(EC3.4.25)。典型地使乳凝块用于乳酪生产的蛋白酶如凝乳酶(EC3.4.23.4)或粘膜胃蛋白酶(EC3.4.23.23)均属于天冬氨酸内切蛋白酶的种类。在内切蛋白酶中，所谓的氨肽酶(EC3.4.1l)能够连续地将单个氨基端氨基酸从蛋白质和肽底物上去除。在外切蛋白酶中，羧肽酶(EC3.4.16,3.4.17和3.4.18)可连续地将单个羧基端氨基酸从蛋白质和肽底物上去除。二肽基和三肽基肽酶(EC3.4.13、3.4.14和3.4.15)可以将二肽或三肽从肽或蛋白质的氨基端侧或羧基端侧切除。在本发明的一个实施方案中，酶是排除天冬氨酸内切蛋白酶(EC3.4.23的蛋白酶。作用于蛋白质或肽和尤其涉及本发明应用范围的其它酶是o)肽酶(EC3.4.19)和能够转换氨基酸侧基团的酶。用于这类转化反应的底物可以是游离的氨基酸或与蛋白质或肽结合的氨基酸。后一类酶的例子是能够选择性水解与蛋白质结合的谷氨酰胺的7酰胺基的酶，即肽-谷氨酰胺酶(EC3.5.1.43和3.5.1.44)。能够交联蛋白质或肽的其它酶如转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13)和蛋白质赖氨酸6-氧化酶(EC1.4.3.13)代表了典型的例子。乳糖酶(EC3.2丄23)是能够分解乳糖的微生物i3-半乳糖苷酶，其与本申请的范围特别相关。脂酶和酯酶与本申请的范围特别相关，因为这些酶通常用于生产EMC's(EnzymeModifiedCheeses),并在加速乳酪老化具有增加的兴趣。因此，脂酶和酯酶是要根据本发明的工艺被纯化的主要候选者。根据IUMB系统，脂酶和酯酶属于羧酸酯水解酶(EC3丄1)。尽管酯酶可作用于广泛的底物，但是脂酶(EC3丄1.3)仅切割三酰基甘油。能够从三酰基甘油上去除甲酸根、乙酸根、丙酸根或丁酸根的脂酶有时也称作"酯酶"。在本申请中，术语"酯酶"是指能够从三酰基甘油上有效地去除这类短链羧酸的酶。两亲酶例如脂酶或酯酶的回收任选地通过使用胆酸或其它食品级别的乳化剂被改善。用于测定脂酶和酯酶活性的方法在材料与方法章节中提供。工业可获得的、食品级别的酶制剂典型地得自哺乳动物组织(例如来自胰腺的胰蛋白酶)或来自植物材料(例如来自番木瓜的木瓜蛋白酶)。在一个优选的实施方案中，酶得自微生物菌株，例如细菌(例如Bacillus的禾中)或酵母(例如Saccharomyces、Kluyveromyces或Pichia)或丝状真菌。已知生产食品级别酶制剂的丝状真菌为例如Aspergillus、Rhizomucor、Rhizopus、Trichoderma禾口Talaromyces。在本发明的实施方案中，酶制剂例如由丝状真菌生产或来自丝状真菌，所述丝状真菌例如为Aspergillusniger或Aspergillusoryzae。本文使用这类酶制剂也包括例如由A.niger或由A.oryzae生产的自我克隆的酶制剂。可以使用真菌由微生物发酵工艺来生产感兴趣的酶，所述真菌生产感兴趣的蛋白酶并优选地将其分泌在发酵液中。在本领域中，这类发酵工艺是已知的，参阅例如WO02/45524。在现有技术的工艺中，也可以通过本领域已知的技术从发酵液中回收酶。第一步，可以通过离心或过滤将生产生物的细胞与发酵液分离。可以通过例如超滤来浓縮不含细胞的发酵液，随后对其进行色谱纯化。真菌菌株典型地生产多于一种芳基硫酸酯酶活性，使得不易在单一步骤中通过色谱从这些芳基硫酸酯酶活性中分离出相关的酶。另一复杂因素是特定微生物分泌的不同的酶活性(即选择的酶活性以及多种芳基硫酸酯酶活性)具有密切接近的等电点。通过色谱分离期望的酶活性和污染的芳基硫酸酯酶活性时，藉此获得的经纯化的酶制剂可以被稳定化。当酶不由微生物分泌而是留在细胞内时，可以通过过滤或离心回收生产微生物，之后可以裂解剩下的细胞以释放相关的酶活性。去除细胞碎片的另一过滤或离心步骤后，可以如上针对经分泌的酶所述浓縮并稳定液体级分。经纯化的和液体的酶制剂可以被浓縮，并与已知的稳定剂(例如甘油或其它多元醇)混合。或者，可通过已知的沉淀和/或蒸发步骤和随后的公知(喷雾)干燥技术从浓縮的酶溶液获得所述制剂。根据本发明，可以用酶制剂处理底物。底物可以是任何合适的底物。优选地，所述底物为蛋白质性底物。蛋白质性底物可以是包含蛋白质的任何底物。在一个优选的实施方案中，底物含有乳蛋白，例如酪蛋白和/或乳清蛋白。优选的底物的例子为奶、乳衍生制品、经发酵的乳制品(例如酸奶)乳清和/或水解产物。底物也可以包含肉。通过蛋白质性底物蛋白质(优选地为动物衍生的底物蛋白质)的酶水解形成的任何产物可以用作水解产物。优选乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和脱脂乳水解产物。在一个优选的实施方案中，底物含有用硫酸酯基团取代的烷基苯酚。垸基苯酚表示其苯酚基团的至少一个芳香质子被替换为烷基。垸基的长度可以变化，并可以是带分支的或被取代的。优选的垸基苯酚为甲基苯酚和乙基苯酚。烷基苯酚硫酸盐表示在羟基上被硫酸盐化缀合的烷基苯酚。芳基硫酸酯酶(EC3丄6.1)是能够将烷基苯酚硫酸盐切割为烷基苯酚和硫酸根部分的硫酸酯水解酶。对底物的处理可涉及其中底物与酶制剂接触的任何过程。处理可涉及其中在存在酶制剂时孵育底物的任何过程。酶制剂可以以任何合适的方式被添加进底物中。所述过程可以是其中生产了制品(例如营养制品，优选地为乳制品)的任何过程。本文使用的乳制品包括含有乳蛋白(例如酪蛋白和/或乳清蛋白)的任何组合物。例子为乳衍生制品、经发酵的乳制品(例如酸奶)、炼乳、淡奶、奶粉、冰冻奶、冰激凌、乳清；和/或乳酪。制品也可以是水解产物。酶制剂可被用于制备任何合适的制品，例如营养制品，优选地为乳制PB口o本发明还涉及根据本发明的酶制剂用于预防或减少异味发生的用途。一方面，本发明提供了生产是芳基硫酸酯酶缺陷型菌株的宿主细胞的工艺，所述工艺包括将生产芳基硫酸酯酶的培养物置于所述培养物部分被修饰的条件下，以形成芳基硫酸酯酶缺陷的宿主细胞，并分离所述宿主细胞。在一个优选的实施方案中使用诱变条件，优选地是随机诱变条件，例如物理或化学诱变。在一个优选的实施方案中，使用重组遗传操作技术，优选地使用一步基因打断、标记物插入、定点诱变、缺失、RNA干扰、反义RNA。本发明还提供了通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括(a)在有益于多肽表达的条件下，在营养培养基中培养芳基硫酸酯酶缺陷型宿主细胞(b)在所述宿主细胞中表达所述多肽，和(c)可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。本发明还提供了通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括(a)用表达载体转化芳基硫酸酯酶缺陷型宿主细胞，其中所述载体表达所述多肽，(b)在有益于所述多肽表达的条件下，在营养培养基中培养所述宿主细胞，(C)在所述宿主细胞中表达所述多肽，和(d)可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。本发明还提供了通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括(a)在禁止芳基硫酸酯酶生产的营养培养基中和在有益于所述多肽表达的条件下，培养宿主细胞(b)在所述宿主细胞中表达所述多肽，和(c)可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收多肽。本发明还提供了通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括(a)用表达载体转化宿主细胞，其中所述载体表达所述多肽，(b)在禁止生产芳基硫酸酯酶的营养培养基中和有益于所述多肽表达的条件下，培养所述宿主细胞，(c)在所述宿主细胞中表达所述多肽，和(d)可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。在一个优选的实施方案中，所述多肽是酶。在一个优选的实施方案中，提供了用于制备酶制剂的工艺，所述工艺包括通过本文公开的工艺来制备酶，并从营养培养基或宿主细胞中回收酶制剂。进一步的公开在下文给出。发酵阻抑在一个优选的实施方案中，可以使用工业宿主菌株来生产酶制剂，所述菌株在限制或禁止生产芳基硫酸酯酶的生长培养基上培养。对Pseudomonasaeruginosa而言，已经描述了在含有过量硫酸盐作为唯一的硫源的培养基上培养之后，不能检测到显著的芳基硫酸酯酶水平，而使用乙磺酸盐作为唯一的硫源则导致生产显著量的芳基硫酸酯酶活性(Beiletal.(1995)Eur.J.Biochem.229，385-394)。因此，可以想到，发酵培养基中硫酸盐的过量也对工业上更重要的微生物中芳基硫酸酯酶活性的生产具有阻抑作用。因此，产酶生物在含有过量硫酸盐作为硫源的培养基中的生长可导致优选的酶制品的生产，所述酶制品具有减少量的芳基硫酸酯酶活性。培养基中过量的硫酸盐是指在微生物的生长完成后发酵液中仍然留有显著量的游离硫酸盐。本发明不要求硫酸盐是生长培养基中唯一的硫源，只要在完全生长期期间，生长培养基中硫酸盐的摩尔量高于任何其它含硫物质的摩尔量即可。另外，可以使用半胱氨酸或硫氰酸代替硫酸盐作为芳基硫酸酯酶活性阻抑中优选的硫源。另外，在洗涤、储存和其它下游加工步骤期间的所有溶液中，具有显著量的硫酸盐或另一阻抑硫源，用于防止发酵液中芳基硫酸酯酶活性的脱阻抑(甚至在发酵结束后)也是适当的。