专利名称：一种具有单侧延长臂发夹型dna探针的dna芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物芯片，特别涉及一种具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片。
背景技术：
探针技术是生物芯片技术的核心。发夹型DNA探针又叫分子信标(molecular beacon)是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(fluores-cenceresonance energy transfer，FRET)现象设计。空间结构上呈茎环结构。环序列是与靶核酸互补的探针；茎由与靶序列无关的互补序列构成；茎的两端分别连上一个荧光分子和一个淬灭分子。当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收，可检测到荧光。与常规核酸探针相比，发夹型DNA探针的优势明显A.非常高的特异性。B.非常高的灵敏度。C.液相杂交检测效率高。D.有效消除核酸交叉污染。E.可进行核酸实时检测。F.可实现核酸的大规模自动化检测。G.对活体内核酸动态进行检测等。在用于核酸分子检测的基因芯片领域，目前使用最广泛的DNA探针主要是寡核苷酸探针Oligo、cDNA、PNA探针等，发夹型DNA探针具有上述诸多独特优势，但由于受分子结构的限制，目前发夹型DNA探针在芯片表面的固定难题成为制约其在生物芯片领域运用的主要障碍，其非常高的特异性和灵敏度、液相杂交检测效率高等优势在芯片领域难以得到有效发挥。为此国内外许多学者重点研究怎样解决发夹型DNA探针在芯片表面的固定问题。但通常都是在发夹型DNA探针的茎结构修饰上作主研究方向，最多见的是修饰生物素-亲和素(biotin-avidin)生物素(biotin)修饰到发夹型DNA探针的茎臂，亲和素(avidin)固定到芯片表面，通过生物素-亲和素(biotin-avidin)之间的结合力固定发夹型DNA探针，这种修饰生物素-亲和素的发夹型DNA探针有两个主要弱点1，发夹型DNA探针茎结构修饰有很高的技术难度(国内目前还未见报道)；2，茎臂修饰生物素(biotin)发夹型DNA探针与芯片表面亲和素(avidin)结合无特异性对中、高密度芯片难以做到“点对点杂交”。发夹型DNA探针的优势在于“液-液相杂交”时的高特异性和高灵敏性即发夹型DNA探针与靶序列先在试管里高特异/高灵敏杂交，复合体再与芯片表面的“探针”(亲和素avidin)结合；由于生物素-亲和素(biotin-avidin)结合方式无特异性，同样固定在芯片表面的亲和素(avidin)无特异性，从而导致多样本靶序列与特异性发夹型DNA探针杂交体在与芯片表面的亲和素(avitin)结合时无特异性，这种无特异性的芯片结合使得发夹型DNA探针对中、高密度芯片难以做到“点对点杂交”。芯片杂交时是整张芯片表面所有位点同时浸没在杂交液中，依靠探针与靶序列的特异性识别保证多样本检测的特异性“点对点杂交”。由于生物素-亲和素(biotin-avidin)结合方式无特异性，修饰在发夹探针茎臂上的生物素与固定在芯片表面的亲和素之间结合无特异性，这种无特异性的芯片结合导致所有靶序列样本都可与芯片表面所有位点结合，从而引起混乱无法区分使用。传统茎臂修饰发夹型DNA探针由于无法保证杂交特异性，在高密度芯片领域几乎无法实际使用。由于这两大技术缺陷的存在从而极大地限制了发夹型DNA探针在芯片领域的运用。
我们绕开国内外学者在发夹型DNA探针茎臂修饰上作主研方向的思路，在发夹型DNA探针茎臂长度上做突破，设计了全新型的发夹型DNA探针单侧延长臂发夹型DNA探针。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种在保证了发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性，对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”的同时，使发夹型DNA探针在芯片表面的固定容易，绕开了发夹型DNA探针茎臂修饰难题，使其非常高的特异性和灵敏度、液相杂交检测效率高、大规模自动化检测等独有技术优势在生物芯片领域得到充分发挥的具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片，包括发夹型DNA探针、载体，其特征在于所述发夹型DNA探针的一侧茎臂为合成DNA链时自然延长的单链核苷酸臂，该茎臂的长度长于另一茎臂的长度；在载体表面固定有与自然延长的单链核苷酸臂碱基序列完全互补配对的寡核苷酸探针，自然延长的单链核苷酸臂通过固定在载体表面的寡核苷酸探针，依据碱基互补配对原则进行特异性杂交，使自然延长的单链核苷酸臂探针特异性地杂交到载体上的相应位置。
优选的，所述单侧延长臂发夹型DNA探针中，每一组或每一个自然延长的单链核苷酸臂的长度各不相同，其自然延长部分的长度为10～80mer。
优选的，所述单侧延长臂发夹型DNA探针中每一组或每一个自然延长的单链核苷酸臂的长度相同，并具有不同碱基序列。
优选的，所述的自然延长的单链核苷酸臂在淬灭分子3′一侧，淬灭分子被修饰在中间与对侧互补茎臂5′端标记荧光分子对应部位的碱基上。
