一种乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒，其包括PCR反应缓冲液，靶基因COX-2、HERV-K和GAPDH标准扩增产物的梯度稀释液；一对COX-2特异性的正、反向引物，一条COX-2特异性的探针；一对HERV-K特异性的正、反向引物，一条HERV-K特异性的探针；一对内参基因特异性的正、反向引物，一条内参基因特异性的探针。本试剂盒可通过RT-PCR技术检测了COX-2和HERV-K在正常人和乳腺癌患者外周血单核细胞中的表达量，发现差异的效果显著，特异区分正常及乳腺癌的效果良好；该乳腺癌mRNA组合的检测特异性和灵敏度高、操作简单、取材方便、安全无创伤及易于大量筛查的特点。
【专利说明】—种乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因检测试剂盒，尤其是一种乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]乳腺癌历来被认为是一种异质性疾病，无论在分子免疫表型、病理组织形态、生物学行为还是对治疗的反应都存在明显的个体差异，这种差异被认为是由于乳腺癌的分子差异(关键基因的异常表达)所造成的。越来越多的研究证实，乳腺癌预后与许多分子标志物密切相关，这为标志物基因分型的研究奠定了分子生物学基础。同时，由于基因芯片及组织微阵列等高通量研究技术的出现，基因分型不仅能反映各型乳腺癌相应的临床特点，更为乳腺癌基因分型的进一步研究提供了技术支持。
[0003]乳腺癌发生和转移受环境和遗传因素二者共同作用，复杂的发病机制是长期困扰医学界的一大难题。因此，发现预测和早期诊断乳腺癌发生转移的特异标记物是防治这类重大疾病的关键所在。目前，对乳腺癌的预警和早期诊断的技术主要有以下三种。1.临床体格检查:定期接受临床体格检查是早期发现乳腺癌的有效方法之一。始于1963年纽约的健康保险计划(HIP)，历经18年研究发现，接受定期临床体格检查的妇女乳腺癌死亡率比对照组低23%。我国也开展了一系列乳腺癌的预防工作，但是，由于乳腺癌普查耗资巨大，成本/效果比高，因此，我国乳腺癌早期发现主要着眼于自我检查和提高自身保健意识，但患者偶尔触及肿块而就诊，常常为时过晚。2.影像学诊断法:影像学检查是以钥靶X线摄片为主要手段，辅以超声扫描和MRI扫描。钥靶X线摄片最早开始于1960年，在近五十年的发展历程中，对乳腺癌的早期诊断起到重要作用。乳腺组织本身密度小，包括肿瘤在内的很多病变表现为微小钙化。钥靶X线摄片方法能发现细小钙化点，如果表现为泥沙样钙化或细颗粒样钙化，或者每lcm2内< 0.5mm的超过5枚则可提示乳腺癌。但对于不典型的病变，尤其是致密型乳腺内的病变及近胸壁的病变易漏诊。2005年国际上乳腺癌诊疗领域的23位专家在肯定钥靶X线摄片技术在乳腺癌早期诊断的重要地位的同时，建议结合超声，MRI和病理检查，进行最佳评价。虽然该方法在发达国家乳腺癌的普查和早期发现中起到很大作用，尤其是乳腺MRI技术的应用，将诊断敏感率提高至77%~100%，但是由于特殊仪器的限制，对诊断技术的高要求和昂贵的价格，使这些方法在发展中国家及地区得不到广泛应用。3.生物靶标早期检测:包括乳腺癌相关基因普查，例如BRCAl和BRCA2的突变分析；乳头溢液特异物检测及血清肿瘤标志物的测定。Her-2/neu癌基因在乳腺癌中过度表达，在血清中可以检测到Her-2蛋白片断。通过酶联免疫反应测定血清Her-2水平，可以作为诊断乳腺癌的指标之一。因此，重点发展生物靶标检测，寻找新的乳腺癌检测靶标并发展为可供临床检测且简单实用的技术对于乳腺癌患者提前预警及采取有效的治疗手段意义重大。
[0004]虽然疾病组织mRNA表达谱往往与疾病发病及预后密切相关，但是检测技术复杂、创伤大，难以真正应用于临床诊断，且不同的mRNA对不同疾病的诊断特异性差异较大。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是:其包括PCR反应缓冲液，靶基因C0X-2、HERV-K和GAPDH标准扩增产物的梯度稀释液；一对C0X-2特异性的正、反向引物，一条C0X-2特异性的探针；一对HERV-K特异性的正、反向引物，一条HERV-K特异性的探针；一对内参基因特异性的正、反向引物，一条内参基因特异性的探针。