经典的菌株改进可以通过使用重组基因操作技术的遗传工程，或对宿主进行诱变，或二者兼有，来获得芳基硫酸酯酶缺陷菌株。对本发明的芳基硫酸酯酶的编码基因的修饰或灭活可如下进行对亲本细胞进行诱变，并选出下述突变体细胞，所述突变体细胞中表达芳基硫酸酯酶的能力与亲本细胞相比被降低。诱变(其可以是特异的或随机的)可以例如通过使用合适的物理或化学诱变剂、通过使用合适的寡核苷酸、或通过将DNA序列进行PCR产生的诱变来进行。另外，诱变可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行。适用于本发明目的的物理或化学诱变剂包括7或紫外(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲垸磺酸酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。使用这类试剂时，通常如下进行诱变在存在所选的诱变剂时在合适的条件下孵育待诱变的亲本细胞，并选择显示降低的所述基因表达的突变体细胞。或者，可以使用遗传技术(如杂交或交配和原生质体融合或诱导遗传多样性的任何其它的经典遗传技术)来分离这类菌株。随后可通过监测芳基硫酸酯酶的表达水平，选出获得的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株。任选地，随后通过测量要表达的给定的感兴趣基因在宿主细胞中的表达水平，来选出芳基硫酸酯酶缺陷型菌株。可以通过直接测量培养液、培养上清液、通透化的细胞或细胞裂解物中的芳基硫酸酯酶活性，对具有降低的芳基硫酸酯酶活性的菌株进23行选择。为了测量芳基硫酸酯酶活性，可能任选地将工业生产菌株的细胞通透化，用荧光底物(例如4-甲基伞形酮-硫酸酯(MUS))孵育直到底物被细胞吸收，并通过测量荧光的减少筛选具有更低的芳基硫酸酯酶活性的细胞。这类测量可以使用常规的荧光剂在个体培养物中直接进行，或优选地通过流式细胞仪以下述方式进行具有低荧光的细胞可以被选出并用于进一步的培养。这类步骤中使用的细胞可以在与荧光底物孵育之前被诱变或不被诱变。或者，可以通过选择下述菌株来分离具有降低的芳基硫酸酯酶活性的菌株，所述菌株不能在以烷基酯的硫酸酯(例如甲苯基硫酸酯或乙磺酸盐)作为唯一硫源的生长培养基中生长。对根据本发明的合适菌株的分离可能需要应用若干轮经典的遗传技术，特别是在对不是单倍体，而是二倍体、非整倍体或具有不同的倍性的工业生产菌株中，例如许多工业酵母菌株的情况，或是含有编码芳基硫酸酯酶的多个基因的工业生产菌株的情况，例如真菌的情况。重组DNA技术或者，可以使用重组DNA技术来构建具有降低量的芳基硫酸酯酶活性的工业生产菌株。用于基因灭活或基因打断的若干种技术被描述于本领域中，例如一步基因打断、标记物插入、定点诱变、缺失、RNA干扰、反义RNA及其它，并均可用于降低、抑制或打断芳基硫酸酯酶活性的合成，从而获得具有降低的芳基硫酸酯酶活性的工业生产菌株。通过改变指导芳基硫酸酯酶基因表达的调控序列来灭活芳基硫酸酯酶也是本发明的部分。其一个例子是通过基因打断降低启动子活性。可以使用现代遗传修饰技术，来获得重组的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株，优选地通过打断编码芳基硫酸酯酶活性的基因，更优选地通过向编码芳基硫酸酯酶活性的基因中插入标记物，最优选地通过从基因组中去除部分或所有的芳基硫酸酯酶编码区来进行。已经针对许多不同的微生物描述了进行这类基因灭活的方法，这也是本领域技术人员已知的(参阅即EP357127)，并被描述于实施例8中。芳基硫酸酯酶在突变体细胞中的表达可藉此被降低或被消除。根据使用这些技术被修饰的宿主菌株，可以将所述步骤重复数次，以去除所有或大部分的芳基硫酸酯酶编码序列。对宿主基因如芳基硫酸酯酶的修饰或灭活可以通过确定的反义技术，使用与所述基因核苷酸序列互补的核苷酸序列来进行。更特别地，可以通过引入与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列来降低或消除基因的表达，所述被引入的核苷酸序列可以在细胞中被转录并能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，被翻译的蛋白质的量藉此被降低或消除。表达反义RNA的例子由Ngiametal.(Appl.Environ.Microbiol.66:775-782,2000)和Zrenneretal.(Planta190:247-252，1993)提供。对宿主基因的修饰、下调或灭活可以通过RNA干扰(RNAi)技术(FEMSMicrob.Lett.237:317-324,2004)获得。更特别地，可如下降低或消除丝状真菌细胞对基因的表达将表达要被影响的核苷酸序列的相同的有义和反义部分克隆在彼此之后，之间带有核苷酸间隔，将其插入表达载体中，并将所述表达载体引入细胞中，在所述细胞中双链RNA(dsRNA)可以被转录并随后加工为能够与靶mRNA杂交的较短siRNA。dsRNA被转录后，小(21-23)核苷酸siRNA片段的形成会导致要被影响的mRNA的定向降解。特异mRNA的消除可以是多种程度的。可以使用WO2005/05672和WO2005/026356中描述的RNA干扰技术来修饰、下调或灭活宿主基因。已经通过上述任何方法被修饰或灭活，并且使用前文定义的相同测定测量时，在相同的条件下培养时与亲本细胞相比生产更少的芳基硫酸酯酶活性的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株可以具有另一核苷酸序列。通过经典遗传技术或重组DNA技术分离或构建的这类具有降低的芳基硫酸酯酶活性的工业生产菌株可以用于相关的工业工业中，所述工业工艺要求最终产物缺乏异味。优选地，这些菌株被用于生产工业相关的酶。更优选地，这些菌株被用于生产食品工业中使用的酶，进一步更优选地，这些酶被用于加工乳制品。最优选地，具有降低的芳基硫酸酯酶活性的这些工业生产菌株被用于生产乳糖酶。宿主菌株合适的宿主菌株优选地是原核微生物，例如细菌，或更优选地是真核生物，例如真菌，例如酵母或丝状真菌，或植物细胞。来自S""7/^属的细菌非常适合用作宿主，因为它们能够将蛋白质分泌进培养基中。适合作为宿主的其它细菌是来自^w/tom3;cas和尸化i^omoww的细菌。用于表达编码感兴趣的酶的DNA序列的优选酵母宿主细胞是fecdawA^^^一。更优选地，酵母宿主细胞选自SaccWom戸scere由'ae、^7w少vmmyces/acto(也已矢口为A7w_yveraw_yc&smarx/anusvar./acfc)、i/a"se"w/a/o/j7wor/力a、尸/c//a/as/or/j、7iarraiWa禾口然而，用于表达酶最优选地是丝状真菌宿主细胞。优选的丝状真菌宿主细胞选自Js/e尸g///1^、7>7.c/2odenwa、i^i^"n."m、Z)^户oro^7'c/jM淤、Penicil/ium、爿crewowz't/m、7VeM厂c^/ora、7^ermoa5cws、Afyce/io//tora、5^ora/n'c/mm、7Tn'e/aWa禾卩Ta/araw少ces属。更优选地，丝状真菌宿主细胞是ylsp^gZ〃w51o_yzae、J5/ergz'〃M51sq/ae或ylspez-gi〃i^mV^w/<ms的禾中或是来自爿5perg77/as组(如RaperandFennell,TheGenusAspergillus,TheWilliams&WilkinsCompany,Baltimore,pp293-344，1965所定义)的种。这些包括但不限于A/e/^'〃M5wz'ger、y^/e^g〃/iwa丽won'、爿5perg/〃wsw'fifw/aws、爿^ergZ〃t^y"/ow/cw51、爿^ergz'〃two，ae禾卩爿5perg/〃tw_/cwt/m，以及7WcAode厂maree-e/、^Fksarz'w/wgrawZwearw/M、尸em'c/〃/画cA，ogewwm、Jcremow'wma/"6amewse、7Vewms/oracr^ma、Afyce/z'op/itora^zez-mop/n7i/m、5^oro^7'c/wmce〃w/op/zz7w附、Z)z、^orofn'cAwmdz'morp/os/onim禾口77'e/avZa/e/rasWs的禾中。本发明的范围内优选的工业生产菌株的例子是真菌，如^^ergz7/M的种(尤其是EP-A画184,438和EP-A-284，603中所述的)和7WcWe画的种；细菌如的种(尤其是EP-A-134,048和EP-A-253,455中所述的)，牛寺另U是Sac/〃M51swZ)"fc、5ac7'〃ws/z'cAew(/brm^、5acz7/ws謡少/o/一eybc&m1、/^wfitowowos5^cz'es;和酵母例如《/w"eram;;ces的种(尤其是EP-A-096，430中如《/^yveram;;cas/acfc和EP-A-301，670中所述的)，SaccAaram少c&s的禾中如')Sacc/aram^ycescerev/w'ae或尸Zc/n'a;as/on's、//awse打w/aj!o/戸orp/ia、Ca"rfWfl或yiamwifl印o/,.cflo本发明最优选地涉及《/"少vwom;;c^/"cfe对缺乏芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶的生产。