专利名称：减毒重组体新城疫病毒及包含该病毒的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于转录新城疫病毒(NDV)基因组的重组体载体、 一种由该载体制备的具有致病性NDV表面抗原的减毒重组体NDV毒 林、 一种使用该栽体制备的具有低致病性和抗新城疫病(ND)的高防护 效力的重组体NDV的方法以及一种包含该重组体NDV的ND疫苗。
背景技术：
新城疫病(ND)——已知为最重要的国际上已知的家畜疾病类之 一——是一种急性热呼吸系统疾病，并且按照韩国规定(by law in Korea) 为第一级传染病。如果未免疫家禽的感染，则死亡率为100%。由于新城 疫病毒(NDV)在韩国普遍存在，预计消灭该疾病会有许多困难。同时， 因为多种新城疫病毒广泛分布在东南亚、中国和中国台湾，而这些地区都 与韩国贸易活跃，并且因为这些病毒是潜在的十分危险的因素，所以存在 开发亚洲型新城疫病疫苗的迫切需求。
新城疫病毒(NDV)是一种单链RNA病毒，属于禽副粘病毒 (Jvw/m^"s)属。新城疫病毒的包膜包括使该病毒与宿主结合的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白，以及使包膜与宿主细胞融合的融合(F)蛋白。 F和HN蛋白均是糖蛋白并均分布于所述病毒包膜的表面上。
F蛋白属于I型膜糖蛋白組并形成一个三聚体结构(三聚体)。F蛋白 形成为一种无活性前体形式(FO)，并且在该前体F0分子经过高尔基膜时被分成二硫键连接的亚基Fl和F2。该过程在所述Fl亚基的氩基末端 暴露一个疏水结构域，其中该结构域在成熟蛋白的生物活性中发挥重要功 能。被称为融合肽的该疏水结构域在副粘病毒的F蛋白中是高保守的，并 且直接参与膜融合。副粘病毒的F蛋白包括共有的结构特征，例如七肽重 复区域以及能够形成oc螺旋结构的两个区域。所述重复区域的最长七肽重 复区域A与Fl的N末端疏水融合肽相邻，七肽重复区域B由一系列在 每7个残基处高度保守的亮氨酸或异亮氨酸(Isoleusine)构成。
HN蛋白属于II型膜糖蛋白，并且在病毒包膜的表面上形成四聚体， 以穿透it^v细胞膜中(Gorman et al.， 1988; Ng et al.， 1989 )。 HN蛋白通 过结合于糖缀合物的唾液酸而使病毒体定位于宿主细胞表面上。HN蛋白 可分成三个区域跨膜结构域、茎结构域和球状结构域。抗原受体的结合 位点和神经氨酸酶的活性位点都位于所述球状结构域上。融合诱导的活性 位点位于所述茎结构域上，并与F蛋白相互作用(Sergei et al.， 1993 )。预 计的茎区结构为oc螺旋结构，具有包括七肽重复区域A (在第74-88位) 和七肽重复区域B (在第96-110位)的两个七肽重复区域。还已经报道 了，任何破坏该结构的突变都会降低受体结合和神经氨酸酶活性。而且还 已经才艮道了 ，能够破坏结构的突变可引起受体结合和神经氨酸酶活性的降 低。
才艮据鸡中的疾病水平，将NDV分类为下列致病类型(致病型)1) 呈现呼吸系统和神经学症状及高死亡率的嗜内脏速发型(高致病)NDV; 主要呈现消化器官病变和高死亡率的嗜神经速发型NDV; 2)呈现低死亡 率但在一些家禽中呈现急性呼吸系统和神经学症状的中发型NDV; 3)引 起轻微疾病或无症状的呼吸系统感染的緩发型(lentogenic )(低致病) NDV和非致病NDV。
为了使NDV感染细胞，前体糖蛋白Fo需要被切割成Fl和F2。这 种翻译后切割受到宿主细胞的蛋白酶的干涉。如果不发生该切割，就可形 成无感染性的病务体，并且病毒复制无法进行。强毒病毒的Fo蛋白可被 多种蛋白酶切割，而低毒性病毒的Fo蛋白易感性受到限制一一具体而言， 低毒性病毒仅可在特定的宿主细胞类型中生长。
鉴于緩发型病毒仅在包括呼吸系统器官或消化道的具有胰蛋白酶样 酶的区域中繁殖，因为强毒病毒在包括组织和器官的多个区域中繁殖，所 以所述强毒病毒会引起胎儿的全身感染。通过对Fo前体的M酸检查可鉴定，緩发型病毒具有一个连接F2 和Fl亚基的单精氨酸(R )，而毒性超过中发型的毒林具有其他碱性氨基 酸，在切割区上形成两个对例如K/R-X-K/R-R-F。而且，致病性超过中 发型的毒林的F2链通常由苯丙氨酸残基表示，而致病性低于緩发型的病 毒毒抹的F2链通常由亮氨酸表示。
在美国，灭活疫苗已被用于鉴定新城疫病(Hofstad， 1953)。利用这 样的观察结果，即部分的地方性动物病病毒仅产生轻度疾病，第一次开发 了中发型活疫苗Roakin，随后开发了更温和的Hitdiner Bl和LaSota (Goldhaft, 1980 )。
活疫苗的主要优点之一是能够通过使用低成本的批量施用方法给予。 一种常规的施用方法为通过々欠用水给予所述疫苗。
通过喷雾和气雾剂批量施用活疫苗是非常有用的，这是因为可以更快 地将该疫苗给予许多鸟，从而对其进行预防接种。对产生颗粒的喷嘴进行 控制以获得严格的颗粒大小是重要的。
最近使用的活疫苗出现了一些问题。因为这些疫苗仍具有小的致病 性，所以偶尔会出现疫苗的副作用。而且，因为继承自母系的抗体可中和 活疫苗病毒，所以成功的免疫性形成会受干扰。因此，使用非常温和的病 毒来进行初次疫苗接种是重要的，并且需要一种能够克服母体抗体的疫 苗。
灭活疫苗通常产生自与合适的补充物混合的传染性尿嚢液，并经福尔 马林或0丙内酯处理以灭活病毒。将疫苗给予至肌肉或通过皮下注射给 予，但是其缺点在于较高的生产和施用成本。
最近，据推测，国内外产生的速发型NDV的抗原性与疫苗林相比表 现出了许多差异。由于此原因，可以推断可能会发现与疫苗林的基因型有 许多差异的野生毒林，并且如果疫苗的抗体滴度不足，它能防止死亡，但 无法阻止产蛋率的降低等。
根据基于F基因的部分序列的系统发生分析，将NDV的基因型分类 成基因I型-基因IX型。在分子流行病学上，分布在韩国的大多数新城疫 病毒属于基因VI型和基因VII型。对于基因VI型的情况，纵使由于密 集疫苗接种可能出现变体毒林，其分离也相对低于基因VII型，并且在 2000年后基本上仅分离到基因VII型，所以考虑了它消失的可能性。因 此，测序分析(通过基因组项目确定最近的NDV基因序列)和通过与世界范围内的登记在GenBank中的NDV进行基因比较的分子流行病学研 究对于开发一种优化的疫苗株是很重要的。
现在，常规使用的新城疫病(ND)的灭活油佐剂疫苗是通过使用例 如克隆30 ( Clone 30 )或LaSota毒林的緩发型NDV产生的，并且由于 安全性的问题，禁止使用速发型NDV生产灭活疫苗是。因此，对于用于 制备更安全的、更经济的且其中抗原类似于野毒林(field strain)的ND 疫苗的技术，有不断增加的需求，并且使用反求遗传学技术来开发疫苗是 最接近这种需求的技术。