[0007]本发明所述C0X-2特异性的正向和反向引物的序列分别是5' -CCCGCAGTACAGAAAGTATC-3’和 5’ -CCATAGAGTGCTTCCAACTC-3，，C0X-2 特异性的探针序列是5’ -TCAGCATAAAGCGTTTGCGGTACTCA-3 ’ ；用于HERV-K特异性的正向和反向引物的序列分别是 5’ -CAAATGGCGTATGTTAACTGACTT-3’ 和 5’ -GCCAATCTTTTGGGATCATG-3 ’，HERV-K 特异性的探针序列是 5’ -CCGTAAACGCCGTAATTCAACCCATG-3’。
[0008]本发明所述C0X-2特异性的探针和HERV-K特异性的探针的两端均分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。
[0009]本发明所述内参基因为GAPDH。
[0010]本发明所述GAPDH的正向和反向引物的序列分别是5’ -GCATCCTGGGCTACACTGAG-3’ 和 5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，GAPDH 特异性的探针序列是 5’-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACCC-3，。
[0011]本发明所述GAPDH特异性的探针两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团 TAMRA。
[0012]本发明所述PCR反应缓冲液为Taqman反应液。
[0013]C0X-2是前列腺素合成过程中重要的限速酶，也是启动炎症反应的关键酶，它通过促进肿瘤细胞的增殖，抑制凋亡，促进肿瘤新生血管形成等机制，参与肿瘤的发生、发展。目前研究表明，在正常乳腺组织中C0X-2不表达或低表达，而在乳腺癌组织中其表达量明显增高。从早期的乳腺增生到转移的发生，C0X-2的高表达贯穿于肿瘤发生发展的整个过程。目前研究认为其主要通过促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤侵袭力，促进肿瘤血管新生等方式发挥作用。
[0014]人内源性逆转录病毒(Humanendogenous:etrovimses, HERVs)普遍存在于人类染色体中。HERV-K家族具有完整的逆转录病毒的基因序列，是所有家族中最可能编码完整并可能具有传染性的逆转录病毒目前研究证实，在多种恶性肿瘤中可以检测到HERV-K的表达。HERV-k作为一种逆转录病毒，可能是乳腺癌的一个理想的肿瘤靶点。
[0015]采用上述技术方案所产生的有益效果在于:单用C0X-2或者是HERV-KmRNA进行乳腺癌的诊断分析，均存在比较高的假阳性和假阴性，诊断准确率不理想，因此，本发明提出乳腺癌mRNA组合检测的理念，将C0X-2和HERV-K同时进行测定，用于乳腺癌的诊断，大大提高了乳腺癌诊断的准确率，减少了诊断结果的假阳性和假阴性。
[0016]本发明可通过RT-PCR (逆转录-聚合酶链反应)技术检测了 C0X-2和HERV-K在正常人和乳腺癌患者外周血单核细胞中的表达量，发现差异的效果显著，特异区分正常及乳腺癌的效果良好；该mRNA组合乳腺癌基因标志物的检测特异性和灵敏度高、操作简单、取材方便、安全无创伤及易于大量筛查的特点。
[0017]本发明可广泛运用于乳腺癌患者C0X-2和HERV-K基因扩增水平的检测，可用于乳腺癌的早期诊断和疗效评价，提高病理检测的可重复性和准确性，避免过度组织活检，更准确的筛查出的乳腺癌患者，早期治疗干预，可以大大地降低医疗成本和费用，减少医疗资源的浪费，延长部分患者生存期，提高患者生存质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0019]图1是本发明乳腺癌mRNA组合的ROC曲线图。
【具体实施方式】
[0020]实施例:本乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒采用下述检测过程。
[0021]1、外周血中总RNA的提取:
[0022](I) EDTA (乙二胺四乙酸)抗凝的全血,5000rpm离心1min,弃血衆，吸取血细胞500 μ L转移至1.5mL离心管中，再加入红细胞裂解液lmL，充分混匀，置冰上反应15min，5000rpm 离心 5min ；
[0023](2)弃上清液,加入PBS (Phosphate Buffered Saline,磷酸盐缓冲液)ImL,充分混匀，5000rpm 离心 5min ；
[0024](3)操作三次，至上清液透明，弃上清液；