适用于以工业设置生产给定多肽或酶的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株已经被分离，其中令人惊奇的是在相同的培养条件下，芳基硫酸酯酶缺陷型菌株生产与它们来源的野生型菌株至少相同量的多肽或酶。优选地，本发明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是在模型反应中检测时(参阅实施例2中的实验信息)，具有少于50。％的可检测细胞内或细胞外芳基硫酸酯酶活性的菌株。更优选地，本发明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是具有少于50%的细胞内芳基硫酸酯酶活性的菌株。更优选地，本发明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是具有下述细胞内芳基硫酸酯酶活性的菌株，在模型反应中检测时，所述活性少于它们来源的野生型菌株细胞内芳基硫酸酯酶活性的25%、优选地少于10%、更优选地少于5%、更优选地少于1%，最优选地在所述芳基硫酸酯酶缺陷型菌株中不能检测到芳基硫酸酯酶活性。在本申请中，K.lactis菌株CBS2359被作为可以在/acto培养物中获得的野生型芳基硫酸酯酶水平的参照，作为可以在K/"cto培养物中获得的野生型多肽水平的参照，和作为可以在《./flcto培养物中获得的细胞内芳基硫酸酯酶活性的参照。芳基硫酸酯酶缺陷型《./acto菌株被定义为在相同培养条件下生产比K/""/s菌株CBS2359更少的芳基硫酸酯酶活性的菌株。优选地，所述芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是在模型反应中检测时，具有比CBS2359的细胞内芳基硫酸酯酶活性的50%更少的《./acfc菌株。更优选地，本发明的芳基硫酸酯酶缺陷型K/^to菌株是具有细胞内芳基硫酸酯酶活性的菌株，所述活性在模型反应中检测时少于它们来源的K/actoCBS2359菌株的细胞内芳基硫酸酯酶活性的25%、优选地少于10%、更优选地少于5%、更优选地少于1%，最优选地在芳基硫酸酯酶缺陷型《./Mto菌株中不能检测到所述芳基硫酸酯酶活性。根据本发明一个优选的实施方案，使用的芳基硫酸酯酶缺陷型K/"cfc菌株已经通过应用本申请中下文定义的方法获得。用于检测多肽的多种系统是技术人员已知的。检测系统包括用于检测多肽或酶活性的任何可能的测定。以举例的方式，这些测定系统包括但不限于基于色度计、光度计、荧光计、浊度计、粘度计、免疫学、生物学、色谱的测定法和其它可用的测定法。优选地，如果生产的多肽是酶，则通过在模型反应(参阅实施例2)中测量其活性来测量生产的活性酶的量。根据另一个优选的实施方案，本发明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株的特征在于下述事实当用包含多肽编码基因的表达构建体转化该菌株时，所述菌株至少生产其来源的野生型菌株在相同的培养条件下会生产的多肽量，所述野生型菌株也已经用与芳基硫酸酯酶缺陷型菌株相同的表达构建体转化。优选地，本发明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是在相同的培养条件下，生产与它们来源的野生型菌株相同量或更多量的给定多肽。更优选地，在相同的培养条件下，芳基硫酸酯酶缺陷型菌株生产比它们来源的野生型菌株更多的给定多肽。其它天然的或异源的多肽和其它序列的生产根据又一实施方案，本发明涉及在宿主细胞中转录核苷酸序列的方法，其中所述被转录的序列编码期望的多肽或者是功能性核酸分子，所述方法包括(a)在营养培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含(i)启动子、(ii)编码多肽的下游核苷酸序列、(iii)翻译终止信号和(iv)转录终止信号，(b)在宿主细胞中表达多肽，和(c)可选地，从营养培养基或宿主细胞中回收多肽。生产的多肽可以对蛋白酶降解敏感。在该情况下，应使用蛋白酶缺陷型的突变体宿主细胞。优选地，根据本发明的方法来生产芳基硫酸酯酶缺陷型的菌株。可以使用本领域已知的方法在营养培养基中生长或维持芳基硫酸酯酶菌株，所述营养培养基适用于生产所期望的多肽。例如，细胞可以被涂布在固体培养基上，在摇瓶中摇动，在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基中和允许多肽表达和/或分离的条件下以小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料分批的或固体状态发酵)培养。培养在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中，使用本领域己知的步骤(参阅例如Bennett&LaSure,eds.，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA，1991)进行。合适的培养基可得自商业供应商或可以使用(例如在美国典型培养物保藏中心的产品目录中)公开的成分制备。如果多肽被分泌进营养培养基中，则多肽可直接从培养基中被回收。如果多肽不被分泌，则其可以从细胞裂解物中回收。可以通过本领域已知的方法来分离得到的多肽。例如，可以通过常规步骤(包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从营养培养基中分离多肽。然后可以通过本领域已知的多种步骤对被分离的多肽进行进一步纯化，所述步骤包括但不限于色谱(例如离子交换、亲合力、疏水、色谱聚焦或尺寸排除)、电泳(例如准备的等电位聚焦)、差异溶解度(例如丙酮或硫酸铵沉淀)或萃取(例如离液剂、盐或pH)。参阅例如Janson&Ryden,eds"ProteinPurification,VCHPublishers,NewYork,1989。可以使用本领域已知对多肽特异的方法检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如，可以使用酶测定来测定多肽的活性。针对许多酶的用于测定酶活性的步骤是本领域己知的。多肽可以是任何多肽，无论其对所述芳基硫酸酯酶菌株来说是天然的或是异源的。术语"异源多肽"在本文中定义为不由野生型菌株生产的多肽。术语"多肽"在本文中不旨在表示特异长度的被编码产物，因此包括肽、寡肽和蛋白质。编码异源多肽的核苷酸序列可以得自任何原核生物、真核生物或其它来源，并可以是合成的基因。本文结合给定来源使用术语"得自"应当表示多肽由所述来源生产或由细胞生产，所述细胞中插入了来自所述来源的基因。期望的多肽可以是抗体或其抗原结合部分、抗原、凝固因子、酶、肽激素或其变体、受体或其配体结合部分、调节蛋白、结构蛋白、报告子、转运蛋白、细胞内蛋白质、涉及分泌过程的蛋白质、涉及折叠过程的蛋白质、陪伴分子、肽氨基酸运载体、糖基化因子或转录因子。多肽可以被细胞外分泌进培养基中。对特定的酶没有限制。优选的酶公开于说明书和实施例的剩余部分。或者，多肽可以是细胞内蛋白质或酶，例如陪伴分子、蛋白酶或转录因子。其一个例子由Puntetal.(Appl.Microbiol.Biotechnol.50:447-454,1998)描述。如果该肽(例如陪伴分子、蛋白酶或转录因子)己知是蛋白质生产中的限制因素的话，这可用于例如促进宿主细胞作为蛋白质生产者的效率。在本发明的方法中，芳基硫酸酯酶缺陷型菌株也可以被用于重组生产对细胞来说是天然的多肽。天然的多肽例如可以如下被重组地生产将编码多肽的基因置于不同的启动子调控下以增强多肽的表达，通过使用信号序列加速感兴趣的天然多肽被运输出细胞，和提高通常由细胞生产的编码多肽的基因的拷贝数。在术语"异源多肽"的范围内，本发明还包括了对细胞来说是天然的多肽的重组生产，包括的程度是这类表达涉及对细胞不适内源的遗传元件的使用，或内源序列元件的使用，所述内源序列元件己经被操作为以通常不发生在丝状真菌细胞中的方式起作用。用于分离或克隆编码异源多肽的核苷酸序列的技术是本领域己知的，并包括从基因组DNA中分离、从cDNA制备，或其组合。在本发明的方法中，异源多肽也可以包括融合的或杂交多肽，其中另一多肽融合在多肽或其片段的N端或C端。通过将编码一个多肽的核苷酸序列(或其部分)与编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合来生产融合的多肽。用于生产融合多肽的技术是本领域已知的，并包括将编码多肽的编码序列连接使得它们符合读码框(inframe)并且融合肽的表达位于相同的启动子和终止子的调控下。杂种肽可包含来自至少两个不同多肽的部分或全部多肽序列的组合，所述多肽中一个或多个可以对突变体真菌细胞是异源的。编码感兴趣的异源多肽的经分离的核苷酸序列可以以多种方式被操作，以提供多肽的表达。表达应当被理解为包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。编码多肽的核苷酸序列被插入载体之前的修饰可以是期望的或必需的，取决于表达载体。使用克隆方法用于修饰核苷酸序列的技术是本领域公知的。编码要生产的多肽的DNA序列可以与适当的DNA调节区可操作地连接，以确保所述DNA序列的高表达水平，以及优选地所述多肽的高分泌水平。