单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片的制备步骤包括1、首先准确定位要检测的目标序列，通过相应软件(如Beacon Designer)设计发夹型DNA探针和单侧延长臂DNA，把两者组合后再经软件(如DNAstar)验证不会形成除发夹结构外的其他二级结构，并经gengbank比对后就可完成设计工作，与单侧延长臂DNA相匹配的Oligo DNA探针(固定在芯片表面)相对更容易。
2、DNA的人工合成是早已成熟的技术，各大生物工程公司都可完成，如上海生物工程公司的ABI394高通量DNA合成仪等。
3、Oligo DNA的人工化学合成现在一般都采用b-乙腈亚磷酰胺化学合成Oligo DNA，合成时从3′→5′方向进行，通常3′端的第一个碱基结合在Glass担体(Controlled Pore Glass，CPG)上。合成的详细过程见图3，现简要说明如下1)脱掉附加在CPG担体上的第一个碱基5′-OH基团上的保护基(DMTr)，准备附加下一个新的碱基；2)活化新的碱基单体(Phosphoramidite)，准备与第一个碱基进行反应；3)第二个碱基与第一个碱基发生偶联反应；4)将没有反应的第一个碱基的5′-OH加帽封死(Capping)，使其不再进一步参与反应；5)将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯(即将三价磷氧化成五价磷)。
6)重复进行Step1～Step5的循环，直至合成完所需的Oligo DNA序列。
7)合成结束后，将Oligo DNA分子从CPG上切下，再进行进一步的纯化。
4、本发明单侧延长臂发夹型DNA探针的合成原理与普通Oligo DNA的人工化学合成基本相同，特殊一点是带碱基T的淬灭分子(通常为DABCYL)和修饰荧光分子(如FAM\EDANS\Coumarin\TET\TAMRA\TexasRed等)按预先设计好的序列在DNA合成仪上合成。
5、合成后还应进行一系列的纯化，这样就得到纯化好的单侧延长臂发夹型DNA探针，以供使用。
单侧延长臂发夹型DNA探针是把发夹型DNA探针一侧茎臂(通常是挂淬灭分子一侧)设计为自然延长的单链核苷酸臂，淬灭分子修饰在自然延长的单链核苷酸臂上与荧光分子对应的同侧位置，参见附图1、附图2。茎结构单侧单链核苷酸臂自然延长无须修饰生物素(biotin)、多肽等大分子，极大简化了技术难度。发夹型DNA探针与芯片表面结合可选择两种方式第一发夹型DNA探针茎结构单侧延长臂可根据需要(对多样本靶序列)设计为不同碱基序列和不同长度，另外设计一段与单侧延长臂碱基序列完全互补配对的寡核苷酸探针oligo固定在芯片表面，这样单侧延长臂与固定在芯片表面的寡核苷酸探针oligo依据碱基互补配对原则进行特异性杂交，使发夹型DNA探针特异性地杂交到芯片上的相应位置(其他位置的寡核苷酸探针由于碱基序列不同不能杂交结合)，对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”。第二可在发夹型DNA探针茎结构单侧延长臂末端修饰上氨基、巯基等早已成熟的探针—芯片修饰技术，使发夹型DNA探针固定在芯片表面。
本发明的创新及主要优点如下，参见附图21、可绕开发夹型DNA探针茎结构修饰的技术难题。
2、完全可以保证发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性，对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”。
绕开国内外学者为解决发夹型DNA探针在芯片表面的固定难题而在探针茎臂修饰上作主研方向的思路，在探针茎臂长度设计上突破，在保证了发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性(对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”)同时，较好地解决了发夹型DNA探针在芯片表面的固定难题。克服了长久以来发夹型DNA探针在芯片领域运用受到极大限制的痼疾，使其非常高的特异性和灵敏度、液相杂交检测效率高、大规模自动化检测等独有技术优势在生物芯片领域得到充分发挥。
单侧延长臂发夹型DNA探针及芯片固定技术主要用于病源微生物基因检测(如HBV、HAV、金黄色葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌等)、其他生物物种的基因检测、基因突变性和多态性检测、基因表达谱分析、肿瘤分子分型、新药的研究与开发等。
本发明的一种具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片，在保证了发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性，对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”的同时，使发夹型DNA探针在芯片表面的固定容易，绕开了发夹型DNA探针茎臂修饰难题，使其非常高的特异性和灵敏度、液相杂交检测效率高、大规模自动化检测等独有技术优势在生物芯片领域得到充分发挥。
图1是本发明的单侧延长臂发夹探针与芯片表面寡核苷酸探针结构示意图；
