人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物及其应用的制作方法
【专利摘要】人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物及其应用，涉及人类甲状腺癌组织基因。所述检测引物的序列包括上游扩增引物序列、生物素修饰下游扩增引物序列、焦磷酸测序引物序列。检测引物可在制备焦磷酸测序试剂盒中应用。试剂盒包括序列基因PCR扩增反应液、Taq?DNA聚合酶、对照质控品、焦磷酸测序引物、包装盒。所述序列基因扩增PCR反应液，由PCR反应缓冲液、一对序列基因特异性上游扩增引物和生物素修饰的下游扩增引物组成。试剂盒使用方法：PCR扩增产物经DNA变性过程，纯化得到含生物素修饰的下游扩增引物的待测序单链，并和焦磷酸测序引物结合成杂交体，然后使用焦磷酸测序仪进行序列的检测与分析。
【专利说明】人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及人类甲状腺癌组织基因，尤其是涉及人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物及其应用。
【背景技术】
[0002]2011年8月，由中华医学会内分泌学会完成的10个城市甲状腺疾病患病率调查结果显示，在接受本次流行病学调查的十大城市1.5万多名居民中，甲状腺功能减退症患病率显著增加，已达6.5%，甲状腺结节患病率高达18.6%，而单发结节导致甲状腺癌的发生率也在增加，在儿童时期的甲状腺结节中，甲状腺癌的发病率高，约占50%~71%。早之前对甲状腺癌的统计研究表明，甲状腺癌发病率约为2/10万，临床上比较罕见，因此也并未引起人们的重视。近年来一些国家流行病学统计却发生了惊人的变化，例如美国1997年新发现甲状腺癌病例数几乎是1977年发现病例数的I倍(16100: 8200)。以上统计说明甲状腺癌发病率趋势一直处于增高阶段，而我国便属于高发区之一。甲状腺癌(thyroid carcinoma,TC)是内分泌系统中最常见的肿瘤之一，其占癌症发病率的2.59%[1]，是近年来唯一以两位数速度增长的恶性肿瘤，占据国内头颈部恶性肿瘤的发病首位。20世纪80年代后美国、欧洲开始对甲癌治疗的规范化进行探讨以来，甲癌的治疗虽有不少进展，但尚未达到成熟阶段，仍存在有很多争议，是头颈外科的重要课题。当前亟待解决的主要问题是避免治疗不足或治疗过度的两个极端[2]。
[0003]在诊断方面，甲状腺癌常以无痛性甲状腺结节为主要临床表现。在临床上主要通过触诊、彩超、核素显像及细针穿刺细胞学检查(fine needle aspiration biopsy, FNAB)等方法进行诊断，但却难以确定甲状腺结节的性质，即使病理活检，有时甲状腺腺瘤与结节性增生，良性肿瘤与恶性肿瘤也不易明确辨认。为了避免对具有良性生物学行为的TC进行过度治疗，不断的寻求新的肿瘤标志物，以提高甲状腺癌的诊断水平成为本领域的研究热点。近年来研究较多的肿瘤标志物主要有β_半乳糖结合蛋白、间皮细胞表面微绒毛抗原-1、三叶因子、细胞角蛋白、端粒酶反转录酶、血管内皮生长因子、降钙素、基质金属蛋白酶等以及相关的基因标志物[3]。例如:TFF-3称肠三叶因子，Taniguchi等[4]应用标签接头竞争PCR技术(adapter-tagged competitive PCR)对2000例甲状腺滤泡性肿瘤患者进行研究，得出TFF3基因是诊断FTC最有价值的标志物，其实用性在随后相关研究中也得到证实[5-6]。而Ito等[7]应用免疫组织化学方法检测了 166例甲状腺肿瘤的端粒酶反转录酶hTERT表达，结过检测hTER T对于鉴别PTC和腺瘤的特异性和阳性预测值分别高达90.2%和83.3%，从而得出hTER T可以用来鉴别PTC和腺瘤的结论，这一结论也在其它研究中证实[8-9]。此外，还有大量文献认为PAX8-PPARY是鉴别FTC和良性病变的标志物[lOLlgeciras-Schimnich等[11]应用RT-PCR及高分辨率片段分析对其进行临床试验检测，认为这项试验应用于临床有助于甲状腺癌的诊断，能为甲状腺癌的预后和治疗提供有用的信息。尽管对于肿瘤标志物的研究很多，方法也不同，但单一的肿瘤标志物因敏感性及特异性不高不能被广泛应用。一些标志物可以作为FNAB的辅助诊断方法，但其真正应用于临床还需做大量的工作。