如果待生产的多肽对所述芳基硫酸酯酶缺陷型菌株来说是天然的，则优选使用其天然的分泌信号。或者，如果待生产的多肽对芳基硫酸酯酶缺陷型菌株不是天然的，则优选制造融合构建体，即所述融合构建体包含与待表达的异源基因融合的A^w&7/mw/gw的葡萄糖淀粉酶基因。根据本发明一个优选的实施方案，使用^^wp7/船o^zm的a葡萄糖淀粉酶基因的调节区。根据本发明的一个更优选的实施方案，使用A的葡萄糖淀粉酶基因的调节区。根据本发明的一个更优选的实施方案，使用K乳糖酶基因的调节区。DNA构建体也可包含可选择的标记物。或者，可选择的标记物可存在于第二个DNA构建体上。通过举例的方式，这些标记物包括但不限于amdS(乙酰胺酶基因)，营养缺陷型标记物基因如argB、trpC或pyrG和提供针对例如腐草霉素、潮霉素B或G418的抗性的抗生素抗性基因。优选地，标记物基因是来自J^erg"/wm^/fo朋的乙酰胺酶基因。更优选地，来自m'^/a似的乙酰胺酶基因与gpdA启动子融合。更优选地，来自^s/^^7/mm'山/a朋的乙酰胺酶基因与5^cc/wram_ycescerew'w'aeADH1启动子融合。我们开发了一种用于获得芳基硫酸酯酶缺陷型菌株的方法，所述菌株适用于生产高产量的多肽并可用作工业设定中的多肽生产者。所述多肽对所述芳基硫酸酯酶缺陷型菌株来说可以是同源的或异源的。在异源多肽或酶的情况下，应用本发明方法的野生型菌株可以被较早地转化，以表达编码说明书中较早描述的这类多肽或酶的基因。这类芳基硫酸酯酶缺陷型菌株至少生产它们来源的野生型菌株在相同的培养条件下生产的多肽量。或者，芳基硫酯酶缺陷型菌株的构建可以在用下述基因转化之前进行，所述基因编码说明书中较早描述的这类多肽或酶。根据本发明的一个实施方案，因此，在具有降低的芳基硫酸酯酶表型的本发明的宿主细胞中生产多肽，所述细胞是亲本细胞的突变体，所述亲本细胞适用于生产适用于食品工业的酶，其中所述亲本细胞包含编码芳基硫酸酯酶的一个或多个核苷酸序列，而在相同的条件下培养时突变体细胞产生比亲本细胞更少的芳基硫酸酯酶活性。本发明一方面公开的优选的特征也适用于本发明的其它方面。本发明现在将根据以下的实施例阐述但不受其限制。图例图1:在TOPO载体中克隆尺/"c&芳基硫酸酯酶基因的5，-侧翼图2:在TOPO载体中克隆K/acto芳基硫酸酯酶基因的3'-侧翼图3:在TOPO载体中克隆缺乏SacII位点的《./ac^芳基硫酸酯酶基因的3'-侧翼图4:将5'-侧翼和amdS选择盒组合在一个质粒中图5:将3'-侧翼和amdS选择盒组合在一个质粒中图6:芳基硫酸酯酶敲除构建体的最终构建图7:显示使用Dabcyl-Edans作为底物的内切蛋白酶谱。材料和方法活性测定芳基硫酸酯酶:使用p-硝基苯硫酸酯(得自Sigma)作为底物测定芳基硫酸酯酶活性。为了进行活性测量，将0.5ml底物溶液(100mMNaPi缓冲液，pH6.5中20mMp-硝基苯基硫酸酯)与含有芳基硫酸酯酶活性的0.5ml样品溶液混合。将溶液在37'C孵育3小时。然后通过添加1.5ml0.5MNaOH终止反应。针对空白实验测定410nm处的OD(lcm光路长度)，所述空白实验中添加水代替样品溶液。制备一种溶液作为参照，所述溶液中在用NaOH终止反应后添加酶。从酶有活性三小时的溶液测定的0D4K)中减去该参照溶液的OD41Q。芳基硫酸酯酶单位(ASU)被表示为OD41Q*10E6/hr的改变。对于液体产物而言，芳基硫酸酯酶活性可以被表示为每ml产物的OD4H)"0E6/hr的改变。对固体产物而言，芳基硫酸酯酶活性可以被表示为每g产物的OD41。*10E6/hr的改变。当感兴趣的酶的活性已知时，芳基硫酸酯酶活性也可以被表示为每个单位感兴趣的酶活性的OD4H^10E6/hr的改变。活性测定酸性乳糖酶:在pH4.5和37'C下将酸性乳糖酶与o-酰基苯基-Z3-D-半乳糖吡喃糖苷(Fluka73660)孵育15分钟，产生o-硝基苯酚。通过添加10%的碳酸钠终止孵育。在420nm波长下测量产生的o-硝基苯酚的消光系数，并定量酸性乳糖酶活性。一个酸性乳糖酶单位(ALU)是在测试条件下每分钟生产1微摩尔o-硝基苯酚的酶的量。活性测定脯氨酸特异的内切蛋白酶:对来自A/^gz7/w"Zgw的脯氨酸特异的内切蛋白酶的过量生产和色谱纯化如WO02/45524中所述完成。使用CBZ-Gly-Pro-pNA(Bachem，Bubendorf，瑞士)作为底物，在37。C下拧檬酸/磷酸二钠缓冲液，pH4.6中测试Am'gw脯氨酸特异的内切蛋白酶活性。在405nM处分光光度计监测反应产物。405nm处吸光度随时间的提高是对酶活性的一个度量。在完全相同的条件下测定具有接近中性pH最适度的脯氨酸特异的内切蛋白酶的活性，但是在该情况下，该酶反应在pH7.0进行。在对脯氨酸特异的内切蛋白酶(具有接近中性pH的最适度)特异的条件下测定脯氨酸特异的二肽肽酶如DPPIV的活性，但是在该情况下使用Gly-Pro-pNA作为底物。脯氨酸蛋白酶单位(PPU)被定义为在特定的条件下和0.37mM底物浓度下，每分钟释放1pmolp-硝基苯胺的酶量。活性测定羧肽酶:来自A的羧肽酶PepG("CPG，，；DalDeganetal.,Appl.Env.Microbiol.58(1992)2144-2152)的活性使用合成的底物FA-Phe-Ala(Bachem,Bubendorf,瑞士)作为底物确定。该底物的酶水解(1.5mMFA-Phe-Ala，在pH4.5和37。C下)导致吸光度的降低，所述吸光度在340nm的波长下监测。一个单位(CPGU)是在测试条件下每分钟将340nm处的光密度降低一个吸光度单位所需的酶的量。活性测定氨肽酶。使用合成底物X-pNA来测定氨肽酶的活性，所述合成底物中pNA表示p-硝基苯胺，'X'表示氨基酸残基。因为不同的氨肽酶可能具有不同的选择性，因此氨基酸残基'X'的性质取决于测试的氨肽酶活性的切割偏好。因此，'X'表示特异的氨肽酶具有最高偏好的残基。因为许多氨肽酶对Phe显示最高反应性，所以Phe-pNA代表了优选的底物。多种X-pNA底物可得自Bachem(Bubendorf，瑞士)。该底物的酶水解(1.5mM，在pH6.5和37'C下)导致颜色发生，所述颜色发生在410nm的波长下被监测。一个单位(APU)是在测试条件下每分钟将410nm处的光密度提高一个吸光度单位所需的酶量。活性测定酯酶/脂酶:酯酶和脂酶催化游离脂肪酸从三甘油释放。在本测定中，使用三丁酸甘油酯用作底物。为了确定酯酶/脂酶活性，用氢氧化钠将从三丁酸酯释放的丁酸滴定至7.5的恒定pH。因此，为了维持pH恒定而在每个时间单位中使用的氢氧化钠的量与酶样品的酯酶活性成正比。使用辐射计pH-stat单元和以下的试剂进行测量。阿拉伯胶溶液在温和搅拌下，在1L容量瓶中将100g阿拉伯胶(Sigma)和500mgThymol(ICN)连续溶解在约800ml去矿质水中。用水补充至一升并混合。将溶液在4000rpm离心15分钟。得到的阿拉伯胶溶液可以在冰箱中保存2个月，但是应当在使用前至少一天制备。氢氧化钠0.02mol/l:将含有0.01mol/LNaOH的安瓿内含物定量地转移进含有水的500mL容量瓶中。用水补充至体积并混合。SDS/BSA溶液在温和搅拌下，将1gSDS(Merck)和1gBSA(fractionV，Sigma)溶解在约40mL水中。防止形成泡沫。在SDS和BSA完全溶解后用水将体积补充至1升。仅使用新鲜制备的溶液。底物乳剂在600mL玻璃烧杯中称重50g甘油三丁酸酯，并添加300mL阿拉伯胶溶液。通过用UltraTurmx以最大速度搅拌5分钟制备乳剂。用NaOH0.5mol/L将pH调节至7.5。为了测试具体酶样品的酯酶/脂酶活性，称重约1g酶样品并溶于SDS/BSA溶液中。该样品溶液应当具有等于约0.2到0.8NBGE/ml的最终酶含量(参阅其它)。将样品溶液置于冰上直到测量开始。通过将以下溶液依次转移进入加热的反应器中进行测量20mL底物乳剂、5.0mL水(在40'C预热)并允许预热15分钟，然后通过添加5.0mL的对照样品或样品溶液开始测量，并开启辐射计pH-stat单元的VIT90酯酶程序。酯酶/脂酶单位(NBGE)被定义为在4CTC的温度下和pH7.5下，在以下的步骤中每分钟从甘油三丁酸酯释放1/miol游离脂肪酸的酶量。实施例实施例1鉴定UHT奶中的异味化合物在无菌条件下将MaxilactLG5000(DSM，荷兰)添加至半脱脂的UHT奶(FriescheVlag,荷兰)中，达到每升10,000和40,000NLU的水平，并在室温下孵育4天。在参照实验中不添加Maxilact。通过品尝小组评估样品之前，通过每升半脱脂乳添加40,000NLU并在室温下孵育18小时来制备新鲜的乳糖酶水解的奶样品。在NIZOFoodResearch(荷兰)使用SOIR步骤进行样品分析，所述SOIR步骤是NIZOFoodResearch的常用步骤，其包括感觉和化学分析。直接在制备好的样品上进行感觉分析，并将每个乳样品的等分试样以小部分冰冻在一25C下，以用于进一步的化学分析。通过9名成员的受过培训的小组进行感觉分析。参照样品被描述为煮过的，其它样品被归类为不标准的UHT奶。描述异味的主要属性为化学的、药的、尿/不洁的和稳定的/粪便。在接近室温时用同时高真空蒸馏分离挥发性化合物，产生样品的水样提取物。然后使用动态顶空法(dynamicheadspace)将挥发性化合物从水样提取物中分离，并在吸附剂上收集。使经分离的化合物进入利用热解吸附的气相色谱中并在GC柱上分离。