负链RNA病毒的反求遗传学技术作为一种技术被提出，用于从病毒 基因组拯救传染性的病毒(美国专利5,166,057 )。纵使最初提出该技术是 为了操纵流感病毒基因组，但可将其成功地施用于多种分节段的和不分节 段的负链RNA病毒，包括狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒和仙台病毒。
本发明使用如上文所述的反求遗传学技术开发了一种新型疫苗林；其 结果是，发展了生产具有类似于野毒林的抗原性的安全ND疫苗林的技 术。
发明内容
本发明的一个目标是，提供一种用于转录NDV基因组的重组体载体。
本发明的另一个目标是，提供一个具有致病性NDV表面抗原的减 毒重组体NDV毒林。
本发明的另 一个目标是，提供一种使用该载体制备具有低致病性和 抗新城疫病(ND)的高防护效力的重组体NDV的方法。
本发明的另一个目标是，提供一种使用反求遗传学技术对NDV进 行减毒以使其免疫原性增加并使其致病性降低的方法。
本发明的又一个目标是，提供一种包含所述重组体NDV的抗ND 疫苗。
图1示出了使用国内的速发型新城疫病毒KBNP-4152的基因组 RNA进行的RT-PCT结果以及扩增的RT-PCR产物的名称和位置。 图2示出了将图l的扩增产物克隆至TA-克隆载体中的结果。图3示出了在重组体NDV基因组两端插入限制性内切酶识别位点 5s附J I和5mI的过程。
图4示出了用于制备亲本载体的连接子序列、用于克隆NDV的基 因组DNA的pTMH以及用于制备该连接子的引物序列。
图5示出了制备pTMH载体的过程的原理图。
图6示出了 pTMH载体中主要位点的核苷^列。
图7示出了 pTMH载体的全核苦*列。
图8示出了使用La Sota毒抹的基因组RNA进行的RT-PCT结果以
及扩增的RT-PCR产物的名称和位置。
图9示出了将图8的扩增产物克隆至TA-克隆载体中的结果。
图10示出了将NDV基因组DNA克隆至pBR322载体中的过程。
图11示出了制备用于表达NDV的NP、 P和L基因的质粒的过程，
其中A的第2、 3和4道分别表示NP、 P和L基因的RT-PCR结果，A
的第6、 7和8道分别表示插入至载体中的基因，该栽体是在将所述NP、
P和L基因插入至pcDNA3.1/TOPO载体后经AWI处理的；B表示概要 显示其的原理图。
图12示出了使用PTDS技术的F和HN基因的半合成过程。
图13示出了所述F蛋白的费林蛋白酶(furin)-样酶识别位点的核
苷酸序列，以及所述重组体病毒的M和F基因的连接子。
图14示出了一个基因的合成过程，其中使用PTDS和定向诱变在所
述F蛋白的费林蛋白酶-样酶识别位点中引起一个突变。图15示出了用于将KBNP-4152的HN (1-566)基因与La Sota毒林
的HN末端(567-577)基因连接的引物的设计图。
图16示出了制备重组体病毒KBNP-C4152R2L的过程。
图17示出了制备具有多个费林蛋白酶-样酶识别位点的重组体病毒的
克隆的过程。
图18为通过使用平板血凝试验显示接种于鸡胚中的 KBNP-C4152R2L是否增加的结果。
图19示出了用来确证KBNP-C4152R2L的致病性的致病型特异的 RT-PCR结果。
图20为KBNP-4152和KBNP-C4152R2L的F蛋白的费林蛋白酶-样 酶识别位点的核苷酸序列的比较结果。图21示出了通过使用杂交血凝抑制试验得出的La Sota毒林、
KBNP-4152和KBNP-C4152R2L之间的抗原关系。
图22示出了 KBNP-C4152R2L的细胞病变效应(cytophatic effect )。 图23示出了克隆至pTMH载体的KBNP-C4251R2L基因组和该基
因组的核苷^列的图i普。
具体实施例方式
本发明涉及一种用于转录新城疫病毒(NDV )基因组的重组体载体、 一种由该载体制备的具有致病性新城疫病毒表面抗原的减毒重组体
NDV毒林、 一种使用该载体制备的具有低致病性和抗新城疫病(ND) 的高预防效力的重组体NDV的方法以及一种包含该重组体新城疫病毒的 抗新城疫病疫苗。
本发明的F基因(384bp;定位于F基因的第1-384位核苷酸)和采 用邻接法(neighbor-joining method )对新城病毒的进4亍系统发生分冲斤的 结果如下78
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显示于图中的毒林仅为实例，现有的多种新城疫病毒毒林被分类为
基因I-IX型。而且，已经多次报道通过分子流行病学分析来对新城病毒
进行分类。因此，按照上文所述将毒林分类至各基因型是本发明所属技术 领域技术人员可以很容易理解的。在该说明书中，其毒林分类的标准引用 了以下参考文献中记栽的内容，这些参考文献通过引用的方式全文纳入本
文
1. Kwon H.J. PhD Thesis. Seoul National University, 2000.
2. Lomniczi B.， Wehmann E., Herczeg J.， Ballagi誦Pord □ ny A.， Kaleta E.F.， Werner O, Meulemans G.， Jorgensen P,H.， Mante A.P.， Gielkens A丄.J.， Capua I'， and Damoser J.， Arch Viroll43， 49-64，1998.
3. Herczeg J.， Wehmann E，， Bragg R.R.， Travassos Dias P.M., Hadjiev G.， Werner O.， andLomniczi， B. Arch Viroll44， 2087-2099，
1999.
4. Yang C.Y.， Shieh H.K.， Lin Y丄.，Chang P.C.， Avian Dis 43， 125-130， 1999.
5. Kwon H.J.， Cho S.H.， Ahn Y.J.， Seo S.H.， Choi K.S.， and Kim S丄Vet Microbio195， 39-48,2003.
6. Liu X.F.， Wan H,Q.， Ni X.X.， Wu Y.T" and Liu W.B. (2003).
disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. Arch Virol, 148， 1387-1403.
