专利名称：一种重组杆状病毒载体骨架质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种重组杆状病毒载体骨架质粒及其应用。
背景技术：
杆状病毒载体是目前应用十分广泛的病毒载体之一，广泛应用于基因治疗、基因功能研 究、疫苗开发等领域。杆状病毒是昆虫病毒中最大的一个科，其宿主范围主要集中在昆虫纲 鳞翅目。目前，用于外源基因表达的昆虫杆状病毒仅限于核多角体病毒属，其中苜蓿银纹蛾 多粒包埋体核多角型病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrosis virus, AcMNPV) 和草地贪夜蛾细胞系统是国际上普遍采用的杆状病毒表达载体系统研究模型。1983年Smith 等首次报道利用AcMNPV在草地贪夜蛾细胞成功地表达了人P-2干扰素，1993年Luckow 等成功的将杆状病毒体统改造成bac-to-bac系统(Luckowetal， 1993)，主要用于在昆虫细胞 中大量表达外源基因。杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统，在外源基因表达方面具有 糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰过程，表达产物的生物学特性与天然产物相似，且表达 效率高，据报道，在感染细胞中重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的50% (Luckow and Summers, 1989)。长期以来，由于其宿主特异性，这种高表达的载体仅限用于介导外源基因在其受纳昆虫细 胞内表达。近年来的研究发现，杆状病毒可进入某些哺乳动物细胞，但其进入细胞后并不发 生复制和基因转录。因此在杆状病毒载体中引入可在哺乳动物细胞中作用的启动子如RSV、 CMV等，可通过杆状病毒将外源基因转入哺乳动物细胞中进行表达。1995年,Hofmann等首 次报道了将由巨细胞病毒极早期启动子(CMV-IE)驱动的萤光素酶基因重组至AcMNPV基因 组，并用此重组AcMNPV感染几种不同的哺乳动物细胞，结果表明此重组AcMNPV能感染 原代人肝细胞且高效地表达了报告基因，其介导的报告基因的表达效率高于用磷酸钙沉淀法 和脂质体转染法。目前以杆状病毒作为载体，利用不同启动子己经实现了不同物种，不同组 织来源的很多细胞系的基因转移和表达。杆状病毒成为继脂质体、重组逆转录病毒、腺病毒 等传统方法外又一个对哺乳动物进行基因转移的工具。构建杆状病毒表达系统有多种方法，主要包括NPV DNA线性化技术，bac-to-bac表达系 统，酵母内重组法，杆状病毒-S2系统等，其中由GIBCO公司开发的bac-to-bac表达系统是 转座子介导的杆状病毒重组系统，它是目前应用最为广泛的杆状病毒重组系统。该系统主要 由供体质粒pFastBac和原核细胞(DH10Bac)组成。在DH10Bac中含有被修饰的AcMNPV 被称之为Bacmid， Bacmid既可感染鳞翅目昆虫细胞，又可以在大肠杆菌中复制。Bacmid的 构建策略为在AcMNPV多角体蛋白基因的相应位点克隆进卡那霉素抗性基因，Tn7细菌转 座子靶位点attTn7，来源于pUC质粒的LacZ肽段编码基因及能够保证基因组自主复制和以 稳定的低拷贝数存在于细菌中的mini-F复制子。pFastBac为供体质粒，在其T117左右序列之间是多角体蛋白启动子。供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下插入到 Bacmid中，从而干扰LacZ的表达，这样就可以通过细菌菌落蓝白筛选直接小量提取重组 Bacmid质粒DNA，再用脂质体法转染即可获得重组病毒。该系统重组率几乎为100 % ，且 重组迅速。甲病毒是单股、正链的RNA病毒，其成员包括辛德毕斯病毒、Semliki森林病毒、委内 瑞拉马脑炎病毒等，现均已开发成复制子而成为受广泛关注的真核表达载体。复制子载体利 用复制子特有的RNA复制酶提高翻译模板mRNA的量来实现外源基因高水平表达(Kohno etal, 1998)。