由两个受过训练的鉴定者评价GC流出物(GC-嗅觉)并以气味术语描述(嗅觉检查法)。通过在动态顶空取样期间使用两种不同的吹扫时间(30分钟和24小时)进行一式两份的高浓度和低浓度GC嗅觉分析。随后通过质谱法鉴定了在嗅觉测量分析期间显示的峰(化合物)，所述峰对应于乳糖酶处理的UHT样品的异味特性。可解释异味原因的感兴趣的化合物被鉴定为l)酯(丁酸乙酯)；2)硫化合物(二甲基硫化物、二甲基三硫化物和苯并噻唑)；3)硫酯(硫代乙酸甲酯、硫代丁酸甲酯)；4)1-辛烯-3-醇；5)2-壬烯醛；6)1>大马烯酮(1>damascenone);7)冰片和8)p-甲酚。p-甲酚可来自乳中的缀合物。与最讨厌的感觉属性"药物"相关的唯一化合物为p-甲酚。使用GC分析，通过向样品中添加标准量的p-甲酚来测定样品中的p-甲酚浓度。UHT奶样品(4天孵育)中p-甲酚的浓度被评估为每升12/xg。这明显高于空气和水分别为1ppb和2ppb的香味阈值(Haetal，(1991)JDairySci74,3267-3274)。这还在通常存在于牛奶中的p-甲酚浓度范围内。结果被奶中的重组实验证实，证实p-甲酚会带来经乳糖处理的UHT奶中的药物异味。实施例2测定芳基硫酸酯酶和/3-半乳糖苷酶活性。使用p-硝基苯硫基(得自Sigma)作为底物测定芳基硫酸酯酶活性。为了活性测量，将0.5ml底物溶液(100mMNaPi缓冲液，pH6.5中20mMp-硝基苯基硫酸酯)与含有芳基硫酸酯酶活性的0.5ml样品溶液混合。将溶液在37-C孵育3小时。然后通过添加1.5ml0.5MNaOH终止反应。针对空白实验测定410nm处的OD(lcm光路长度)，所述空白实验中添加水代替样品溶液。制备一种溶液作为参照，所述溶液中在用NaOH终止反应后添加酶。从酶有活性三小时的溶液测定的0D41Q中减去该参照溶液的0D41Q。硫酸酯酶单位被表达为0D41()*10E6/hr和每NLU的改变。如下文所述测定样品溶液的乳糖酶活性。使用硝基苯基-b-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)作为底物，根据FCC(fourthed，July1996,p801-802:Lactase(neutral)jS-galactosidaseactivity)中所述的步骤将乳糖酶活性测定为中性乳糖酶单位(NLU)。实施例3向UHT奶中添加芳基硫酸酯酶使用可商业获得的芳基硫酸酯酶(Sigma,Aerobacteraerogenes,typeVI;4.9mg蛋白质/ml;Sigma定义的3.9芳基硫酸酯酶单位/mg蛋白质)在乳中进行异味测试。在该实验中，将50mlUHT奶(Campina,荷兰)与1ml酶溶液在3(TC孵育。异味发生后闻嗅样品。典型的异味(其也在实施例1中针对用乳糖酶孵育过的UHT奶描述过)在2小时的孵育后明显是可观的。孵育17小时后该气味更加强烈。显然，芳基硫酸酯酶产生了与乳糖酶相似的异味。根据实施例1中所述发现，这可通过乳中从缀合物p-甲苯基硫酸酯中释放了p-甲酚来解释。也进行了下述实验，其中添加酸性磷酸酯酶(小麦胚，Sigma,40ml乳中如Sigma定义的6个磷酸酯酶单位)或葡糖醛酸糖苷酶(来自五.co/Z，Sigma，每40ml乳中如Sigma定义的6350个葡糖醛酸糖苷酶单位)代替芳基硫酸酯酶。在这些孵育中未发生典型的异味。这提示了硫酸酯缀合物是牛奶中异味形成最为重要的缀合物，这与文献发现一致(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41,446-454)。结果不完全排除其它异味化合物的存在，所述其它化合物可由葡糖醛酸糖苷酶或酸性磷酸酯酶产生，但是显然这些化合物没有达到高于香味阈值的水平。实施例4异味测试UHT奶步骤将半脱脂的UHT奶(Campina，荷兰)与20,000NLU/L乳在3(TC孵育48小时。通过无菌滤器在无菌条件下添加乳糖酶，以防止细菌感染。48小时后由训练过的小组品尝乳，并与在相同条件下孵育但未添加乳糖酶的乳溶液比较。简言之，通过在品尝之前添加5000NLU/L奶并在30'C孵育2小时来制备参照溶液。该甜奶被品尝小组用作参照溶液。小组如下对异味计分空白乳设定为'-'。含有可注意到的但是轻微异味的低异味产物给予，+，，而含有更高量异味的产物被表达为'++'或'+++'。'+++'的标记指示高水平的异味，感觉到非常让人讨厌。用于表征异味的术语与实施例1中公开的相同。实施例5纯化Klactis乳糖酶去除芳基硫酸酯酶活性。将可商业获得的K/acto乳糖酶MaxilactLX5000(DSM，荷兰)用水稀释10倍，并应用于在55mMKPi(pH7.0)中平衡的Q-琼脂糖柱(AmershamBiosciences)上。持续上样直到在柱的流出液中检测到乳糖酶活性。然后用4倍体积的55mMKPj(pH7.0)洗涤柱，随后用含有0.16MNaCl的65mMKPi(pH7.0)洗脱乳糖酶。收集级分并测试乳糖酶活性。合并含有乳糖酶的级分，并上样于在含有1MNaS04的55mMKPj(pH7.0)中平衡的丁基琼脂糖柱(AmershamBiosciences)上。在存在1MNaS04(pH7.0)时将乳糖酶上样在柱上直到在柱的流出液中检测到乳糖酶。用4倍体积的含1MNaS04的55mMKPi(pH7.0)洗脱柱。使用15倍体积的inear梯度洗脱乳糖酶，所述梯度从含1MNaSCU的55mMKP;(pH7.0)到55mMKPi(pH7.0)。通过UV检测(280nm)监测洗脱谱。收集级分并测定乳糖酶活性。将含乳糖酶的级分合并，省略在乳糖酶峰值(OD280nm)降低至最大峰值50%后收集的级分。这些级分的省略对于防止乳糖酶制剂被芳基硫酸酯酶污染是关键性的。乳糖酶的洗脱部分与芳基硫酸酯酶的洗脱重叠。通过超滤，在10k道尔顿滤器上将产物浓缩和脱盐，并通过添加甘油至50%w/w来保存。实施例6经纯化的乳糖酶中的蛋白酶水平使用具有通式Glu(EDANS)-Ala-Ala-Xxx-Ala-Ala-Lys(DABCYL)的一系列底物测定蛋白酶活性。(Xxx:20个天然氨基酸之任一)。底物得自PEPSCAN(Lelystad,荷兰)，并且是内部淬灭的荧光底物。当这类肽底物被切割时，产生荧光信号。因此，荧光的出现表示存在内切蛋白酶活性。通过向200Ml下述溶液中添加50/il酶在96孔微孔滴定板中测定内切蛋白酶活性，所述溶液含有100mMTris-Bis(pH6.7)中50的底物。将反应混合物于4(TC在使用Magellan4软件的TECANGenius微孔滴定板读数器中孵育10分钟。随时间跟踪荧光的发生(激发滤光片340nm，发射滤光片492nm)。蛋白酶活性被定量为荧光线的斜率，其被表达为RFU/分钟/NLU。(RFU:相对荧光单位，如Genius装置所给出的)。如实施例2所述测定酶样品的NLU单位。图7显示了在Q-琼脂糖柱上纯化LX5000时蛋白酶活性的巨大降低。Q-琼脂糖后合并的级分(实施例4)具有与初始材料(LX5000)相比低至少5-10倍因数的蛋白质活性。对使用的每种底物的RFU/分钟/NLU<0.5的乳糖酶样品(见图1)被定义为具有低水平蛋白酶活性的制剂。，实施例7未经纯化的和经纯化的乳糖酶的比较对若干种乳糖酶制剂进行实施例4中所述的异味测试。乳糖酶制剂的芳基硫酸酯酶含量不同。对于每种制剂而言，至少使用两个样品；个体样品在芳基硫酸酯酶活性上不同，活性范围在表1的右列中指出。异味测试的结果在表1中给出。明显地，芳基硫酸酯酶的活性水平与异味形成相关，低水平的芳基硫酸酯酶(19或更少，见表1)不引起异味形成，而提高的水平导致增加的异味形成。还很明显的是Q-琼脂糖后的乳糖酶制剂仍然显示异味发生，尽管蛋白酶水平较低(见实施例5)。表1:多种乳糖酶制剂的异味发生。h具有高芳基硫酸酯酶活性的级分，选自实施例4中所述Q-琼脂糖洗脱级分。2:8个芳基硫酸酯酶单位(如实施例2中所定义的)的水平是测定的检测界限。<8表示未观察到芳基硫酸酯酶活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>乳糖酶实施例8含有芳基硫酸酯酶活性的不同商业酶制剂从不同来源生产并通过不同加工途径回收的多种酶制品被收集，并使用材料与方法章节中所述的测定法分析其芳基硫酸酯酶活性。获得的结果(见表2)表明得自多禾中微生物如^s/erg/〃t^o^zae、X/t/jveramjces/^/^a""rn的酶制剂能够被芳基硫酸酯酶活性严重地污染。这些酶制剂可有利地通过本发明的方法被纯化。表2多种商业酶制剂中的芳基硫酸酯酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>实施例9使用离子交换色谱从来自Jwerg/〃wm'ggr的脯氨酸特异蛋白酶中色谱去除芳基硫酸酯酶活性为了从Aw/gw分泌的脯氨酸特异的内切蛋白酶(WO02/046381)中去除芳基硫酸酯酶副活性，筛选了大量的色谱树脂。因为发现蛋白酶和主要的由A"/gw分泌的芳基硫酸酯酶活性的等电点分开约0.5个pH，所以对允许两种活性被可接受地分离，甚至是在大规模、工业条件下的色谱分离的确定是相当苛求的。最后，选择了阳离子交换SP琼脂糖6FF和疏水相互作用(HIC)树脂丁基琼脂糖6FF(AmershamBiosciencesEurope)用于进一步测试。