7. Tsai H丄，Chang K,H.， Tseng C.H.， Frost K.M.， Manvell R丄，and Alexander D.J. Vet Microbiol, 104， 19-30， 2004.
现在，被用作疫苗株的LaSota/46为基因II型，而大多数被鉴定为 野毒林属于基因VI-VTI型，它们在遗传上与疫苗林LaSota/46较远。例 如，在NDV的HN蛋白中，已知HN蛋白上的345-PDEQDYQIR-353 位点是一种形成中和抗体的重要的线性表位。作为国内的致病性NDV， 该病毒的基因VI型(95-98、 99-70、 99-71)和基因VII型已共存，并且更 具体地，NDV的基因VI型在1999年被分离到，但从2000年至2006年 根本没有再被分离到。在1995年，第一次从禽类中分离到NDV的基因 VIIa型，然后就再没有分离到该病毒，仅分离到NDV的基因VIId型。 在病毒的基因VI型的情况下，在1993年和1994年分离的毒抹 (SNU9358GG、 SNU9444)中观察到线性表位(E347K)的第一个变体 毒林，并继续在95-98、 99-70和99-71中观察到所述变体。因此，这些变 体毒林被认为可以避开免疫并存活较长时间，并且在韩国这些变体毒林被 认为从2000年开始几乎被新出现的基因VII型所取代。对于该病毒的基 因VII型的情况，1995年-2001年分离的所有病毒都类似于La Sota毒林 的线性表位。然而，该线性表位(E347K)的变体^^林在2002年第一次 ^^现，具有其他突变的NDV大部分是在2005年纟iLiL现(参考下表)。
常规表位_变体表位_
年份346DEQDYQIRM 346-K——M/K-3541995
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
354
L6
(79%)
(6.25%)
4 (10.5%)
1
15 (93.75%)
2
考虑这一点，因为以前的疫苗抹La Sota/46不能有效地用于预防现在 新出现的抗原性不同的新城疫病毒，因此本发明提供的用于开发具有几乎 类似于野毒林抗原性的疫苗林的技术是非常重要的。
本文使用的术语"高致病性(速发型)新城疫病毒"包括具有等于或 高于中发型毒林的致病性的致病性新城疫病毒，以及除非定义不同，否则 通常被分类为高致病性的新城疫病毒。在本发明中，高致病性新城疫病毒 是通过在感染至动物时在其体内的所有细胞中产生侵染性的病毒来显示 其致病性的。在所述F蛋白的第113-116位的氨基酸序列由下式l表示的 情况下，该F蛋白^皮存在于体内几乎所有细胞中的费林蛋白酶或费林-样 蛋白酶(下文中称作"费林蛋白酶，，)切割，从而被转化成一种活性结构 并获得侵染能力。因此，致病性新城疫病毒可被定义为在F蛋白的第 113-116位具有编码由下式1表示的氨基酸序列的核苷酸序列
式l
1130^X2X3X4-116
其中
X!、 X;j和X4独立地为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且
X2选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏 氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸。
在这种情况下，如果F蛋白的第112位的氨基酸为例如精氨酸或赖氨 酸的碱性氨基酸，那么该致病性新城疫病毒具有较高的致病性。
同时，本文使用的术语"低致病性(緩发型)新城疫病毒"包括无致病性的非致病性新城疫病毒，以及除非定义不同，否则通常被分类为緩发
型的新城疫病毒。在本发明中，低致病性新城疫病毒在F蛋白的第113-116 位具有编码由下式2表示的氨基酸序列的核苷酸序列，并且当感染至动物 时，该病毒仅被消化器官和呼吸器官中某些特定的细胞外蛋白酶所激活， 从而仅局部地感染而显示低致病性。因此，低致病性新城疫病毒被定义为 在F蛋白的第113-116位具有编码以下式2表示的M酸序列的核苷^ 列
式2
113-X4X5X7X8-116 其中
X5、 X6和X7独立地选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲At氨酸、苯
丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和
赖氨酸，且Xs和X7不同时为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且 Xs为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
当位于新城疫病毒的F蛋白中的切割位点被费林蛋白酶切割并且F 蛋白与细胞膜融合的融合区暴露时，该病毒获得致病性。费林蛋白酶是一 种分布于整个动物体内的酶，因此费林蛋白酶对病毒侵染能力的激活可以 在整个动物体内产生，籍此该病毒具有致病性。因此，新城疫病毒的致病 性水平可依赖于费林蛋白酶对F蛋白中切割位点的识别和切割的程度。
如果新城疫病毒的F蛋白的费林蛋白酶识别位点(第113-116位JL^ 酸)具有式1所示的至少3个碱性氨基酸(113-R-X-K/R-R-116 )，那么该 病毒是可以全身感染的，并获得致病性。然而，如式2中所示，如果以非 碱性氨基酸替换一个多个碱性氨基酸，那么切割和识别不是由费林蛋白酶 而是由局部存在的细胞外蛋白酶进行，且不会发生病毒的致死性全身感 染，从而呈现低致病性。
本发明涉及通过以下方式基于低致病性新城疫病毒制备遗传稳定的 且减毒的重组新城疫病毒的技术，该方式即将F蛋白和HN蛋白的编码区 替换为国内和亚洲流行的高致病性病毒的这些区域以增强该病毒对高致 病性病毒的防护效应；以及用非碱性氨基酸的密码子替换编码高致病性新 城疫病毒的第115位氨基酸的密码子，其中在出现至少两个点突变时可将 一个非碱性氨基酸的密码子转换成碱性氨基酸的密码子。如上文所述，根据本发明的重组体新城疫病毒具有与野毒林相同或类似的表面抗原，从而
呈现了对野毒林的高抗原性并且是被有效减毒的。另外，除非在F蛋白的 第115位氨基酸的密码子出现至少两个点突变，否则根据本发明的重组体 新城疫病毒不能被转换成高致病毒林，从而呈现出优良的稳定性和安全性。
根据致病性新城疫病毒的细胞病变效应，可以将其分类至形成合胞体 的合胞型和形成颗粒的颗粒型，并且通常已知合胞型具有比颗粒型更高的 致病性。本发明的特征可以在于通过以下方式显著降低致病性，该方式即 使用颗粒型病毒克隆作为高-速发型新城疫病毒来提供编码F和HN蛋白 的区域。另外，在新城疫病毒的HN蛋白中，高致病性新城疫病毒的HN 蛋白具有571个氨基酸，其长度相对较短，而低致病性新城疫病毒的HN 蛋白具有577个或616个M酸，比高致病性病毒长，因此高致病毒林和 低致病毒林可通过HN的C末端M酸序列来分类。因此，在本发明中， 将HN蛋白的C末端改造成低致病毒林的对应的区域(577个氨基酸)， 从而制备一种更加减毒的重组新城疫病毒。
如本文使用的，用于转录新城疫病毒基因组和重组体新城疫病毒的载 体中所包含的编码P、 M、 F、 HN和L蛋白的核苷酸序列应净皮理解为， 包括存在于P、 M、 F、 HN和L基因中的所有非编码核苷酸序列(条件 是它们对所表达的蛋白没有影响)，以及直接编码这些蛋白的核苷^列。
更具体而言，本发明涉及一种用于转录新城疫病毒基因组的载体，包 括一个由编码新城疫病毒的NP、 P、 M、 F、 HN和L蛋白的核苷酸序列 组成的基因片段；以及一个启动子和一个终止子，它们可操作地连接至该 基因片段，
其中所述NP、 P、 M和L基因源自低致病性新城疫病毒La Sota毒 林的基因组，F和HN基因源自高致病性新城疫病毒KBNP-4152的基因 组，
其中在所述栽体中包含的F蛋白编码序列的特征在于，以任一选自以 下的密码子替换编码速发型新城疫病毒(包括KBNP-4152)的F蛋白第 115位的碱性氨基酸的密码子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨 酸密码子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密码子；包括UUC和UUU的 苯丙氨酸密码子；包括AUC和AUU的异亮氨酸密码子；包括UUA和 UUG的亮氨酸密码子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的丝氨酸密码子；包括ACC和ACU的苏氨酸密码子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU 的缬氨酸密码子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密码子。
该载体的HN基因可以被额外地突变，使得HN蛋白的笫l-569位氨 基酸的密码子编码高致病性新城疫病毒的相应氨基酸，第570位之后的氨 基酸的密码子编码低致病性新城疫病毒(包括LaSota毒林)的相应M 酸。
另外，所述启动子和终止子的使用可以没有特别的限制，条件是它们 可以与所述质粒中的新城疫病毒基因组可操作地连接。本发明所属技术领 域的技术人员可容易地选择并使用这种启动子和终止子。在本发明的一个 实施方案中，所述启动子和终止子可以分别是T7启动子和T7终止子。
在本发明的优选实施方案中，用于转录该病毒基因组的载体可包括编 码SEQ ID NO: 2 - 7的M酸序列的核苷酸序列或以下SEQ ID NO: 1的 核苷酸序列(参考图23，后文中称为pTNH-c4152R2L)。
基因起始
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基因结束