[0025](4)在纯化的血细胞中，加入总RNA提取剂Trizol试剂lmL，充分混匀，室温放置5min ；
[0026](5)加入氯仿200 μ L，充分混匀30s，室温放置3min，1000rpm离心20min ；
[0027](6)取上清液500L，至新的PE试管中，加入异丙醇500 μ L，_80°C放置过夜；
[0028](7) 1000rpm 离心 3Omin,弃上清液，加入 ImU75Vol % 乙醇一DEPC 溶解，DEPC 为焦碳酸二乙酯，充分混匀，7500rpm离心1min ；
[0029](8)弃上清液，室温风干，加入22μ L的DEPC水溶解，得总RNA溶液，待用，或_80°C保存。
[0030]2、cDNA 的合成:
[0031 ] (I)取2 μ L总RNA溶液，50倍稀释，经紫外分光光度仪测定OD (吸光度)，并检测0D260/280 ^ 1.8 确定纯度；
[0032](2)取0.2 μ g总RNA和逆转录试剂，按表1的cDNA合成反应体系，加样进行反应；所述试剂采用德国QIAGEN公司Sensiscript RT KU，也可用其他公司同类型产品；
[0033]表1:cDNA合成的反应体系
[0034]
反应试剂体积(μ L)
1XBuffer RT2
dNTP Mix(2.5mM each dNTP)2
01igo-dT Primer(10 μ m)2
Quant Reverse Transcriptase I
【权利要求】
1.一种乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒，其特征在于:其包括PCR反应缓冲液，靶基因COX-2,HERV-K和GAPDH标准扩增产物的梯度稀释液；一对C0X-2特异性的正、反向引物，一条C0X-2特异性的探针；一对HERV-K特异性的正、反向引物，一条HERV-K特异性的探针；一对内参基因特异性的正、反向引物，一条内参基因特异性的探针。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒，其特征在于:所述C0X-2特异性的正向和反向引物的序列分别是V -CCCGCAGTACAGAAAGTATC-3’和 5，-CCATAGAGTGCTTCCAACTC-3’，C0X-2 特异性的探针序列是 5，-TCAGCATAAAGCGTTTGCGGTACTCA-3’ ；用于HERV-K特异性的正向和反向引物的序列分别是5’ -CAAATGGCGTATGTTAACTGACTT-3’ 和 5’ -GCCAATCTTTTGGGATCATG-3’，HERV-K 特异性的探针序列是 5’ -CCGTAAACGCCGTAATTCAACCCATG-3’。
3.根据权利要求2所述的乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒，其特征在于:所述C0X-2特异性的探针和HERV-K特异性的探针的两端均分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团 TAMRA。
4.根据权利要求1、2或3所述的乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒，其特征在于:所述内参基因为GAPDH。
5.根据权利要求4所述的乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒，其特征在于:所述GAPDH的正向和反向引物的序列分别是5’-GCATCCTGGGCTACACTGAG-3’和5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，GAPDH 特异性的探针序列是 5’ -TCCTCTGACTTCAACAGCGACACCC-3，。
6.根据权利要求5所述的乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒，其特征在于:所述GAPDH特异性的探针两端分别结合 有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。
7.根据权利要求1、2或3所述的乳腺癌mRNA组合的检测试剂盒，其特征在于:所述PCR反应缓冲液为Taqman反应液。
【文档编号】C12Q1/68GK104164480SQ201410161514
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】王义明 申请人:王义明