[0004]在治疗方面，甲状腺癌的治疗方法主要以手术为主，但对于转移性的、侵袭性的和晚期的甲状腺癌患者来说，手术效果有限，而且碘放射治疗和化疗对这些恶性程度较高的肿瘤治疗效果往往不太理想，因此分子靶向治疗的出现则为这些患者带来了新的希望。目前，研究的甲状腺癌的分子祀点主要涉及到酪氨酸激酶受体RET (rearranged duringtransfection)蛋白[12]和NTRKl蛋白，G蛋白H-RAS、K-RAS和N-RAS，信号调节激酶丝/苏氨酸特异性激酶(serine-threonine protein kinase, B-RAF)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol_3kinase,PI3K)和 AKT1,核转录因子 PPAR Y I 等多个位点[13],然而目前虽然甲状腺癌的分子靶向治疗涉及众多复杂的细胞信号转导途径，分子理论水平的阐述与临床试验的结果对比表明某些分子靶向药物的治疗效果还难以令人完全满意。
[0005]在检测方面，正如上所述，甲状腺癌在临床上虽能通过触诊、彩超、核素显像及细针穿刺细胞学检查等方法来进行诊断，但却不能区分其良、恶性的情况，医生只能通过开刀，才能去判定患者甲状腺癌状况，这就为明确诊断以及之后制定合理手术策略增加了难度麻烦以及一定的危险性。所以，找出一种不用开刀，就可以区别甲状腺组织正常、增生、良性以及恶性状态则成为研究关键。尽管目前甲状腺癌相关的肿瘤标志物已发现不少，但由于各研究者使用的技术路线不同，采用的样本不同，环境的不同等一系列主客观因素，这些分子标记都含有一定的不确定因素，没有一个可以明确的成为甲状腺癌理想的单一诊断标记。例如，先后被Huang等[14]和Jarzab et等[15]发现的DPP44证明在PTC中是上调最大的基因，然即使如此它也不能清晰的区分PTC和良性组织。无论是国外还是国内研究者，在进行基因研究时不可避免的会受到多种因素的干扰，例如选取多个对象进行基因研究时会受到这些对象不同的年龄、性别、不同的生活习惯、存在的其它疾病等因素影响，虽然有的研究者会在数据分析时根据影响因素不同而分类，然未知因素太多，我们不能确定是否所有影响因素都包含在内。能简单明确的区分甲状腺增生，甲状腺癌和甲状腺瘤有助于医生之后采取合理的治疗手段，研究者对这三种状态的研究对比都是在不同对象上进行，也就是说目前还未有研究能针对 一个同时拥有甲状腺癌，甲状腺增生以及甲状腺瘤的对象来进行调查的。选用从同一个病人身上得到的这三种状态的组织进行研究，便减少了由于个体差异，环境因素等所带来的干扰，可以提供出更加确定的生物标记或药物靶标，具有很大的创新性和实用性。对来自同一个病人身上的甲状腺正常，增生，癌以及瘤间的研究，更能明确的研究出在一个机体中甲状腺从正常转化为癌，瘤，增生组织的机理，为未来的靶向药物治疗奠定基础。且正常对照组也来源于同一病人，保证了实验结果的准确性。
[0006]近年来，表观遗传学与癌症的关系越来越多的被报道。其中，DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，主要发生在DNA的CpG岛。DNA的甲基化通过DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases, DNMTs)完成。DNA甲基化参与了细胞分化、基因组稳定性、X染色体失活、基因印记等多种细胞生物学过程。单基因水平及基因组范围内的DNA甲基化改变在肿瘤发生发展中亦发挥重要作用。抑癌基因的异常甲基化引起的表达抑制，可导致肿瘤细胞的增殖失控和侵袭转移，并参与肿瘤组织的血管生成过程。在许多肿瘤的研究中都发现了基因组整体DNA低甲基化所导致的染色体不稳定性。从DNA的异常高甲基化和低甲基化两方面论述了 DNA甲基化在细胞恶变发生发展过程中的改变及其影响，并阐述了 DNA甲基化改变在肿瘤诊断和治疗中的作用。研究通过利用甲基化芯片技术对同一病人体内良性和恶性的甲状腺肿瘤组织进行检测，使用生物信息学分析的方法发现LIMEl基因特异位点(20号染色体反链第62367888号位CG)发生甲基化，并且差异显著，可以作为辨别甲状腺组织是否为恶性的诊断标志物。