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由用于转录该基因组(pTNH-c4152R2L)的载体所表达的NP、 P、 M、 F、 HN和L蛋白的絲絲列分别显示于SEQIDNO:2曙7中。
在另一个方面，本发明涉及包括P、 M、 F、 HM和L基因的编码区 的重组体新城疫病毒，其中所述NP、 P、 M和L基因的编码区源自低致 病性新城疫病毒，F和HN基因的编码区源自高致病性新城疫病毒，其中 所述F蛋白编码序列的特征在于，以任一选自以下的密码子替换高致病性 新城疫病毒的F蛋白第115位的氛基酸的密码子包括GCA、GCC、GCG 和GCU的丙氨酸密码子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密码子；包括 UUC和UUU的苯丙氨酸密码子；包括AUC和AUU的异亮氨酸密码子； 包括UUA和UUG的亮氨酸密码子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的 丝氨酸密码子；包括ACC和ACU的苏氨酸密码子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的缬氨酸密码子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密码子。
该重组体新城疫病毒的HN基因可以被额外地突变，使得HN蛋白的 第1-569位氨基酸的密码子编码高致病性新城疫病毒的相应氨基酸，第 570位之后的氨基酸的密码子编码低致病性新城疫病毒(包括La Sota毒林)的相应氨基酸。
在本发明的一个优选实施方案中，该重组体新城疫病毒可以为
KCTC10984BP
才艮据本发明的重组体新城疫病毒的特征在于，其表面抗原和抗原性与 高致病性野毒林相同或类似，且致病性低于现有的低致病性疫苗林的致病 性。所述致病性新城疫病毒在F蛋白中具有费林蛋白酶的识别切割区，并 且当该切割区被费林蛋白酶切割的时候，F蛋白与细胞膜融合的融合肽区 被暴露，从而获得侵染性。因为费林蛋白酶分布于体内大多数细胞中，所 以新城疫病毒在体内可全身性感染，从而呈现出高致病性。
在用于转录本发明的病毒基因组的载体中，所述低致病性新城疫病毒 与上文所定义的相同，例如所述低致病性新城疫病毒可选自I型和II型 的新城疫病毒，并且优选可以是属于II型的La Sota/46毒林(AY845400 )。 所述高致病性新城疫病毒与上文所定义的相同，它可以是选自V型、VI 型、VII型、预型和XI型的新城疫病毒(它们是全世界流行的野毒林)的 任一种，并且优选地选自VI型和VII型的新城疫病毒。在本发明的一个 优选实施方案中，所述高致病性新城疫病毒可以为KBNP-4152 (保藏号 KCTC10919BP )。制备KBNP-4152毒林的方法及其特征与韩国专利申请 2006-0026667和'Cho SH， Ahn YJ， Kim SJ， Kwon HJ. Characterization of a Newcastle disease virus with variation in the major Hemagglutinin-Neuraminidase (HN) linear epitope. The49th Annual Meeting of the Korean Society of Veterinary Science 2005， 45 (3，suppl)， 199'中记载的相同，它们通过引用的方式纳入本文。只要本文使用的高致 病性新城疫病毒和低致病性新城疫病毒被不同地定义，就按照上文所ii^ 它们进行定义。
在使用常规的反求遗传学对新城疫病毒进行减毒时， 一个实例是以甘 氨酸替换第115位氨基酸，但是对该替换的甘氨酸的密码子的仅一个g 进行的任意突变均可导致第115位氨基酸变成碱性氨基酸例如赖氨酸和 精氨酸，所述病毒可再次恢复其致病性。
然而，在根据本发明的重组体新城疫病毒中，以编码非碱性氨基酸的 密码子替换F蛋白的第115位氨基酸，其中除非出现至少两个点突变，否 则编码该非碱性氩基酸的密码子不能被转换成编码碱性氩基酸的密码子。 因此，重组体病毒恢复其致病性的可能性^艮低，并且与现有的其他减毒毒林相比该病毒的稳定性显著增加。当根据本发明对F蛋白的切割位点进行 突变的时候，F蛋白的切割位点不是由费林蛋白酶切割的一一由此不会发 生全身感染一一而是由仅分布于体内少数器官(呼吸器官和消化器官)中 的胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶切割的，导致局部感染。
为了达到这样的效果，以任一选自以下的密码子替换本发明的F蛋白 的第115位氨基酸的密码子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸 密码子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密码子；包括UUC和UUU的苯 丙氨酸密码子；包括AUC和AUU的异亮氨酸密码子；包括UUA和UUG 的亮氨酸密码子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的丝氨酸密码子；包 括ACC和ACU的苏氨酸密码子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的 缬氨酸密码子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密码子。
在另一方面，本发明涉及一种制备重组体新城疫病毒的方法，包括以 下步骤
将编码低致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷酸序列以高致病性 新城疫病毒的相应序列替换；以任一选自以下的密码子替换高致病性新城 疫病毒的F蛋白的第U5位氮基酸的密码子包括GCA、 GCC、 GCG 和GCU的丙氨酸密码子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密码子；包括 UUC和UUU的苯丙氨酸密码子；包括AUC和AUU的异亮氨酸密码子； 包括UUA和UUG的亮氨酸密码子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的 丝氨酸密码子；包括ACC和ACU的苏氨酸密码子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的缬氨酸密码子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密码子，
其中该病毒的特征在于具有等于或类似于高致病性新城疫病毒的抗 原性，以及降低的致病性。
在制备该重组体新城疫病毒过程中，所述HN基因可以被额外地突 变，使得HN蛋白的第1-569位氨基酸的密码子编码高致病性新城疫病毒 的相应氨基酸，第570位之后的氨基酸的密码子编码低致病性新城疫病毒 (包括La Sota毒林)的相应氩基酸。
另夕卜，该方法包括以下步骤将上述用于转录才艮据本发明的新城疫病 毒基因组的载体转染至宿主细胞中；并拯救重组体新城疫病毒。对于用于 转染的宿主细胞没有特别的限制，可优选地为选自Hep2和BHK21的动 物细胞。
在另一方面，本发明涉及一种弱化新城疫病毒的致病性并且提高其抗原性和稳定性的方法，包括以下步骤
将编码低致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷酸序列以高致病性 新城疫病毒的相应序列替换；以及
以任一选自以下的密码子替换编码高致病性新城疫病毒的F蛋白的 第115位氨基酸的密码子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸密 码子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密码子；包括UUC和UUU的苯丙 氨酸密码子；包括AUC和AUU的异亮氨酸密码子；包括UUA和UUG 的亮氨酸密码子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的丝氨酸密码子；包 括ACC和ACU的苏氨酸密码子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的 缬氨酸密码子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密码子。
在该方法中，所述载体的HN基因可以被额外地突变，使得HN蛋白 的笫1-569位氨基酸的密码子编码高致病性新城疫病毒的相应氨基酸，第 570位之后的氨基酸的密码子编码低致病性新城疫病毒(包括La Sota毒 林)的相应氨基酸。
在另 一方面，本发明涉及一种包含所述重组新城疫病毒的新城疫病疫 苗，具有如上文所述的增加的抗原性和降低的致病性。该新城疫病疫苗可 以是通过将重组新城疫病毒灭活获得的灭活疫苗。可通过应用本发明所属 技术领域中已知的常规方法进行灭活，所述技术例如使用甲醛或氲溴酸溴 甲基胺(bromomethyl amine hydrobromide)等。或者,由于重纟且新城疫 病毒的低致病性、高稳定性和高安全性，还可能使用活疫苗形式或可直接 应用至受精卵的卵内疫苗形式的新城疫病疫苗。当使用活疫苗形式的本发 明的疫苗的时候，其给药途径没有限制，例如为与症状和目的相适应，可 以通过皮下或肌肉途径给予它或者通过喷雾或饮水的方式给予它。本发明 的疫苗剂量可能依赖于给予方法和被给予的受试者的状况，例如所述疫苗 剂量可以为101 EIDso (50%卵感染剂量)至1012 EIDso毒林/个体。更具 体而言，在灭活疫苗的情况下，疫苗用量可优选地为10^"EIDso/个体， 更优选108'Q~1GEIDso/个体。在卵内疫苗的情况下，才艮据待给予的卵中母系 抗体水平使用的疫苗可优选为10M力EID5o/蛋的量，更优选103'Q~7'G EID别/ 蛋的量。