两种树脂均在Tricom5/100柱(CV二2，2ml)中被测试，其中使用受UNICORN3.20控制的AKTAExplorer100或受UNICORN3.21控制的AKTAPurifier与FRAC-950级分收集器的组合来进行。洗脱后使用材料与方法章节中所述的方法，针对所有产生的级分检测脯氨酸特异性内切蛋白酶活性和芳基硫酸酯酶活性。表3:进行SP-琼脂糖-6FF色谱的条件:<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>将对产色肽Z-Gly-Pro-pNA(Bachem，Bubendorf，瑞士)显示脯氨酸特异活性的级分合并后，比较粗酶制剂和经色谱纯化的酶制剂的芳基硫酸酯酶活性。结果是在显示确切相同的脯氨酸特异活性(9PPU/ml)的制剂中，芳基硫酸酯酶活性从粗制剂中的3800*10E3单位/ml被降低至经色谱纯化的制剂中的少于30*10E3单位/ml。实施例10使用疏水性相互作用色谱从来自Aspergillusniger的脯氨酸特异蛋白酶中去除芳基硫酸酯酶活性在以下条件下进行HIC色谱法。使用具有10PPU/ml活性的来自A.niger的脯氨酸特异内切蛋白酶的透析滤过物作为初始材料。用含有2MNa2S04(pH4.2，G=121mS/cm)的20mM柠檬酸缓冲液对该透析滤过物稀释两倍，随后在上样于柱上之前通过过滤(0.2pm)灭菌。表4:进行实施例10的纯化的条件。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>作为将酶上样在柱上后显著拖尾的结果，需要长洗涤步骤来获得基线分离。最后，可以用缓冲液B从柱上洗脱脯氨酸特异的内切蛋白酶。合并含有脯氨酸特异的蛋白水解活性的级分。尽管被稀释了，但是如果计算回原始的蛋白水解活性的话，该经纯化的材料仍显示显著降低的芳基硫酸酯酶活性，这表明，使用该疏水相互作用色谱方案将脯氨酸特异的蛋白酶活性和芳基硫酸酯酶活性有效地分离。此处还展示出在显示确切相同的脯氨酸特异活性(9PPU/ml)的制剂中，芳基硫酸酯酶活性从粗制剂中的3800*10E3单位/ml被降低至经色谱纯化的制剂中的少于30*10E3单位/ml。实施例11经纯化的来自A.的脯氨酸特异内切蛋白酶产生酪蛋白水解产物而无异味为了测试经色谱纯化的脯氨酸特异内切蛋白酶的性能，使用经色谱纯化的和未经色谱纯化的脯氨酸特异内切蛋白酶，在完全相同的方案中制备两种酪蛋白水解产物。向含有100g/L酪蛋白酸钠(MurrayGoldbem,新西兰)和水的溶液中，添加枯草杆菌蛋白酶(Protex八L;25毫升/克蛋白质)并在6(TC下和不经调节的pH中孵育4小时。形成的沉淀在搅拌时缓慢溶解。最后，获得带有小量沉淀的澄清溶液。然后将溶液的pH调节至pH4.5，并将液体等体积分开。向这些体积之一添加每克酪蛋白水解物1PPU的粗Aw&w脯氨酰内肽酶；向另一体积中添加1PPU的经色谱纯化的Am'gw脯氨酰内肽酶。孵育在55T:持续9小时，然后对两个溶液进行10kDa的超滤。在进一步热灭活步骤(120°C,5秒)和冷却周期后，由5人小组评价两种液体的味道和气味，所述5人受过对乳水解产物中的异味和臭气味进行检测和分级的训练。该小组在其结论中是一致的用粗脯氨酸特异的内切蛋白酶制备的水解产物具有特征性的、"家禽样"("bam-like")的气味和用经色谱纯化的脯氨酸特异内切蛋白酶制备的制剂中缺少的味道。表5:实施例ll和13的结果概括<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>实施例12色谱法从来自J幼^gz7/^m'g^的羧肽酶中去除芳基硫酸酯酶活性因为羧肽酶(i.e.p.4.5)和主要的由A.niger分泌的芳基硫酸酯酶(5.0和5.4的i.e.p.'s)密切接近，因此色谱分离这两种酶证实是非常困难的。然而，以下的步骤允许我们获得不含芳基硫酸酯酶活性的纯净羧肽酶。最为重要的是该方法相对简单，从而其可以以工业规模进行。再次使用SP-琼脂糖FF树脂。在以下条件下进行色谱法表6:进行实施例12的色谱法的优选的条件<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>将粗酶应用于柱上后，用缓冲液A洗涤柱，以去除未结合的/轻微结合的污染物。最后，用缓冲液B洗脱羧肽酶。收集含有对生色肽FA-Phe-Ala-OH(Bachem，Bubendorf，瑞士)水解的活性的峰。在含有相当的羧肽酶活性(2060CPG/g;见材料与方法中对活性的定义)的羧肽酶制剂中，芳基硫酸酯酶活性从粗酶中的31200*10E3单位/ml降低至经纯化的制剂中的10*10E3单位/ml。实施例13来自A.iiiger的经纯化的羧肽酶加速Goiida乳酪的老化而不产生异味。对将奶去标准化，并从NIZO收集。使用NIZO方法制造Gouda乳酪。大致为初始添加后，搅拌15-20分钟。然后添加粗制凝乳酶(reimet)，搅拌3分钟并静置(约45-50分钟)。使用渐进的增加标度(gradualincrease)切割凝块。这会耗费10分钟并具有8.5的最终速度。转动叶片并以11的速度再搅拌IO分钟。排水直到桶中剩余120L。在55。C添加36L(剩余体积的30%)水以达到桶中35.5-35.7°C的最终温度，同时以16的速度搅拌。以16的速度搅拌60分钟。收集凝乳并静置15分钟。将凝乳分装于模子(重量)上，并将填充好的模子静置30分钟。在0.7bar按压30分钟(第一次按压后添加乳酪编码(code))，1.2bar按压30分钟，然后在1.7bar再按压30分钟。每次按压后翻转凝乳。按压后去除压力并将乳酪在模子中静置(在盐水室中于13"C下过夜)。将乳酪从模子中取出并进入盐水中30个小时并翻转两次以确保均一的盐水浸泡。在13°C、88%湿度下熟化。该方法标准化为1.05的脂肪比蛋白质比例(等于约0.85的脂肪对酪蛋白)。巴氏灭菌后，将乳泵进200L乳酪桶中。使用Delvo-TECUX21A(1.5U;DSMFoodSpecialities,Delft,荷兰)作为初始培养物和Maxiren600(55IMCU/Lmilk;DSMFoodSpecialities,Delft,荷兰)作为粗制凝乳酶。将乳酪在盐水中浸泡26小时并在13°C、88%RH下熟化。经纯化的和未经纯化的PepG与粗制凝乳酶一起以200CPGU/升乳的水平添加。在6周和24周的熟化后，由内部小组对来自每个乳酪桶中的代表性乳酪样品分级。这些会议以圆桌的模式进行，这意味着分级者被告知试验的细节，然后讨论他们的发现，所述发现随后被总结。表7:实施例13的结果6周(n=7)对照年轻的Gouda乳酪，无异味，少量酸味和黄油味经纯化的PepG更成熟的Gouda乳酪，农舍类型味道，强烈气味和更饱满的气味。未经纯化的PepG类似经纯化的PepG乳酪，仅味道中和品尝后有苦味记录表8:实施例13的结果24周(n=6)对照成熟的Gouda乳酪，有点咸经纯化的PepG具有强烈味道的乳酪，接触到甜味未经纯化的PepG非常辛辣味道的乳酪，农舍乳酪，不平衡，异味发现添加经纯化的和未经纯化的PepG均导致明显的作用。使用未经46纯化的PepG的乳酪中记录到的苦味记录和不平衡被用于得出PepG应当被纯化的结论。实施例14-15在下文所述的实施例中，如文献(Sambrooketal.(2000)"MolecularCloning:alaboratorymanual",thirdedition,ColdSpringHarborLaboratories,ColdSpringHarbor,NewYork禾卩Innisetal.(eds.)(1990)"PCRprotocols,aguidetomethodsandapplications"AcademicPress,SanDiego)中所述，进行标准的分子克隆技术，包括核酸的分离和纯化、核酸的电泳、酶修饰、核酸的扩增和/或切割、五."//的转化等。实施例14构建Kluweromvceslactis的芳基硫酸酯酶敲除菌株分离Kluyveromyceslactis染色体DNA:用单个尺/actoCBS2359菌落接种100mlYEPD(1%酵母提取物；1%Bacto-蛋白胨；2%葡萄糖)摇瓶，并在3(TC于280rpm摇动下孵育24小时。使用计数腔计数细胞量，并使用对应于4.1*108个细胞的相应培养物用量。染色体DNA的提取使用Q-BIOgene提供的快速DNA离心试剂盒(Cat#6540-600)。使用酵母方案使用一个匀化步骤，所述步骤使用速度设定6.0的FastprepFP120匀浆器(BIO101Savant)40秒。随后将样品在冰上冷却并随后使用相同的条件再次匀化。使用NanodropND1000分光光度计测定提取的基因组DNA的纯度和产率。发现提取物的浓度为114纳克/微升。发现A260/280和A260/230比分别为1.57和0.77。5'和3'芳基硫酸酯酶侧翼的PCR扩增5'侧翼芳基硫酸酯酶引物DFS-15289(5W):TCGCCGCGGTTGTCAACTATATTAACTATGDFS-15290(5'—3，)GATAGATCATAGAGTAACAATTGG3'侧翼芳基硫酸酯酶DFS-15291(5W):GCAACTGAAGGTGGTATCAATTGDFS-15292(5W):CACCCGCGGCACCAGATAATGGAGGTAG3'侧翼SacII—芳基硫酸酯酶DFS-15291(5，~>3，)GCAACTGAAGGTGGTATCAATTGDFS-15340(5W):CGGCACCAGATAATGGAGGT使用PhusionHigh-FidelityDNA聚合酶(Finnzymes,EspooFinland)扩增芳基硫酸酯酶侧翼。