专利名称：用于微阵列的反应缓冲液的制作方法
技术领域：
0001本发明具##及用于微阵列的缓冲液。更具体地，本发明具##及
用于微阵列的核酸扩增和杂交的集成反应的缓冲液。
背景技术：
0002核酸扩增技术提供了研究遗传材料的强有力工具。聚合酶链反应 (PCR)是频率使用较高的技术之一，其广泛用于克隆、基因表达分析、DNA 测序、基因图谱、药物开发、犯罪勘验等领域。
0003对于许多应用而言，除了扩增耙核酸序列以外，使用核酸杂交探针 皿一步鉴定序列也是有用的。探针的实例可以是与全部或部分耙序列互补的 标记的单链多核苷酸。探针杂交可以提供比简单PCR扩增更多的序列选择性， 并且允许独立鉴定耙核酸序列内的多个序列位点。
0004通常，PCR和探针杂交步骤作为独立的反应进行。最近，使用含核
酸扩增试齐诉n杂交试齐啲单一试剂混合物，已将独立的反应集成为一个单一反
应。集成反应的众多优点之一包括，可减少试剂的添加步骤，并可降低试剂的 4顿消耗。
0005同时分析多基因的方法，该需求一直在增加。微阵列是诸如科学、 临床和环境分析的理想平台，因为微阵列的微小体积可以允许以相对狭小的空 间和反应体积，排列成百上千的生物探针。微阵列是附着于固体表面的DNA显 微阵点的集合，其可形成阵列用于表达分析(可同时监观喊百上千基因的表达 水平)。集成的核酸扩增反应和杂交反应，可用于微阵列领域以优化分析。
0006目前，用于集成反应的缓冲液具有较高的反应温度，其可导致膨胀 和反应容器的潜在渗漏。较高的反应温度也可导致气泡产生而干扰杂交信号的 识别。
附图简述
0007在并未必然按比例绘制的附图中，相同的数字记载了所有各l见图的 基本相似组件。带有不同字母后缀的相同数字，表示不同实例的基本相似组件。附图通常是以实例的方式而不是以限制的方式，来解释本申请所讨论的各具体 实施方式。
0008
图1显示了某些具体实施方式
的检测或定量核酸方法的方法框架流 程图100。
发明
0009本发明具体涉及用于核酸扩增和杂交集成反应的缓冲液组合物。缓 冲液包括约50-200mM的盐，约10-30mM的Tris-HCl,约2-10mM的水可溶性 f魏，约0.05-1.5%的表面活性剂，约0.05-0.15mg/ml的稳定化蛋白，约50-300nM 的一种或多种引物，约20-150|nM的一种或多种dNTPs，约5-15%的甘油，约 0.5-1.5 %的甲翻安，和至少约5单^/ml的聚合酶。本发明也具，及检测或定 量核酸的方法。
发明详述
0010下文详述包括参照附图的相关内容，该内容构成本发明详述的一部 分。附图通过图示来显示本发明用以实施的具体实施方式
。这些
具体实施例方式
(在本文中也称为"实施例")，被记载得足够详细以使本领域的技术人员能够 实施本发明。这些具体实施方式
可以组合，可以利用，或者在不偏离本发明范 围的情况下，可以进行结构性和逻辑性改变。因此，下文详述不认为是对本发 明的限制，即，本发明的范围由所附权利要求书和其类似的文书予以限定。
0011在本文中，术语"a"或"an"用于是指包括一个或多于一个，术语
"or"用于表示非排除性的"或"，除非另有说明。此外，应当理解用在本文中 的措词和术语，如果没有相反的解释，其仅用于说明的目的而不是限制的目的。 此外，本文献所涉及的所有公开文献、专禾诉口专禾湘关文献，都全文合并至本 文作为参考，尽管它们可单独合并作为参考。在本文与那些合并作为参考的文 献内容并不一致的情形下，合并参考文献的内容应当认为是本文献内容的内容 补充；对于相互矛盾的不一致情形，贝U应以本文内容为准。
0012本发明具,及用于微阵列的核酸扩增和杂交集成反应的缓冲液。 缓冲液组合物提供了用于微阵列的用以成功进行两反应的试剂和pH环境。而 且，本缓冲液可在核酸扩增反应中斷氐退力鹏约8-约10摄氏度，从而可增强 反应中的有效密封并减少因膨胀所致的渗漏几率。本发明具体实施方式