图2是本发明单侧延长臂发夹型DNA探针与芯片表面寡核苷酸探针高特异性杂交对中、高密度芯片可做到“点对点杂交”示意图；其中，A为探针单侧延长臂与芯片表面oligo杂交B为发夹探针单侧延长臂依靠不同碱基序列或长度保证特异性；C为单侧延长臂发夹探针对中、高密度芯片可高特异性杂交；图3是本发明Oligo DNA的合成过程示意图；图4是本发明MRSA多重耐药基因谱单侧延长臂发夹型DNA探针芯片构建示意图；其中，AMRSA各易变基因扩增片段；B扩增片段与对应发夹探针特异性“液-液相杂交”；C如果某段基因有多个突变点，可采用多重发夹探针覆盖；D由此构成MRSA多重耐药基因谱单侧延长臂发夹探针芯片；D1耐β-内酰胺类；D2耐喹诺酮类；D3耐四环素类；D4耐MLSB；D5耐氨基糖苷类；D6耐万古霉素具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的具体实施方式
范围之中，如图1、图2、图3、图4所示合成并检测的结核杆菌通用单侧延长臂发夹型DNA探针。
1，针对结核杆菌保守序列IS986通过软件Primer 5.0设计靶序列(1)下面的序列表中，中间为扩增目标产物为245bp(加粗)，两端为扩增引物(字下加线表示)Primer15’-CGTGAGGGATCGAGGTGGC-3’Primer25’-GCGTAGGCTCGGTGACAAA-3’
(2)针对中间245bp扩增产物通过软件(Beacon Designer)设计靶序列774-797上面的序列表中斜体文字序列表示5’-tccagcg ccgcttcgga ccaccag-3’2，设计环序列即以上靶序列的对应互补序列5’-CTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGA-3’3，设计互补的茎臂碱基序列5’-GTCGA-3’，3’-CAGCT-5’。
4.设计单侧延长臂碱基序列5’-ATGGTGCAGCGTCG-3’与单侧延长臂互补的Oligo5’-CGACGCTGCACCAT---3’并经genebank和DNA star软件证实并保证特异性及不会形成除发夹结构以外的其他结构。
5，选择FAM-DABCYL为荧光-淬灭分子对，在DNA合成仪上(如ABI394高通量DNA合成仪)合成上述针对结核杆菌保守序列IS986非对称环发夹型DNA探针及Oligo(氨基修饰在5’端)。
结核杆菌保守序列IS986单侧延长臂发夹型DNA探针5’--荧光 Oligo氨基-5’-GCCATGAGTCCAT-3’6，后续实验步骤为扩增、纯化、杂交、芯片冲洗扫描、荧光信号数据分析等芯片实验常规步骤(此处略)。
权利要求
1.一种具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片，包括发夹型DNA探针、芯片载体，其特征在于所述发夹型DNA探针的一侧茎臂为合成DNA链时自然延长的单链核苷酸臂，该茎臂的长度长于另一茎臂的长度；在芯片载体表面固定有与自然延长的单链核苷酸臂碱基序列完全互补配对的寡核苷酸探针，自然延长的单链核苷酸臂通过固定在芯片载体表面的寡核苷酸探针，依据碱基互补配对原则进行特异性杂交，使自然延长的单链核苷酸臂探针特异性地杂交到芯片载体上的相应位置。
2.根据权利要求1所述的具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片，其特征在于所述单侧延长臂发夹型DNA探针中，每一组或每一个自然延长的单链核苷酸臂的长度各不相同，其自然延长部分的长度为10～80mer。
3.根据权利要求1所述的具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片，其特征在于所述单侧延长臂发夹型DNA探针中每一组或每一个自然延长的单链核苷酸臂的长度相同，并具有不同碱基序列。
4.根据权利要求1所述的具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片，其特征在于所述的自然延长的单链核苷酸臂在淬灭分子3′一侧，淬灭分子被修饰在中间与对侧互补茎臂5′端标记荧光分子对应部位的碱基上。
全文摘要
本发明公开了一种具有单侧延长臂发夹型DNA探针的DNA芯片，包括发夹型DNA探针、载体，所述发夹型DNA探针的一侧茎臂为合成DNA链时自然延长的单链核苷酸臂，该茎臂的长度长于另一茎臂的长度；自然延长的单链核苷酸臂通过固定在载体表面的寡核苷酸探针，依据碱基互补配对原则，使自然延长的单链核苷酸臂探针特异性地杂交到载体上的相应位置。本发明在保证了发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性，对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”的同时，使发夹型DNA探针在芯片表面的固定容易，绕开了发夹型DNA探针茎臂修饰难题，使其非常高的特异性和灵敏度、液相杂交检测效率高、大规模自动化检测等独有技术优势在生物芯片领域得到充分发挥。
文档编号C12Q1/68GK101041863SQ20071007841
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月23日 优先权日2007年4月23日
发明者陈庆海, 府伟灵, 匡红 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院