SFV复制子载体是基于Semliki森林病毒的真核表达载体，主要包括基于RNA的SFV复 制子系统和基于DNA的SFV复制子系统，后者由于其更高的安全性和稳定性而被更广泛的采 用。基于DNA的SFV复制子载体系统构建策略为将SFV的cDNA置于真核表达载体启动子下游 (如人巨细胞病毒(CMV))的早期启动子/增强子)，用外源基因代替结构蛋白基因， 一旦由强 启动子驱动的甲病毒非结构蛋白编码的复制酶复合物合成，便可介导细胞浆内重组RNA的 大量复制，从而导致外源基因编码的mRNAs的高水平表达(Hsueta1,2004)，同时，甲病毒复 制子不仅具有自主复制功能，而且具有与完整甲病毒相同的诱导宿主细胞凋亡的特性，使被 转染细胞在短时间内发生凋亡。由于这些显著的优点，SFV复制子己被广泛用于表达外源基 因和构建复制子疫苗以及基因治疗导向载体制备等领域，尤其是在疫苗研究方面，已有病毒 和肿瘤复制子候选疫苗进入临床前期及临床试验，显示了其良好的应用前景。杆状病毒介导的哺乳动物基因转移及表达受多方面条件的影响，为获得外源基因的高效 表达，研究者已尝试采用多种启动子来改造杆状病毒载体。如RSV启动子，CMV-IE启动子， 鸡(3-actin启动子等被广泛的应用于在哺乳动物细胞中表达外源基因，本发明利用SFV的亚 启动子来构建杆状病毒，旨在构建一个既能实现外源基因的高效表达，又能诱导凋亡的载体， 为基因治疗提供一个安全，高效的表达载体。发明内容本发明的目的在于提供一种新型的杆状病毒载体骨架质粒pFB-G-SFV，利用该骨架质粒， 可以和含有Bacmid的大肠杆菌(DH10Bac)以及昆虫细胞(sf-9细胞)共同组成的一种新型 的杆状病毒包装系统。该质粒pFB-G-SFV提供两个酶切位点BamH I和Smal I供外源基因插入。 将外源基因克隆入该载体后，转化含有Bacmid的大肠杆菌(DH10Bac)，通过蓝白斑筛选可获 得转入外源基因的重组Bacmid，提取该Bacmid，转染昆虫细胞(sf-9细胞)，即可获得含有 外源基因的重组杆状病毒。本发明所述载体的主要优点在于(1)本发明所述的重组杆状 病毒骨架质粒所构成的包装系统具备Bac-to-bac系统出毒快，稳定性好，产率高的特点。包装 出的重组杆状病毒能够在哺乳动物细胞中自主复制，从而实现外源基因的高量表达。(2)本 发明所述的重组杆状病毒骨架质粒所构成的包装系统包装出的重组杆状病毒在哺乳动物细胞 中自主复制的过程中，能够产生dsRNA， dsRNA的产生，能够促进免疫调节和细胞活性因子的产生。(3)本发明所述的重组杆状病毒骨架质粒所构成的包装系统包装出的重组杆状病毒 能够诱导被转导细胞的凋亡，从而促进免疫反应，减少DNA整合到宿主染色体风险。本发明所述的骨架质粒是以pFastBac-Dual (购自于Invitrogen公司)，pSFVl (购自于 Invitrogen公司)和pCI-neo (购自于Invitrogen公司)为材料，通过下述方法获得以Sphl 和Spel酶切pSFVl ，回收包含SFV非结构蛋白的8.7Kb的片段，置换pFastBac-Dual的Pp,o 和PpH启动子，得到中间质粒pFB-G-SFVl。以pCI-neo为模板分别扩增HCMV IE Enhancer/Promoter元件和SV40晚期poly(A)终止信号序歹iJ，分别插入SFV片段中Sp6启动子 上游单一酶切位点Sphl和SFV片段中A69下游单一酶切位点Spel。最终获得质粒 pFB-G-SFV，(携带该质粒的大肠杆菌(&cteWcWa co//)DH5a/pFB-G-SFV于2007年5月16 日保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO: M207070)。因此在pFB-G-SFV质粒上，在Tn7之间含有由CMV-SFV组成的表达盒和 庆大青霉素抗性基因。SFV上保留有BamHI和Small两个酶切位点供外源基因的插入。本发 明所述的重组杆状病毒骨架质粒所构成的包装系统保留了 Bac-to-Bac系统出毒快，稳定性好， 产率高的特点，包装出的重组杆状病毒整合了SFV载体的外源基因高表达效率，产生dsRNA中间体，诱导凋亡等优良特性。为疫苗开发提供了一个新工具。