如上文所述，可通过F蛋白的费林蛋白酶的识别切割区的M,列 来确定新城疫病毒的致病性。即，如果F蛋白的费林蛋白酶的识别切割区 的M酸序列是R-X-K/R-R (位于第113-116位；在下文中，除非该位置区间定义不同，否则它适用于所有的M酸四聚体)，那么F蛋白可被存 在于全身的所有细胞中的费林蛋白酶切割并被激活，导致全身性感染，从 而显示高致病性。相反，如果仅有一个碱性氨基酸或有不连续的碱性M 酸(例如R-Q-G-R或G-Q-G-R)，那么F蛋白被仅存在于消化道和器官 的部分上皮细胞中的胰蛋白酶或其类似物激活，导致局部的感染，从而显 示低致病性。对于HN，高致病性病毒包含571个氣基酸，该氨基酸长度 相对较短。相反，低致病性病毒包含577或616个氨基酸，该氨基酸长度 相对较长，其中的额外C末端区使得有可能区别高致病性病毒与低致病 性病毒。因此，通过制备具有HN的额外C末端区和F蛋白的切割位点 的多种组合的重组体病毒，有可能制备具有多种致病性水平的病毒。
具体而言，本发明的特征在于，F蛋白的切割位点的M酸序列被更 安全的氨基酸序列替换，目的是抑制该重组体病毒通过任何可能的遗传变 异获得致病性。如上文所述，低致病性病毒F蛋白的切割位点的氨基, 列是R-Q-G-R或K-Q-G-R。为了将该低致病性病毒改造成高致病性病毒， 应将上述氨基酸序列改变成R-X-K/R-R，因此位于第三位的甘氨酸(G) 必须变成精氨酸(R)或赖氨酸(K )。这种从G至R或K的变化可很容 易地仅通过一个点突变来实现。即，考虑到甘氨酸密码子为GGA、 GGC、 GGG或GGU，以及精氨酸或赖氨酸密码子为AGA、 AGG、 CGA、 CGC、 CGG、 CGU、 AAA或AAG，在任一甘氨酸密码子中出现甚至仅一个点 突变即可将甘氨酸容易地改造成精氨酸或赖氨酸，导致低致病性病毒转换 成高致病性病毒。事实上，2001年在澳大利亚已有报道称，非致病性新 城疫病毒Ulster样毒林通过类似于上述的机制变成致病性的，从而引起新 城疫病。
因此，为了显著地降低所述疫苗林中任何点突变所导致的与现有^M目 比致病性增加的可能性，本发明提供了一种使用诸如PTDS (基于PCR 的两步DNA合成)方法的任意常规方法来制备重组体病毒的技术，其中 该重组体病毒呈现出较低的这种由点突变导致的氨基酸变成赖氨酸或精 氨酸的可能性。即，在本发明中，位于常规低致病性病毒的F蛋白第115 位的氨基酸一一甘氨酸被选自以下的任一M酸替换丙氨酸、天冬氨酸、 苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和色氨酸，例如 形成R-Q-A-R或G-Q-A-R，其中仅当第115位甘氨酸的替换氨基酸的密 码子中所有或至少2个碱基突变时，所述第115位甘氨酸的替换氨基酸才可变成赖氨酸或精氨酸，使得可制备更安全的疫苗林。
重组体新城疫病毒的致病性水平通过测量平均死亡时间(MDT)和 脑内病原指数(ICPI)来确定。重组体新城疫病毒的生物性质通过EIDso (50。/。卵感染剂量)、血凝离解率等来确证。结果是，才艮据本发明的重组 体新城疫病毒具有比现有低致病毒林显著更低的致病性。
通过参考以下实施例，进一步对本发明进行更详细的说明。然而，不 应将这些实施例解释为以任何方式的限制本发明的范围。
实施例l:克隆病毒基因 1.1病毒DNA的合成
选择一种代表新城疫病毒的病毒，该病毒是最近国内流行的速发型抗 原变异毒林SNU4152毒林，由College of Veterinary Medicine of Seoul National University的Avian Disease & Laboratory分离。在鸡胚成纤维 细胞(CEF)进行3次斑块纯化后，克隆该病毒，并将其在SPF含胚卵 中传代培养两次。所克隆的病毒毒林被命名为KBNP-4152 (保藏号 KCTC10919BP )。
在无核糖核酸酶(RNase)的玻璃器亚和塑料器皿中进行RNA操作， 所有溶液均使用高压灭菌并且以1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的三蒸 水(DEPC-DW )。然后，将该病毒在Beckman SW40转子中以21,000 rpm 离心70 min，并将得到的沉淀片再悬浮于悬浮溶液(50mM Tris HC1 pH7.5、 50mM EDTA、 0.5% SDS )中。以蛋白酶K ( 200 /ig/ml， Invitrogen Co.)在37°C下处理卯min后，通过酸性酚提取(acidic phenol extraction) 来提取RNA。然后，在通过乙醇沉淀将所述RNA沉淀后，将所得到的沉 淀经75%乙醇洗涤、干燥并再悬浮于DEPC-处理水中。
将l W的经紫外线分光计(Eppendorf， Biophotometer)定量的所述 提取RNA、 1 W的在表l中显示的引物(10pmol/)^)和10 a^的DEPC-水混合，使该混合物在70"C下变性10 min。向该混合物中添加4/^的5 x RT緩冲溶液(250 mM Tris-HCl， pH 8.3， 375 mM KC1， 15mM MgCl2; GibcoBRL/Life Technologies )、2 W的0.1 M DTT和2 W的10 mM dNTP (各2.5 mM)后，使该混合物在42t:下反应2 min 。 然后,向该反应混 合物中添加l W的逆转录酶(200单位，Invitroge n co.)，然后使其在42。C下反应60 min。用于克隆KBNP-4152病毒基因的引物
引物
引物序列(5'->3')
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ND-ZJ-11648F catgcaatgttgtccagagatg (SEQ ID NO: 14)ND-ZJ-12591R agctcataactcttgaagatagc (SEQ ID NO: 23) ND匪ZJ-12539F tcagagagagatttcgcgagac (SEQ ID NO: 15) ND-ZJ-14110R cacagaatgcatggcaatcagg (SEQ ID NO: 24) ND-ZJ-14021F cattgtgacattgagattcctcc (SEQ ID NO: 16) ND-ZJ-15118R actgaatccgaatacgacttcc (SEQ ID NO: 25)
为了减少PCR反应过程中的人工突变，使用了具有DNA修复功能 的Pwo聚合酶(Invitrogen co.)。另外，将PCR产物通过可溶的纯化试 齐'J盒(soluble purification kit) ( Boehringer Mannheim Co.)或通过i京月旨 糖胶纯化试剂盒(QiagenCo.)进行纯化。
通过RT-PCR所荻得的KBNP-4152病毒基因的产物的定位显示于图 l中。
将该9类纯化产物分别克隆至TA载体中，例如XL-Topo、 pCR8/GW/Topo或pcDNA3.1V5 Topo栽体(Invitrogen co.)，并得到3 个以上的克隆。然后，制备这些克隆的质粒并确定质粒的核普酸序列。
使用循环测序试剂盒(PRISM Ready Reaction Dye终止子试剂盒) 和自动DNA测序仪(ABBIO， Applied Biosystems Co.)确定所有核苷酸 序列。
用于核苷瞎列分析的引物分别是Ml3正向引物和M13反向引物。 对于未被引物识别(read)的片段的情况，依照引物步行方法使用在表3 中显示的引物分析这些核苷^列。 HN和F蛋白的半胱氨酸残基和N-连接的糖基化位点的变化
HN
Cl (123)G5 (508)G6 (538)C2 (27)
曙(w)-++
SNU4152+++-(R)
SNU0202++--(R)影响F蛋白的结构和极性的氨基酸的变化_
27 76 104 112 115 145 192 195232247403422430480486 KBNP-4152 RCGRKN NRQNDHDSS
VII (共有).........D画--R -
Ulster CFE G G - KQ-D-Q-K-LaSota C - E G G K KQKDNQGKR VGGAC - EGGK KQKDNQGKR
如这些结果中显示的,证实了本发明中使用的KBNP-4152毒抹具 有类似于基因VII型的基因型，并且该毒林与其他病毒型(与包括以前的 疫苗林La Sota毒抹)有遗传差异。实施例2:用LaSota毒抹作为骨架制备用于转录新城疫病毒(NDV) 基因组的重组体载体
2丄表达新城疫病毒(NDV)的亲本载体(pTMH)的设计和构建 为了从NDV cDNA制备病毒，必须以与所述病毒基因组相同的结构 转录该cDNA,而不能在所述病毒基因组的5，-末端和3，-末端添加不必 要的碱基。为了获得这种结构，制备了具有以下特征的亲本载体pTMH (SEQ ID NO: 84 ):
1) 一个T7启动子位于转录起始位点的前端(参考图l和图4)。
2) —条肝炎5病毒(HDV)核酶序列位于NDV反基因组序列 (antigenomic sequence)后面,以发生自切割。
3) —个用于克隆NDV基因组的多克隆位点(MCS)最终位于T7启 动子和HDV核酶之间(参考图4)。
4 )使用pBR322的复制起点(ori)，以使克隆载体稳定地存在于大肠 杆菌中，即使在包括相当于约15 kb核苷酸序列的全NDV瓦基因组的情 况下。