[0007]无容置疑，甲状腺癌严重影响大众健康，消耗医疗资源，需要政府部门与医学界给予共同的关注，随着现代医疗模式向标准化服务的转化，实施甲状腺疾病的规范化诊治是国际临床内分泌学界的普遍趋势，也是我国临床内分泌代谢病学界长久的期望。研究甲状腺癌的病理过程，优化诊断手段，以及治疗策略，对于规范和提高我国甲状腺疾病的临床诊治水平，保障国人甲状腺健康具有重要意义。并且甲状腺癌(简称甲癌)已占据头颈部癌的发病首位，为临床常见手术。当前甲癌术前检查为:查体、彩超、ECT等。仍缺有效的甲癌分子检测方法及诊断试剂产品。
[0008]参考文献:
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【发明内容】
[0024]本发明的目的之一在于提供一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物。
[0025]本发明的目的之二在于提供一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物在制备焦磷酸测序试剂盒中的应用。
`[0026]本发明的目的之三在于提供一种既快速、准确，并且易于标准化的焦磷酸测序试剂盒的使用方法。
[0027]所述一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物的序列包括:
[0028]上游扩增引物序列为:5’ -GTTTTTTTTGAGTTTTTTATTTTGGGTAGT-3’ ；生物素修饰下游扩增引物序列为:5’ -ATTTAAAAATTCTATACCAACTCTACTCAC-3’ -Biotin ;焦磷酸测序引物序列为:5’ -GAGTITTTTAITTTGGGTAGTA-3’。
[0029]所述一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物可在制备焦磷酸测序试剂盒中应用。
[0030]所述焦磷酸测序试剂盒包括序列基因PCR扩增反应液、Taq DNA聚合酶、对照质控品、焦磷酸测序引物、包装盒。
[0031]所述序列基因扩增PCR反应液，由PCR反应缓冲液、一对序列基因特异性上游扩增引物和生物素修饰的下游扩增引物组成。
[0032]所述一对序列基因特异性上游扩增引物的终浓度可为0.2 μ Μ，所述生物素修饰的下游扩增引物的终浓度可为0.2 μ M ;所述序列基因PCR扩增反应液的最佳PCR扩增模板量可为50ng。[0033]PCR的扩增程序为:第一阶段:95°C 15minl个循环；第二阶段:94°C 30s, 56V 30s,72V 30s, 45个循环；第三阶段-JTC lOmin，一个循环。
[0034]所述焦磷酸测序试剂盒的使用方法:PCR扩增产物经DNA变性过程，纯化得到含生物素修饰的下游扩增引物的待测序单链，并和焦磷酸测序引物结合成杂交体，然后使用焦磷酸测序仪进行序列的检测与分析。
[0035]本发明可用于检测甲状腺癌组织，实现甲癌的诊断和大面积低成本筛查，具有良好的社会效益。且在癌症检测领域，很少有基于甲基化检测的报道。
[0036]本发明的优点是:(1)设计了 5’端生物素修饰了的序列基因扩增引物，方便后续富集测序；(2)运用焦磷酸测序检测方法，能够精确反应检测位点的甲基化水平；(3)检测速度快，整个焦磷酸测序检测与分析过程只需要15min。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为焦磷酸测序试剂盒的结构组成示意图。
[0038]图2为上游扩增引物序列、生物素修饰下游扩增引物序列、焦磷酸测序引物序列设计程序界面。
【具体实施方式】
[0039]下列实施例旨在举例说明，而不是限制本发明。