图l:是本发明公开的骨架质粒构建流程图2:是本发明公开的骨架质粒与pFastBac-Dual骨架质粒相比，Sphl和Spel两个酶切位点 间序列的示意中2A显示的是本发明公开的骨架质粒Sphl和Spel两个酶切位点间序列的示意图，在 两个酶切位点间包含了 HCMV IE Enhancer/Promoter元件、SFV的非结构蛋白nsPl、 nsP2、 nsP3和nsP4，以及SV40晚期poly(A)终止信号序列。图2B显示的是未经过改造的Bac-to-Bac 系统pFastBac-Dual骨架质粒Sphl和Spel两个酶切位点间序列的示意图，在两个酶切位点间， 包含两个启动子PplO和Pph，以及多个限制性内切酶位点。 图3 :重组质粒pFB-G-SFV-EGFP与重组质粒pFB-G-CMV-EGFP的比较示意图。其中图3A为重组质粒pFB-G-SFV-EGFP，主要含有HCMV IE Enhancer/Promoter元件、 SFV的非结构蛋白nsPl、 nsP2、 nsP3和nsP4，以及SV40晚期poly(A)终止信号序列，以及 外源基因EGFP。图3B为重组质粒pFB-G-CMV-EGFP，仅含有HCMV IE Enhancer/Promoter 元件和外源基因EGFP。图4是本发明公开的骨架质粒与DH10Bac大肠杆菌，以及昆虫细胞SF-9包装重组杆状病毒 的示意图。该大肠杆菌含有穿梭质粒Bacmid，该穿梭质粒上含有Tn7转座子的靶序列attTn7，将本 发明公开的骨架质粒转化大肠杆菌，通过转座获得重组穿梭质粒，然后将该重组穿梭质粒转5染昆虫细胞，即可包装出重组杆状病毒。图5是利用本发明中的骨架质粒构建获得的表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组杆状病毒接种 HEK-293细胞和BHK-21细胞后荧光显微镜观察和流式细胞仪的分析结果。 其中图5A为在荧光显微镜上光学条件下接种重组杆状病毒的HEK-293细胞的观察结果， 图5B为荧光显微镜下接种表达EGFP的重组杆状病毒的BHK-21细胞的荧光观察结果，图 5C为利用流式细胞仪分析表达外源基因EGFP的BHK-21阳性细胞比例，图5D为流式细胞 仪分析表达外源基因EGFP的平均荧光强度。图6是由本发明中的骨架质粒构建获得的重组杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP接种BHK-21细胞 后的凋亡检测。其中图6A为DNA-Ladder的凝胶电泳图片，图6B为caspase-3的活性检测。结果表明 接种重组杆状病毒的BHK-21细胞发生显著的凋亡现象。图7本发明所获得的重组杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP与对照重组杆状病毒Bac-G-CMV-EGFP 分别免疫小鼠后的酶联免疫吸附抗体(ELISA)水平比较。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步描述。实施例l:本发明中的pFB-G-SFV骨架质粒的构建以图1所示的pFastBac-Dual (购自于Invi加gen公司)和pSFV 1 (购自于Invitrogen公司)为材料，按图1所示的流程，构建本发明所说的质粒，具体步骤如下1、 将pFastBac-Dual和pSFVl质粒分别以Sphl和Spel双酶切，分别回收含杆状病毒转移载 体骨架和包含SFV的非结构蛋白nsPsl-4的大片段和线性化的pFastBac-Dual，将这两个片段 连接构建获得中间质粒I即pFB-G-SFVl;2、 以pCI-neo为模板扩增两端带有Sphl酶切位点的HCMV IE Enhancer/Promoter元件，如 图1所示中间片段I ;3、 将步骤2所得的HCMV正Enhancer/Promoter元件插入中间质粒I的Sphl位点，获得中 间质粒II即pFB-G-SFV2;4、 以pCI-neo为模板扩增两端带有Spel酶切位点的SV40晚期poly(A)终止信号序列，得到 如图1所示中间片段II;5、 将步骤4所得SV40晚期poly(A)终止信号序列插入步骤3所示的中间质粒II的Spel位 点，得到本发明所述的质粒pFB-G-SFV。