根据厂商说明书，用Milli-Q水将《./actoCBS2359基因组DNA稀释100倍，并使用5ml在50ml的PCR母液中作为模板。HybaidMBS0.2GPCR块使用以下程序PCR程序5'侧翼芳基硫酸酯酶第l阶段(l个循环)98°C30s第2阶段GO个循环)98°C10s60。C30s72。C30s第3阶段(1个循环)72°C10分钟4°C保持PCR程序3'侧翼芳基硫酸酯酶第l阶段(l个循环)98°C30s第2阶段GO个循环)98°C10s72。C30s72。C30s第3阶段(1个循环)72°C10分钟4°C保持PCR程序3'侧翼SacII—芳基硫酸酯酶第l阶段(l个循环)98°C30s第2阶段GO个循环)98。C10s65。C30s72。C30s第3阶段(1个循环)72°C10分钟4°C保持芳基硫酸酯酶敲除载体的构建.-使用ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen;Part.no.45-0245)，根据厂商说明书，将获得的5'-、3'和3'Sacir芳基硫酸酯酶侧翼PCR片段克隆进pCR-BluntII-TOPO载体中。根据厂商说明书，将TOPO克隆反应转化进OneShotTOP10化学感受态E.coli(Invitrogen;Part.no.44-0301)中。针对5，TOPO、3，TOPO和3，SacirTOPO分别使用Mw"I、SacII、JTcml和i>al;Mwwl、5"acl1、五coRI和￡boRV;Mwwl、五coRI、五coRV和&cn，根据限制性酶切模式分析选择正确的克隆。AmdS盒分离自pKLACl载体(NewEnglandBiolabs)。pKLACl质粒被转化进化学感受态的&m-A/cm-co/z'细胞(NewEnglandBiolabs;Cat.NoC2925H)中，并分离未甲基化的质粒。使用GeneElutePlasmidMidiPrepKit(Sigma;Cat.No.NA0200),从含有50mg/ml卡那霉素的过夜LBC培养物中分离5，TOPO、3'TOPO、3'SacirTOPO和pKLACl的大量质粒DNA。用Sa/I和处al消化pKLACl载体，用J^al和Wol消化5'TOPO载体。使用NucleospinExtractIIKit(MacheryNagel)根据厂商说明书纯化消化产物。使用Quick连接试剂盒(NewEnglandBiolabs;Cat.No.M2200S)，根据厂商说明书，将消化的amdS盒连接进^feal/^ol消化的5'TOPO载体中。根据厂商说明书，将连接混合物转化至OneShotTOP10化学感受态五.co"(Invitrogen;Part.no.44-0301)中。使用Mw"I、五coRI和&CI，根据限制性消化模式分析，选择争取的克隆。这得到以下的载体5'amdSTOPO载体(图1)。使用GeneElutePlasmidMidiPrepKit(Sigma;Cat.No.NA0200)根据厂商说明书，从含有50mg/ml卡那霉素的过夜LBC培养物中分离大量5'amdSTOPO质粒。用Mm"I和消化5'amdSTOPO载体并用Mwwl和EcoRI消化3，SacirTOPO载体。借助于凝胶提取分离并纯化MimI"coRI3'SacII—TOPO片段。根据厂商说明书，在含有SYBR安全DNA染料(Invitrogen;Cat.No.S33102)的TAE缓冲液中在1%琼脂糖上进行电泳。使用黑暗读数透照灯(ClareChemicalResearch;CatNo.DR-45M)使片段显影，将其从凝胶上切除，并根据供应商的凝胶提取方案，使用NucleospinExtractII试剂盒(MacheryNagel;Cat.No.740609.250)，从琼脂糖中提取。用和Acl消化5'amdSTOPO载体，并根据供应商的PCR纯化方案使用NucleospinExtractII试剂盒(MacheryNagel)纯化。随后使用Shrimp碱性磷酸酶(Roche;Cat.No.1758250)根据厂商说明书将Munl/AscI消化的5'amdSTOPO载体脱磷酸化。根据厂商说明书，使用Quick连接试剂盒(NewEnglandBiolabs;Cat.No.M2200S)，将MmwI/五coRI3，SacirTOPO片段连接进脱磷酸化的Munl/Ascl消化的5，amdSTOPO载体中。根据厂商说明书，将连接混合物转化进化学感受态的dam-A/cm-五.co/Z细胞(NewEnglandBiolabs;Cat.NoC2925H)中。使用￡coRI和五t力RV，根据限制性消化模式分析选择正确的克隆。这得到了以下的载体5'flmJS3，SacirTOPO载体。根据厂商说明书，使用GeneElutePlasmidMidiPrep试剂盒(Sigma;Cat.No.NA0200),从含50mg/ml卡那霉素的过夜LBC培养物中分离大量的3，SacirTOPO载体。用^&al消化5'amdS3'Sacir载体。用^&al和5^el消化3，TOPO载体。根据厂商说明书，使用NucleospinExtractII试剂盒(MacheryNagel)纯化消化产物。如上所述借助于凝胶提取分离^"IA^el3'TOPO片段。根据厂商说明书使用Shrimp碱性磷酸酶，Roche(Cat.No.1758250)将消化的5'amdS3，Sacir载体去磷酸化。根据厂商说明书，使用Quick连接试剂盒(NewEnglandBiolabs;Cat.No.M2200S)将J^alAS^el3，片段，连接在去磷酸化的消化的5'amdS3'Sacir载体中。将连接混合物转化进OneShotTOP10化学感受态E.coli(Invitrogen;Part.no.44-0301)中。使用M/el、&I、五coRI、SacII、&d根据限制性消化模式分析选择正确的克隆。这得到最终的K/"cto芳基硫酸酯酶敲除载体(图3)。根据厂商说明书，使用GeneElutePlasmidMidiPrep试剂盒(Sigma;Cat.No.NA0200),从含有50mg/ml卡那霉素的过夜LBC培养物中分离大量的芳基硫酸酯酶敲除载体。用&cII消化K/acto芳基硫酸酯酶敲除载体，使得可获得缺乏TOPO载体部分的线性的敲除盒。根据厂商说明书使用NucleospinExtractII试剂盒(MacheryNagel)纯化消化产物。用芳基硫酸酯酶敲除载体转化《./"ctoCBS2359将尺.CBS2359的100mlYEPD培养物在3(TC下于280rpm摇动培养24小时。使用该培养物接种100ml的YEPD培养物，所述培养物在相同的条件下培养直到达到0.5和0.8之间的OD610。借助于在1559g和4'C下离心5分钟来收集细胞。用50ml无菌的电穿孔缓冲液(EB)(10mMTrispH7.5、9.2%(w/v)蔗糖、1mMMgCl2)在4'C洗涤细胞沉淀物。将细胞沉淀物在室温下重悬于含25mMDTT和20mMHEPES缓冲液pH8.0的50mlYEPD中。将细胞在3CTC孵育30分钟，不摇动。借助于在1559g和4'C离心5分钟来收集细胞，并用10ml冰冷的EB洗涤。借助于在1559g和4。C下离心5分钟，将细胞再次沉淀并重悬于0.1ml冰冷的EB中。将细胞悬浮液分布在1.5mleppendorf管中的40微升等分试样中。向一个细胞的等分试样中添加0.2-1.0微克(l-5微升)的线性敲除构建体，通过吸打混合并在冰上孵育15分钟。将细胞-DNA混合物添加至冰冷的具有2mm裂隙尺寸的电穿孔管(BTX;Part.No.45-0125)中。在由GenePulser(BioRad，ModelNo.1652077)和PulseControler(BioRad，ModelNo.1652098)组成的BioRad电穿孔仪上进行电穿孔，使用以下设定1000V、400Ohm和25pF。电穿孔后立刻添加1mlYEPD并将细胞转移至无菌的12ml管中并在摇动培养箱中在3(TC孵育2小时。在1559g将细胞沉淀5分钟并在生理盐水溶液(0.85%(w/v)氯化钠)中洗涤。将细胞再次沉淀并重悬于1ml生理盐溶液中。将若干个25pl、50^和100pl的等分试样如不在选择性amdS琼脂平板上1.25%(w/v)琼脂、1.17%(w/v)酵母碳基、30mM磷酸盐缓冲液pH6.8和5mM乙酰胺。将拼版在3(TC孵育2天，随后在室温下孵育2天。通过将菌落划线在YEPD琼脂平板上，使得可出现单菌落，并在3(TC孵育24小时来选择和纯化菌落。使用菌落PCR测试这些单菌落中定向整合的敲除构建体，所述PCR使用靶向amdS盒和整合的敲除构建体下游的寡核苷酸。将菌落材料悬浮于20mMNaOH，0.2%(w/v)中，并在98"C孵育5分钟。用水将细胞悬浮液稀释2倍，并直接2.5微升直接用作25微升PCR反应中的模板，所述PCR反应根据厂商说明书使用PhusionHigh-FidelityDNA聚合酶(Finnzymes;EspooFinland;产品编号F-530S)。Fw3，amdS:GACAATTGATACCACCTTCAGTTGRv下游CTGGGAAATGTGGTGACTCCATA靶向PCR的程序第l阶段(l个循环)98°C30s第2阶段GO个循环)98°C10s68。