的缓冲 液，与目前〗顿的缓冲液相比，具有更高的杂交效率。此外，本缓冲液使用时的DNA变性、TO，比4顿常规缓冲液时，低大约5-约10摄氏度。所述较低的 温度有利于反应室的密闭和杂交信号的分析，因为较高的温度可增加膨胀压力 进而可增加反应缓冲液的渗漏风险。
0013舰图1 ，根据某些具体实施方式
，示出了一个检测或定量核酸的方 法框架流程图100。可以在相同的缓冲液中扩增核酸102，其中可以杂交核酸 104。该集成反应可用于产生核酸样品而形成微阵列106。然后分析微阵列结果 亂
0014核酸扩增102，例如可以是聚合 反应(PCR)。待扩增的核酸片 段取决于所选的弓胸。弓l物是与待扩增核酸片段的起始端或终末端互补的较短 人工核酸链。弓卿在这些起始位点和终末位点通过粘附核酸模板而退火，在那 里，核酸聚合酶结合并开始新核 合成。
0015弓,长度和解链鹏(Tm)的选择，取决于多种因素。引物的解链 温度定义为， 一半的弓卿结合位点被占据时的a^。特别短的弓卿可在较长核 酸模板的多个位置发生退火，由此，其会导致非特异性的复制拷贝。反言之， 弓嫩的长度受限于允许使用的解链最大温度，这是因为解链 M会随着弓l物的 长度增加而增加。解链，太高会产生问题，因为核酸聚合酶在该温度下可能 减低活性。例如，弓l物长度通常为约15到约40个核苷酸，其解链鹏为约55 。C到约65。C。
0016PCR步 常由20到35个循环系列组成。每一循环包括下列步骤: 将双链核酸，例如DNA，加热至足以变性核酸样品或分离双链的 鹏。例如， 显度为约94-98"。在第一次循环之前，核酸可以变性稍长时间，以确保模板核 酸与弓卿完全分离，及然后仅形成单链。此外，有些聚合酶在此步骤被激活。
0017在分离核酸各链之后，降低温度以使引物能自身与核酸单链结合， 即退火。退火温度取决于引物，其通常比引物的解链温度约低5°C。例如,本发 明具体实施方式
提供了可斷氐退火MJt约8-约10。C的缓冲液，所述退火温度的 降低有利于密闭。退火步骤期间的错误纟鹏，可导致弓l物根本不与模板核酸结 合或者导致弓,的随机结合。
0018核酸聚合酶可以最终复制核酸链。核酸聚合酶可以从退火的弓嫩开 始，沿着核^f繊行，即延伸。延伸aS取决于核酸聚合酶。Taq聚合酶，例如 在约72"C^jg下延伸。延伸步骤的时间，取决于核酸聚合 身和待扩增的核酸片段的长度。最后一轮循环之后进行最终延伸步骤，以确保任何剩余单链核 酸被完全复制。
0019杂交104，例如可以包括探针杂交。杂交探针，例如可以是核酸截短 片段(short piece of nucleic add)，例如DNA，所述核酸截短片段先变性为单链 和然后再进行放射标记，例如使用磷。将放射性磷引入至核酸的单个核苷酸的 磷酸基团，由此，通过与聚合酶温育而引入至核赚骨架。这样可以产生具有 已知序歹啲截短片段的方爐标记核酸，其与任意互补核醚连杂交、。探针可用于 Northern或Southern印迹，以检测与其具有同源性(含有相似的g^对序列的 区域)的基因或RNA转录本。杂交探针的位置可以利用微阵列来确定。例如， 缓冲液中包含有放射或荧光标记(即带有荧光染料分子附着的dNTPs)的 dNTPs，由此每轮PCR循环完成之后，所获得核酸都是方M标记或荧光的。
0020微阵列例如可以包括由本发明具体实施方式
的集成反应所产生的显 微的核酸位点的集合，其连结于诸如玻璃、塑料或硅芯片的固体表面。微阵列 可形成以用于表达分析谱，例如同时监测上千个基因的表达水平。
0021实时PCR和杂交可用于同时定量和扩增给定核酸分子的特定部分。 例如，它可用于确定样品中是否存在某特定序列，如果存在，它可确定样品中 的复制数。本发明缓冲液可用于实时PCR微阵列，例如这样的微阵列记载在通 认的美国专利申请
发明者孙震宏, 亮 许 申请人:霍尼韦尔国际公司