该质粒于2007年5月16日保藏于湖北省武汉市 武汉大学内的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO: M207070。实施例2:利用本发明所述之骨架质粒包装出带有外源基因绿色荧光蛋白(EGFP)的重组 杆状病毒61、 pFB-G-SFV-EGFP重组质粒的构建本实施例中，荧光报告基因EGFP (Genebank序列号1377915)将被用于直接、客观评 价本发明得到的改造载体能否正确表达外源基因，同时比较改造质粒与目前常用的杆状病毒 骨架质粒在转染效率以及表达水平上的差异。以质粒pEGFP-Cl (购自于ClonTech公司)为 模板扩增两端带有BamHI和Small酶切位点的EGFP序列(Genebank序列号1377915)，插 入实施例1中所获质粒pFB-G-SFV的BamHI和Small酶切位点，得到重组质粒 pFB-G-SFV-EGFP。结果如附图3A所示。2、 包含pFB-G-SFV-EGFP重组质粒的转座2.1取出DHlOBac 感受态细胞(购自于Invitrogen公司)冰上融解，用移液枪吸取100nl DH10BaJM感受态细胞于预冷的1.5mlEP管中；2.2轻轻加入约lng的重组质粒pFB-G-SFV-EGFP于感受态细胞中，轻轻敲打管壁使之混匀； 2.3冰上放置30min。 42"循环水浴静止45秒，快速放置冰上2min;2.4在上述EP管中加入90(^1 S.O.C.培养基(购自于武汉武大天源生物科技股份有限公司)，将 EP管置于37。C摇床(225r/min)振摇培养4h;2.5用S.O.C.培养基稀释上述细胞至10—1、 10-2、 10-3;2.6在每块LB培养基(卡那霉素50ng/ml，庆大霉素7路/ml，四环素10照/ml， Bluo-gal 100|ig/ml，异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 40吗/ml)中加入步骤2.5所述稀释液IOOW， 涂布均匀；2.7 37。C培养24—48h。挑取白斑在LB平板上纯化，纯化至第三代。3、 重组Bacmid DNA的分离提取3.1挑取白色克隆于2ml LB液体培养基(含50吗/ml卡那霉素、7吗/ml庆大霉素、10吗/ml 四环素)，37。C摇床250—300r/min培养24h以上；3.2取1.5ml步骤3.1所述的培养物于1.5mlEP管中，14000xg离心lmin。倒去上清液，倒立 于吸水纸上。然后加入0.3ml的溶液I (Tris-HCl(15Mm) ， EDTA (10Mm) ， RNA酶 (lOOpg/ml))用枪头轻轻吹打重悬细胞；3.3加入0.3ml溶液II (NaOH 0.2N，十二烷基磺酸钠1%)，轻轻混匀，室温放置5min (溶 液变清)；3.4缓缓加入0.3ml溶液III (KAc (3M))，轻轻混匀，形成蛋白及DNA沉淀，冰上放置5 — 10min;3.5 14000xg， 25。C离心10min，期间另取一支2ml离心管，加入800(^1异丙醇；3.6轻轻把上清液转入上述含异丙醇的离心管，避免把白色沉淀带入。轻轻倒转离心管数次。 冰上放置5min (该过程可放在一20。C过夜)。25。C离心15min;3.7去上清，倒置离心管于吸水纸上，然后加入70%乙醇洗涤沉淀数次，14000xg， 25。C离心 5min。弃上清；3.8使步骤3.7所述沉淀在空气中自然干燥5 — 10min。加40n!TE溶液，轻敲管底，使溶液位 于管底部。4重组Bacmid转染sf9细胞4.1复苏编号为GDC008昆虫细胞系SF-9 (购于中国武汉大学内中国典型培养物保藏中心的 商业细胞材料，见http:〃www.bio-equip.com/showlequip.asp equipid=14757&division=2604)。4.1.1取冻存于液氮中的sf-9细胞一支，迅速于35-42'C温水中融化，将细胞在25°C， 1000r/min 下离心5min;4丄2弃上清，加入lml含有10%胎牛血清的Grace's培养基(购自于Sigama公司)，轻轻吹打 重悬细胞；4丄3将重悬的细胞加入装有5ml含有10%胎牛血清的Grace's培养基的25cm4音养瓶中， 27'C培养过夜。