5 )将两个不同的限制性内切酶识别位点5^i5 I和5sfl I置于T7启 动子和瓦基因组的5，-末端之间(NDV的转录在其中起始)，以及置于 HDV核酶和M因组的3，-末端之间(NDV的转录在其中终止)，以便 具体地从NDV"因组转录病毒基因组的两个末端(参考图3)。
如图4中所示，将用于制备连接子的TM pl-p4引物中的TM p2引 物和TM p3引物各1.5 pmol、 TM pl引物和TM p4引物各30 pmol、 5 的10X PCR緩冲物、5 W的2.5 mM dNTP以及2.5 U的Taq聚合酶混合， 然后在该混合物中添加DW以使总体积为50 W。然后，使该混合物反应 在94。C下lmin，随后是25个循环在卯C下30sec、在55C下45sec 及在72匸下15sec,然后在72匸下进一步反应5min。在确证该PCR扩 增子以后，将其克隆至pCR8/GW/Topo TA克隆载体中，所获得的具有全 核苷酸序列的克隆被命名为pCR-TM载体。
通过使用HDV的F和R引物以及才莫板pTV载体(获自Mogam Biotechnology Research Institute的Park MH博士 )的PCR方法，扩增 了包括HDV核酶和T7终止子区的片段，所得到的片段也被克隆至 pCR8/GW/Topo TA克隆载体中，所获得的具有全核普酸序列的克隆被命 名为pCR-HDV。将以限制性内切酶5s" I和A^fe I切割pCR-HDV载体产生的HDV 片段以及以相同限制性内切酶切割的pCR-TM载体用T4 DNA连接酶连 接，并将其转化至ToplOF，感受态细胞中。然后，将所获得的转化载体 命名为pCR-TMH。为了将所述载体稳定地克隆至大肠杆菌中，将通过限 制性内切酶五a 及I和I处理的pCR-TMH载体的T7启动子 -MCS-HDV核酶区亚克隆至pBR322载体(Promega Co" Cat. # D1511) 中，并将所得到的克隆命名为pTMH载体(SEQ ID NO: 84 )。
制备pTMH载体的过程的原理图显示于图5中，亲本载体pTMH的 一般切割图镨和核苷酸序列显示于图6中，所制备的pTMH栽体的核苷 ^列显示于图7中。
在本发明的一个实施方案中，所制备的亲本载体pTMH的限制性内 切酶识别位点如下 (未出现位点)
^grf 爿vfll J ^iJI 5y"51 5s附F I
5s附I 5虛 Eco及V
历wrfin 争I 2T/ml 举I 她I 脂I 肠I 飾I 胸I 泡1 户附el尸v"II 5Vi/1柳S附fll化AI AM 扁I X廳I (出现一个位点)
X附wl 1959 鄉I 2166 5^1 64 55 5VicI 175及wl 0 1605 iVspI 471
7Vr I 49 ，el 293 l卯3I 1584
0 1752 C7fll 43 155
5s附J I30 5w附70 5附r I 1404 1478 丑fl"I 1312 5fl附m 181爿vrll 76 1535 如I 0 如I 35 J/wM882，11 471 (出现两个位点)
鄉I76,256 紐I 71,1843 AMI 345， 715 j/m" 785,2031^1/11 147， 2282 5sfl I 82,1431*
2.2. La Sota毒林的全cDNA的克隆
La Sota/46毒林(AY845400)的RNA提取和cDNA合成通过实施例 1的方法进4亍。2.2.1 NDV全长cDNA的PCR
基于GenBank数据，通过实施例1的方法，通过PCR反应使用在表 8中显示的引物组来扩增相当于15,186 bp的核苦酸序列的全NDVcDNA, 并将其克隆。用于克隆La Sota毒株全基因组基因的引物_
引物 引物序列(5'->3')_
Sl-Fcgtctcgaccaaacagagaatccgtgagttacg (SEQ ID NO: 36)
51- Rccatgggccc tttttagcat tggacg (SEQ ID NO: 37)
52- Faaaagggccc atggtcgagc cc (SEQ ID NO: 38) S2-Rtatcatcgat catgccgaca gtg (SEQ ID NO: 39) S3誦Fcatgatcgat gataaaccca age (SEQ ID NO: 40) S3誦Rtcgcgaatgagccggt egggatccag ac (SEQ ID NO: 41) S4-Ftcgcgacgcaatatgg ctccaaactt tc (SEQ ID NO: 42)
54- Rccgcggtagaacggat gttgtgaagc ctaa (SEQ ID NO: 43)
55- Fccgcggcaccgacaac aagagtcaat catg (SEQ ID NO: 44)
55- Rctcaactagt aagggaacga tcctaaattc c (SEQ ID NO: 45)
56- Fa￡tagt tgagat cctcaaggat gatag (SEQ ID NO: 46) S7曙Rgatcegtacg aatgcagctg aactc (SEQ ID NO: 47) S9國Fcctagg tatt accaaactca aaga (SEQ ID NO: 48)
S9-RGGTCTCaaccaaacaaa gatttggtga atg (SEQ ID NO: 49)
通过RT-PCR获得的La Sota毒林基因的产物的位置显示于图8中。 分别将8部分的La Sota毒林基因插入至TA-克隆载体中的载体图显
示于图9A，用PCR将插入至以处理的该载体中的片段的大小显
示于图9A中。
2.2.2. NDV全长cDNA的克隆和序列分析
在将所扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳评估后，将所得到的凝胶 经GenClean mTM ( Qbio Co.)纯化，并用Topo克隆试剂盒(Invitrogen ) 或XL-Topo克隆试剂盒(Invitrogen)克隆。将得到的每个克隆的所有核 苷酸序列用载体上的引物(例如M13正向、M13反向等)或者用在表9 中显示的引物分析。结果是，选择了具有与以前已知的LaSota毒株相同 核苷酸序列的克隆，即那些其中参发生突变的克隆。[表9用于分析La Sota毒林基因组的核苷紗列的引物_
引物 引物序列(5'->3')_
La-601 taccctggagaggatcctc (SEQ ID NO: 50) La-1261 cgagctaaagctaaccccag (SEQ ID NO: 51) La-1901 agatgcagagatcgacgagc (SEQ ID NO: 52) La-2581 aggcgatatcacagagagta (SEQ ID NO: 53) La國3271 gtgccccaattgtgccaag (SEQ ID NO: 54) S6-F画La actagttgagatcctcaaagatgacgg (SEQ ID NO: 55)
56- R-La tgctctgccctttcaggaccggagctcgccatg (SEQ ID NO: 56)
57- F-La catggcgagctccggtcctgaaagggcagagca (SEQ ID NO: 57) La-5121 cagctcaggaattagactgc (SEQ ID NO- 58)
La-5711 gtcatcgccaactgcaagat (SEQ ID NO: 59) La-7042 ctccggacatctgcaacag (SEQ ID NO: 60) La-8591 aaactcggaagggcagtac (SEQ ID NO: 61) La-9311 ttcgcattcaacctgcagg (SEQ ID NO: 62) La-9971 cttagagatgacaatgtggc (SEQ ID NO: 63) La-10661 gtaagatcagacgactctcc (SEQ ID NO:64) La-11321 tttgagactgttgcaagcc (SEQ ID NO: 65) La-12012 tgtcgcc織tgtaaaggc (SEQ ID NO: 66) La-12721 tacccgaaattggatcagtg (SEQ ID NO: 67) La-13339 catgtctcggaagagcctc (SEQ ID NO: 68) La-13981 atctgcagtgccct譜ga (SEQ ID NO: 69) Lal4976acagtaactgtgactcttaacgaaaatcacatattaataggctcc (SEQ ID NO: 70)
Lal5020R ggagcctattaatatgtgattttcgttaagagtcacagttactgt (SEQ ID NO: 71)
S7-R gatccgtacgaatgctgctgaactc (SEQ ID NO: 72)
NDV-Pt國R tgccactgmtagttgygata (SEQ ID NO: 73) NDcomF15 atacacctcrtcycagacag (SEQ ID NO: 74) 6
La-8892R gagccatgc纖cttggctgtggacc (SEQ ID NO: 75) La-14708 acagtgcacgagacagatcc (SEQ ID NO: 76)La画15092R gtcctaaggagtcagggttc (SEQ ID NO: 77)_
将核苷酸序列未出现突变的所有克隆分别克隆至亲本载体pTMH的 多克隆位点中，如图10中所示。同时，在L基因之间引入了新的限制性 识别位点。该克隆过程显示于图10中。