[0040]参见图1，本发明所述焦磷酸测序试剂盒实施例包括盒体A、隔板B、序列基因PCR扩增反应液1、Taq DNA聚合酶2、对照质控品3、焦磷酸测序引物4 ;隔板B设在盒体内，序列基因PCR扩增反应液1、Taq DNA聚`合酶2、对照质控品3、焦磷酸测序引物4分隔在隔板B中。
[0041]实施例1焦磷酸测序试剂盒及其使用方法
[0042]I制备包括下列组成成分的试剂盒:序列基因扩增PCR反应液(120(^01管、Taq酶系(30 μ L) I管、对照品(300 μ L) I管、焦磷酸测序引物(200 μ L)。其中上游扩增引物序列、生物素修饰下游扩增引物序列、焦磷酸测序引物序列设计使用Qiagen PyroMark AssayDesign SW2.0 (货号=9019077)引物设计软件(设计界面见图2)。
[0043]2样本的采集、保存和运输:
[0044]2.1使用样本类型:新鲜组织、冷冻组织。
[0045]2.2样本采集:手术后将肿瘤组织立即放入液氮冷冻并保存于一 80°C。
[0046]2.3样本的保存和运输:新鲜组织、冷冻组织保存在一 80°C，保存期为2年。样本长途运送采用干冰。
[0047]3核酸抽提:
[0048]建议使用天根DNA提取试剂盒。按照说明书进行操作，最后用30 μ L无菌水溶解，之后进行亚硫酸盐处理。
[0049]4亚硫酸氢盐转化:(建议使用QIAGEN EpiTect Bisulfite Kits试剂盒)
[0050]4.1反应体系配置参见表1。
[0051]表1
【权利要求】
1.一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物，其特征在于其序列包括: 上游扩增引物序列为:
5’ -GTTTTTTTTGAGTTTTTTATTTTGGGTAGT-3’ ； 生物素修饰下游扩增引物序列为:
5’ -ATTTAAAAATTCTATACCAACTCTACTCAC-3’ -Biotin ； 焦磷酸测序引物序列为:
5’ -GAGTTTTTTATTTTGGGTAGTA-3’。
2.如权利要求1所述一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物在制备焦磷酸测序试剂盒中应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述焦磷酸测序试剂盒包括序列基因PCR扩增反应液、Taq DNA聚合酶、对照质控品、焦磷酸测序引物、包装盒。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述序列基因扩增PCR反应液，由PCR反应缓冲液、一对序列基因特异性上游扩增引物和生物素修饰的下游扩增引物组成。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于所述一对序列基因特异性上游扩增引物的终浓度为0.2 μ M，所述生物素修饰的下游扩增引物的终浓度为0.2 μ M ;所述序列基因PCR扩增反应液的最佳PCR扩增模板`量为50ng。
6.如权利要求3所述应用，其特征在于PCR的扩增程序为:第一阶段:95°C15minl个循环；第二阶段:94°C30s，56°C30s，72°C30s，45个循环；第三阶段:72°C lOmin，一个循环。
7.如权利要求2所述应用，其特征在于所述焦磷酸测序试剂盒的使用方法:PCR扩增产物经DNA变性过程，纯化得到含生物素修饰的下游扩增引物的待测序单链，并和焦磷酸测序引物结合成杂交体，然后使用焦磷酸测序仪进行序列的检测与分析。
8.如权利要求2所述应用，其特征在于所述焦磷酸测序试剂盒在检测甲状腺癌组织中应用。
9.如权利要求2所述应用，其特征在于所述焦磷酸测序试剂盒在甲癌诊断中应用。
10.如权利要求2所述应用，其特征在于所述焦磷酸测序试剂盒在筛查甲癌中应用。
【文档编号】C12N15/11GK103866039SQ201410135857
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】曾骥孟, 蔡良良, 刘国彦, 叶辉铭, 顾龙 申请人:厦门大学