4.2转染4.2.1在六孔板中以9xl()S个细胞/2ml/孔的密度接种sf-9细胞，27°。培养lh，使细胞贴壁；4.2.2用获得的重组bacmid转染sf-9细胞(梁昌镛，不同杆状病毒诱导哺乳动物细胞抗病毒 效果比较分析，中国科学C辑生命科学2006， 36 (3)， 261-266);4.2.3将六孔板内的细胞孵育5h， 27°C，换上新鲜的Grace's培养基。在27'C培养箱中孵育 72h或直到细胞出现轻微的细胞病变迹象。培养细胞的培养液中即含有携带外源基因EGFP 的重组杆状病毒(Bac-G-SFV-EGFP)。实施例3 (应用实施例l)用利用实施例2所述的方法包装出的Bac-G-SFV-EGFP重组杆状病毒感染乳仓鼠肾细胞 (BHK-21)。1、 在六孔板中以9xl05个细胞/2ml/孔的密度接种编号为GDC010叙利亚仓鼠肾细胞系 BHK-21 (购自于中国武汉大学内中国典型培养物保藏中心的商业细胞材料，见 http:〃www.bio-equip.com/showlequip.asp equipid=14757&division=2604)细胞，37。C培养lh，使细胞贴壁。2、 用含有Ca2+， Mgh的磷酸盐缓冲溶液(PBS，购自于Sigama公司)洗细胞三次，以50个感染 复数的剂量(MOI=50)将杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP接入六孔板细胞中，27。C感染4小时后， 弃掉上清，添加新鲜的含有10%新生牛血清的DMEM (购自于Gibico公司)。3、 将六孔板置于37。C的C02培养箱中，培养48小时，以荧光显微镜和流式细胞仪检测外源 基因EGFP的表达。实施例4 (应用实施例2)用实施例2所述的方法包装出的Bac-G-SFV-EGFP重组杆状病毒感染HEK-293细胞。1、在六孔板中以9xl()S个细胞/2ml/孔的密度接种编号为GDC067人源胚肾细胞系HEK-293(购自于中国武汉大学内中国典型培养物保藏中心的商业细胞材料，见http:〃www.bio-equip.com/showleq.uip.asp equipid=14757&division-2604)， 37。C培养lh， 使细胞贴壁。2、用含有Ca2+， Mg^的磷酸盐缓冲溶液(PBS，购自于Sigama公司)洗细胞三次，以50个感染 复数的剂量(MOI=50)将杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP接入六孔板细胞中，27。C感染4h后， 弃掉上清，添加新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM。3、将六孔板置于37'C 5%0)2培养箱中，培养48h，以荧光显微镜和流式细胞仪检测EGFP 的表达。实施例5 (应用实施例3)利用实施例3中获得的Bac-G-SFV-EGFP重组杆状病毒接种BHK-21细胞进行细胞凋亡检 测。1、 DNA梯度碎片检测(DNA-ladder，方法参照参考文献8)1.1将实施例3中接种杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP的BHK-21细胞用磷酸盐缓冲溶液(PBS，购 自于Sigama公司))洗涤三次后，加入含有lOmM Tris-HCl(pH8.0)、 lOmM EDTA及0.5% Triton X-100的细胞裂解液使细胞裂解。1.2将步骤1.1收集到的细胞裂解物中加入O.l mg/mlRNA酶后置于37'C温箱中，lh后取出。 1.3 12000xg离心25min，使染色体DNA沉淀。1.4转移上清，加入1%的十二垸基磺酸钠，用蛋白酶K (购自于Takara公司)在50'C消化 lh后，用酚仿抽提上清中的DNA，无水乙醇沉淀，然后用含10mMTris(pH8.0)和lmMEDTA的缓冲液重溶。1.5再用1.5。/。的琼脂糖凝胶作DNA片段化的形态分析。