2.2.3.表达用于形成RNP复合体的NP、 P和L蛋白的载体的制备 为了制备用于表达新城病毒的NP、 P和L蛋白的载体，通过RT-PCR 反应^f吏用在表10中显示的引物分别对La Sota毒林的NP、 P和L基因进 行扩增，并将扩增的产物克隆至TA-克隆栽体中。在对这些克隆进行测序 分析后，仅将核苷酸序列未出现突变的克隆以A^/I处理，并将其亚克隆 至pcDNA6/V5载体的7VWI位点中。 KBNP-4152的ICPI测量
天数12345678总和(指数)
有症状600000006xl
死亡41010101010101074x2
正常00000000
总计二 154
ICPI = 154/80 = 1.925[表12KBNP-C4152R2L的ICPI测量
天数12345678总和(指数)
有症状000000000xl
死亡000000000x2
正常1010101010101010
总计=154
ICPI = 0/80 = 0.0
嵌合船V疫苗的保护效率及免疫原性
荆量 !滴度
疫苗
〖灭活、HA测试
油佐劑)卑位^i原21鹏存錄率
Control"S诚S001/10
0,2±0,S0《,
0
20",S,柳
(麵
臓-41S20,2±0.8 . ±1,0C4152S2L154ia Ms7, ±1.2
C4胶B2L2,2±"(鹏》
，，4〇》 2土复《 3舰.0"154〗0"ta論0'2念0*66 9念i i S〇/3
0鹏)
04, 6i i 15如表14中所示，即使通过HA效价计算的KBNP-C4152R2L的抗原 量比La Sota毒林低，KBNP-C4152R2L的抗体形成能力也大大优于以前 的疫苗。具体而言，与使用LaSota毒糾目比，使用KBNP-C4152R2L时 的抗野毒林的血清学免疫是更优的。
3.9. KBNP-C4152R2L的卵内疫苗试验
KBNP-C4152R2L具有比用于当前疫苗的病毒毒林更低的致病性，其 用于卵内疫苗的可能性较高。为了确证这一点，将卵内疫苗接种于18日 龄鸡胚中，并将孵化率以及在孵化后两周得到的体重增加速率与对照组进 行比较。通过检查2周龄或更大的接种鸡胚的抗体效价，确定了母体抗体 是否纟皮克服，并且比较了免疫水平。在2周后，用所述速发型病毒激发该 鸡胚，并确定了抑制所述病毒的保护率。
用于该试验的鸡胚为通常的产卵雌性小鸡，并将O.lcc的各稀释的疫 苗林(107'0 EID5()/ml)接种于18日龄的鸡胚中。阴性对照组是以O.lcc 的无菌PBS接种的。为了确证母体抗体的水平，在孵化后立即将阴性对 照组的5只鸡胚安乐死，并取所述安乐死的鸡胚的血清。在17天后，测 量每组个体的重量并取血。然后，将毒林KBNP-4152 (106'5 EIDso)接种 至其鼻腔和口腔中。在所述攻击接种后，观测直至10天的存活率。结果 显示于表15中。
[表1SKBNP-C4152R2L的卵内疫苗效应的比较
以嵌合仰V棒BNP"C"52R2L^J&胜化，8天时进行接种 "~
的鸡的孵化率^j"l!JL挂HW激发的防护
存潘率 平均ffl滴度《bfe〉
刺量
!輸'从辨化
疫苗 《活)溶经至n曰齡 的存涂举n錢龄时 的乎均体重穀l曰龄n日龄Iff
对照—转 符ta SOUS皿7! <8il ,3i測
謹濕i7/20( 85.05)溺她ia総 C4成跳 菊， 嗜to"/n
i々 微s.o培 ，"Mt 浏S跳*< S.8歪.2錢》
如表15中所示，KBNP-C4152R2L接种组和阴性对照组的孵化率和 体重增加速率在统计学上没有显著差异。然而，在孵化后17天时， KBNP-C4152R2L接种组中的抗体效价比对照组中的高。即，在对照组的情况下，母体抗体对La Sota毒林的抑制(HI )效价从1天时的平均5.8 ± 2.7降低2.7 ± 1.7。在另一方面，在KBNP-C4152R2L接种组的情况下， 在l天时母体抗体对LaSota毒林的HI效价为4.9 ± 1.1，并显示5.5 ± 1.4的相对较高的HI效价。另外，在激发后，对照组中出现33%的死亡 率，而重组体疫苗接种组中出现100%的存活率。
这些结果比Akzo Nobel N/6 V (NL) Company的题为"Recombinant Newcastle virus as an embryo vaccine"的美国专利"US6，699，479B1"好 得多，其意义在于疫苗获自于通过不使用依照P基因编辑的减毒的新方法 开发的KBNP-C4152R2L。
最近，发达国家已优先选择可以在孵化前直接对鸡胚进行疫苗接种的 卵内疫苗，这是因为这些疫苗具有接种简单和经济性的特点。然而，在现 在已知的应用于新城疫病的活疫苗抹中具有限制，因为这些毒林对于鸡胚 有致病性。在另一方面，已确认本发明的KBNP-C4152R2L在鸡胚中无 致病性，并且预期应用KBNP-C4152R2L作为卵内疫苗的价值是很高的。
如上文所述，本发明的新城疫病毒具有与同时在国内及整个亚洲流4亍 的速发型新城疫病毒类似的抗原性。另外，因为本发明的新城疫病毒具有 与现在使用的疫苗林类似或显著较低的致病性，所以该疫苗可被用作卵内 疫苗。另外，通过点突变获得致病性的可能性要显著低于以前的疫苗抹。 因此，本发明的新城疫病毒可用于制备灭活疫苗、活疫苗及卵内疫苗，用 于在国内及整个亚洲预防新城疫病。
权利要求
1.一种用于转录新城疫病毒基因组的载体，包括编码低致病性新城疫病毒的NP、P、M和L蛋白的核苷酸序列，所述低致病性新城疫病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式1所表示的氨基酸序列；和编码高致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷酸序列，所述高致病性新城疫病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式2所表示的氨基酸序列，其中包括在所述载体中的F蛋白编码序列的特征在于，以任一选自以下的密码子替换编码所述高致病性新城疫病毒的F蛋白的第115位氨基酸的密码子包括GCA、GCC、GCG和GCU的丙氨酸密码子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密码子；包括UUC和UUU的苯丙氨酸密码子；包括AUC和AUU的异亮氨酸密码子；包括UUA和UUG的亮氨酸密码子；包括UCA、UCC、UCG和UCU的丝氨酸密码子；包括ACC和ACU的苏氨酸密码子；包括GUA、GUC、GUG和GUU的缬氨酸密码子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密码子式1113-X1X2X3X4-116其中X1、X3和X4独立地为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且X2选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸。式2113-X4X5X7X8-116其中X5、X6和X7独立地选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸，且X5和X7不同时为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且X8为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
2.根据权利要求l的载体，其中所述^f^it病性新城疫病毒选自基因n型 新城疫病毒，所述高致病性新城疫病毒选自基因vi和vn型新城疫病毒。
3. 根据权利要求2的载体，其中所述4级病性新城疫病毒为La Sota/46 毒林(AY845400 )，所述高致病性新城疫病毒为KBNP-C4152 ( KCTC 10919BP )o
4. 才Mt权利要求l的载体，其中编码所述HN蛋白的核苷酸序列为编码 重组体HN蛋白的核苷齡列，其中将所述^Jt病性新城疫病毒的HN蛋白的 第570位后的M酸序列连接至所述高致病性新城疫病毒的HN蛋白第569 位g的C-末端。
5. 根据权利要求l的载体，具有SEQH)NO:l的核苷斷列。
6. —种新城疫病^4林，包括编码^Jt病性新城疫病毒的NP、 P、 M和L蛋白的核苷斷列，所 述^Jt病性新城疫病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式1所表示的M酸 序列；和编码高致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苦酸序列，所述高致 病性新城疫病毒在F蛋白的笫113-116位具有下文式2所表示的絲斷列，其中包括在所述毒抹中的F蛋白编码序列的特征在于，以任一选自以下 的密码子替换编码所述高致病性新城疫病毒的F蛋白的第115位氨基酸的密码 子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸密码子；包括GAC和GAU 的天冬氨酸密码子；包括UUC和UUU的苯丙氨酸密码子；包括AUC和AUU 的异亮氨酸密码子；包括UUA和UUG的亮氨酸密码子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的丝氨酸密码子；包括ACC和ACU的苏氨酸密码子；包括 GUA、 GUC、 GUG和GUU的缬氨酸密码子；以及包括UAC和UAU的酪 氨酸密码子式l113-X!X2X3X4國U6其中&、 X3和X4独立地为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且X2选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半J3t^酸、^酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸， 式2113-X4XsX7Xg-116其中X5、 X6和X7独立itk^自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、曱石錄酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、M酰胺、甘氨酸、丝 氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸，且Xs和X7不同时为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且 Xs为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