C30s72。C30s第3阶段(1个循环)72°C10分钟4°C保持在1%琼脂糖凝胶上分析PCR，并选择显示清晰的被扩增条带的定向转化体。芳基硫酸酯酶敲除菌株被命名为2359AARY1-10并储存直至进一步使用。实施例15检测2359AARY中的芳基硫酸酯酶活性母菌株(Motherstrain)CBS2359和菌株2359AARY均在摇瓶中于100mlYEP+2%半乳糖中在30。C下培养3天。通过在1559g和4"下离心5分钟收集生物质。用冰冷的水将生物质洗涤两次，以去除培养基部分。根据厂商(Pierce)说明书，用酵母蛋白质提取试剂(Y-PER)处理酵母生物质，以提取细胞内酶如芳基硫酸酯酶。本领域技术人员应当明白其它酵母裂解方案可以用于提取芳基硫酸酯酶活性，如用玻璃珠机械剪切或酶处理，以用例如Zymolyase溶解细胞壁(参阅即GloverandHames,DNAcloning2-apracticalapproach,IRLPress1995)。使用实施例2中描述的方法，在提取物中测量芳基硫酸酯酶。从该实验中显而易见当母菌株含有可估计的量的芳基硫酸酯酶活性时，在2359AARY菌株中不能检测到该活性。根据实施例2在该提取物中测量0-半乳糖苷酶(乳糖酶)活性时，在野生型菌株CBS2359和突变体菌株2359AARY之间检测不到乳糖酶活性差异，显示突变体菌株的芳基硫酸酯酶活性被特异地打断。突变体菌株可用于以工业规模制造事实上缺乏芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶制剂。权利要求1.乳糖酶，其包含相对每NLU乳糖酶活性而言少于40个单位芳基硫酸酯酶活性。2.根据权利要求1的乳糖酶，其包含相对每NLU乳糖酶活性单位而言少于30个单位的芳基硫酸酯酶活性，更优选地相对每NLU乳糖酶活性而言少于20个单位的芳基硫酸酯酶活性，最优选地相对每NLU乳糖酶活性而言少于IO个单位的芳基硫酸酯酶活性。3.根据权利要求1或2的乳糖酶，其为细胞内生产的乳糖酶。4.根据前述权利要求任何一项的乳糖酶，其为中性乳糖酶，优选地为《./flcto乳糖酶。5.根据前述权利要求任何一项的乳糖酶，其具有pH-6和pH=8之间的pH最适度。6.根据前述权利要求任何一项的乳糖酶，其具有每NLU乳糖酶活性少于0.5RFU/分钟的蛋白酶活性。7.包含权利要求1到6中任一项的乳糖酶的组合物。8.乳制品，其包含权利要求1到6中任一项的乳糖酶或权利要求7的组合物。9.生产乳制品的工艺，所述工艺包括向包含乳糖的乳制品中添加权利要求1到6中任一项的乳糖酶或权利要求7的组合物。10.生产下述乳制品的工艺，所述乳制品没有芳基硫酸酯酶产生的异味，所述工艺包括使用权利要求1到6中任一项的乳糖酶或权利要求7的组合物。11.纯化含乳糖酶的酶制剂的工艺，所述工艺包括使用色谱法从乳糖酶中分离芳基硫酸酯酶。12.—种工艺，其包括用酶制剂处理底物，其中所述酶制剂基本不含芳基硫酸酯酶。13.根据权利要求12的工艺，其中所述酶制剂是根据权利要求36到43中任一项的酶制剂。14.根据权利要求10或13的工艺，其中所述工艺包括通过根据权利要求23到25中任一项或权利要求34或35的工艺获得所述酶制剂。15.根据权利要求10到14中任一项的工艺，其中所述底物是蛋白质性质的底物。16.根据权利要求10到15中任一项的工艺，其中所述底物含有用硫酸酯基团取代的烷基苯酚。17.根据权利要求10到16中任一项的工艺，其中所述底物含有乳蛋白，例如酪蛋白和/或乳清蛋白。18.根据权利要求10到17中任一项的工艺，其中所述底物为奶、经发酵的乳制品，例如酸奶、乳清、水解产物，和/或肉。19.根据权利要求10到18中任一项的工艺，其中所述处理期间所述底物中芳基硫酸酯酶水平为每升底物至多500*10E3芳基硫酸酯酶单位，优选地每升底物至多250*10E3、优选地至多100*10E3、优选地至多50*10E3、优选地至多25*10E3芳基硫酸酯酶单位。20.根据权利要求10到19中任一项的工艺，其中所述酶制剂包含乳糖酶、蛋白酶、脂酶或酯酶。21.根据权利要求10到20中任一项的工艺，其为用于制备营养制品(例如乳制品)的工艺。22.可以通过根据权利要求10到21中任一项的工艺获得的制品。23.用于制备酶制剂的工艺，所述工艺包括纯化粗酶制剂，所述粗酶制剂含有感兴趣的酶和芳基硫酸酯酶，其中芳基硫酸酯酶与所述感兴趣的酶分离。24.根据权利要求23的工艺，其中所述纯化导致芳基硫酸酯酶活性降低至少50%、优选地至少80%、更优选地至少90%、更优选地至少95%、更优选地至少99%。25.根据权利要求23或24的工艺，其中所述纯化通过色谱，优选地在单一色谱分离步骤中进行。26.生产下述宿主细胞的工艺，所述宿主细胞是芳基硫酸酯酶缺陷菌株，所述工艺包括将生产芳基硫酸酯酶的培养物置于下述条件下，所述条件下，所述培养物的部分被修饰，以形成芳基硫酸酯酶缺陷的宿主细胞，并分离所述宿主细胞。27.根据权利要求26的工艺，其中使用诱变条件，优选地使用随机诱变条件，例如物理或化学诱变。28.根据权利要求26的工艺，其中使用重组遗传操作技术，优选地使用一步基因打断、标记物插入、定点诱变、缺失、RNA干扰、反义RNA。29.通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括(a)在有益于多肽表达的条件下，在营养培养基中培养芳基硫酸酯酶缺陷型宿主细胞(b)在所述宿主细胞中表达所述多肽，和(c)可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。30.通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括(a)用表达载体转化芳基硫酸酯酶缺陷型宿主细胞，其中所述载体表达所述多肽，(b)在有益于所述多肽表达的条件下，在营养培养基中培养所述宿主细胞，(c)在所述宿主细胞中表达所述多肽，和(d)可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。31.通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括(a)在禁止芳基硫酸酯酶生产的营养培养基中和在有益于所述多肽表达的条件下，培养宿主细胞(b)在所述宿主细胞中表达所述多肽，和(c)可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收多肽。32.通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括(a)用表达载体转化宿主细胞，其中所述载体表达所述多肽，(b)在禁止生产芳基硫酸酯酶的营养培养基中和在有益于所述多肽表达的条件下，培养所述宿主细胞，(c)在所述宿主细胞中表达所述多肽，和(d)可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。33.根据权利要求29到32中任一项的工艺，其中所述多肽是酶。34.用于制备酶制剂的工艺，所述工艺包括通过根据权利要求33的工艺来制备酶，和从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收酶制剂。35.根据权利要求23到25中任一项或权利要求33或34的工艺，其中所述酶是乳糖酶、蛋白酶、脂酶或酯酶。36.能够通过根据权利要求23到35中任一项或权利要求35的工艺获得的酶制剂。37.根据权利要求12到36中任一项的酶制剂，其中所述酶制剂包括乳糖酶、蛋白酶、脂酶和/或酯酶。38.包含羧肽酶的酶制剂，其含有相对于每CPG而言少于10000个单位的芳基硫酸酯酶活性。39.根据权利要求38的酶制剂，其含有相对于每CPG而言少于1000个单位、优选地少于100个单位、优选地少于50、优选地少于10个单位的芳基硫酸酯酶活性。40.包含脯氨酸特异蛋白酶的酶制剂，其含有相对于每PPU而言少于300*10E3个单位的芳基硫酸酯酶活性。41.根据权利要求40的酶制剂，其含有相对于每PPU而言少于100*10E3个单位的芳基硫酸酯酶。42.包含乳糖酶的酶制剂，所述酶制剂含有相对于每NLU的乳糖酶活性而言少于40个单位的芳基硫酸酯酶活性。43.根据权利要求42的酶制剂，其含有每NLU乳糖酶活性少于30个单位的芳基硫酸酯酶活性，更优选地每NLU乳糖酶活性少于20个单位的芳基硫酸酯酶活性，最优选地每NLU乳糖酶活性少于IO个单位的芳基硫酸酯酶活性。44.根据权利要求36到43中任一项的酶制剂用于制备乳制品的用途。45.根据权利要求36到43中任一项的酶制剂用于预防或减少异味发生的用途。全文摘要本发明描述了一种细胞内生产的乳糖酶，其包含相对于每NLU的乳糖酶活性而言少于40个单位的芳基硫酸酯酶活性。本发明还提供了包括用酶制剂处理底物的工艺，其中所述酶制剂基本不含芳基硫酸酯酶。文档编号A23C9/12GK101316928SQ200680044411公开日2008年12月3日申请日期2006年11月28日优先权日2005年11月28日发明者彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞斯·蒂克尔,路泊·伊登斯,阿伯图斯·阿拉德·蒂克·范,马克西米利安·彼得·马莉亚·斯瓦夫·德申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司