7. 根据权利要求6的毒抹，其中所述^Jt病性新城疫病"^选自基因n型新城疫病毒，所述高致病性新城疫病毒选自基因vi型和vn型新城疫病毒。
8. 根据权利要求7的毒林，其中所述低致病性新城疫病毒为La Sota/46 毒抹(AY845400 )，所述高致病性新城疫病毒为KBNP-C4152 ( KCTC 薩9BP )。
9. 根据权利要求6的泰眛，其中编码所述HN蛋白的核苷酸序列为编码 重组体HN蛋白的核苷齡列，其中所述4組病性新城疫病毒的HN蛋白的第 570位后的M酸序列连接至所述高致病性新城疫病毒的HN蛋白第569位残 基的C-末端。
10. 根据权利要求6的毒林，其中所述毒林为KCTC 10984BP。
11. 一种制备重组体新城疫病毒的方法，包括下述步骤 将编码低致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷酸序列以高致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷^列替换，所述4級病性新城疫病毒在F 蛋白的第113-116位具有下文式1所表示的絲断列，所述高致病性新城疫 病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式2所表示的M,列；以任一选自以下的密码子替换编码所述高致病性新城疫病毒的F蛋白的 第115位氨基酸的密码子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸密码子； 包括GAC和GAU的天冬氨酸密码子；包括UUC和UUU的苯丙氨酸密码子； 包括AUC和AUU的异亮氨酸密码子；包括UUA和UUG的亮氨酸密码子； 包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的丝氨酸密码子；包括ACC和ACU的苏 氨酸密码子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的缬氨酸密码子；以及包括 UAC和UAU的酪氨酸密码子式l<formula>formula see original document page 4</formula>其中&、 X3和X4独立地为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且 X2选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲减氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色 氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、M酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸，式2<formula>formula see original document page 5</formula>其中X5、 X6和X7独立地选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲减氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝 氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸，且Xs和X7不同时为精氨酸(R)或赖氨酸(K),并且 Xs为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
12. 根据权利要求ll的方法，其中所述4敏病性新城疫病毒选自基因n型新城疫病毒，所述高致病性新城疫病毒选自基因VI和VII型新城疫病毒。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述^Jt病性新城疫病毒为La Sota/46 毒林(AY845400 )，所述高致病性新城疫病毒为KBNP-C4152 (KCTC 10919BP)。
14. 根据权利要求ll的方法，另外包括以下步骤对编码所述HN蛋白 的核苷酸序列进^#饰以编码一种重组体HN蛋白，其中将所述低致病性新城 疫病毒的HN蛋白的第570位后的^J^酸序列连接至所述高致病性新城疫病毒 的HN蛋白第569位g的C-末端。
15. 根据权利要求ll的方法，其特M于将所述栽体用于转a利要求 1-5任一项中限定的重组体新城疫病毒基因组。
16. 根据权利要求11的方法，其中所述重组体新城疫病毒为KCTC 10984BP。
17. —种减毒并改进新城疫病毒的抗原性和稳定性的方法，包括下述步骤 将编码^ft病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷斷列以高致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷断列替换，所述^ft病性新城疫病毒在F 蛋白的第113-116位具有下文式1所表示的^酸序列，所述高致病性新城疫 病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式2所表示的^^^列；以任一选自以下的密码子替换编码所述高致病性新城疫病毒的F蛋白的 第115位氨基酸的密码子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸密码子； 包括GAC和GAU的天冬氨酸密码子；包括UUC和UUU的苯丙氨酸密码子； 包括AUC和AUU的异亮氨酸密码子；包括UUA和UUG的亮氨酸密码子； 包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的丝氨酸密码子；包括ACC和ACU的苏氨酸密码子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的缬氨酸密码子；以及包括 UAC和UAU的酪氨酸密码子 式l113^X2X3X4-116其中Xp X3和X4独立地为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且 X2选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲减氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、a酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸， 式2113-X4X5X7X8-116其中X5、 X6和X7独立地选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲M酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酖胺、甘氨酸、丝 氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸，且Xs和X7不同时为精氨酸(R)或赖氨酸(K),并且 Xs为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
18. 才緣权利要求17的方法，另外包括以下步骤对编码所述HN蛋白 的核苷酸序列进行修饰以编码一种重组体HN蛋白，其中将所述低致病性新城 疫病毒的HN蛋白的第570位后的M断列连接至所述高致病性新城疫病毒 的HN蛋白第569位tt的C-末端。
19. 一种新城疫病疫苗，含有权利要求6-10任一项中所限定的重组体新 城疫病"^^林。
20. 才娥权利要求19的疫苗，其中所述疫苗的使用类型选自灭活死疫苗、 活疫苗和卵内疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种用于转录新城疫病毒(NDV)基因组的重组体载体、一个由该载体制备的具有致病性NDV表面抗原的减毒重组体NDV毒株、一种使用该载体制备具有低致病性和抗新城疫病(ND)的高防护效力的重组体NDV的方法以及一种抗包含所述重组体NDV的ND的疫苗。
文档编号C12N15/63GK101595220SQ200680056436
公开日2009年12月2日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月26日
发明者安映珍, 朴昤浩, 权赫俊, 赵瑄熙, 金兑恩, 金善中, 金日焕, 金泰焕, 金采铉, 韩长赫, 高米订 申请人:Kbnp株式会社;Biopoa株式会社