如附图5A所示，接种重组杆状病毒 Bac-G-SFV-EGFP的BHK细胞染色体DNA出现明显的片段化，而接种杆状病毒野生型的BHK 细胞染色体DNA仍然保持完整。这表明重组的杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP能够引起BHK细 胞的凋亡。2、 比色测定法测定caspase-3的活性(检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，具 体操作按产品说明书进行)2.1利用细胞刮铲将实施例3中接种杆状病毒的BHK-21细胞收集，1500g离心5min弃去上 请，保留细胞；2.2在收集的沉淀细胞中加入5(HiL预冷的细胞裂解缓冲液(购自南京凯基生物科技发展有限公司，试剂盒附带)，吹打均匀；2.3置冰上裂解30min，其间涡旋振荡3 4次，每次10s;或冻融2 3次，之后用4°C 10000r/min 离心lmin;2.4小心吸取上清(含裂解的蛋白质)转移至新的管中，并放置冰上待用；2.5取少量上清(1 2)LiL)，常规方法(Braford法，张铁雨等，重组人白介素-11蛋白浓度两 种测定方法比较，天然产物研究与开发，2005， 17: 150-151)测定其中的蛋白浓度； 2.6吸取50nL含100 200ng蛋白的细胞裂解上清；如体积不足50pL，用裂解缓冲液(购自 南京凯基生物科技发展有限公司，试剂盒附带)补足至总体积50nL; 2.7加入50)^L的2xreaction buffer (购自南京凯基生物科技发展有限公司，试剂盒附带)；2.8加入5pL caspase-3 substrate (购自南京凯基生物科技发展有限公司，试剂盒附带)，并于 37。C避光孵育4h;2.9底物反应结束后用酶标仪或分光光度计UOO(aL的比色皿)在X=405nm或400nm测定其 吸光值。通过计算OD縣剂/OD阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组caspase-3活化程度。如图5B 所示，接种重组杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP的细胞内的caspase-3活性较其他未处理的细胞有 显著的增高，由于Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3 为关键的执行分子。与DNA断裂、染色体凝聚和凋亡小体形成有关。因此caspase-3的蛋白 水解酶活性的提高可作为细胞凋亡信号。这一结果表明接种重组杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP 的细胞发生了显著的凋亡作用。 实施例6 (应用实施例4)利用传统商用骨架质粒pFastBac-Dual (购自于Invitrogen公司)包装出的重组杆状病毒与 实施例3中获得的Bac-G-SFV-EGFP重组杆状病毒免疫效果的比较。1、 普通重组杆状病毒Bac-G-CMV-EGFP的获得1.1参照程通等(Tong Cheng, et al， A rapid and efficient method to express target genes in mammalian cells by baculovirus, World J Gastroenterol 2004;10(1I):1612-1618)提供的技术路线， 以质粒pFastBac-Dual (购于Invi加gen公司)，质粒pCI-neo (购于Invitrogen公司)，质粒 pEGFP-Cl (购于ClonTech公司)构建出插入外源基因EGFP的重组骨架质粒pFB-G-CMV-EGFP ， 如附图3B所示。1.2参照实施例2的步骤，利用步骤l.l所获得的重组骨架质粒pFB-G-CMV-EGFP，包装出能表 达外源基因EGFP的普通型杆状病毒Bac-G-CMV-EGFP。2、 免疫小鼠的酶联免疫吸附抗体(ELISA)水平比较 将本发明所获得的重组杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP与作为对照的杆状病毒Bac-G-CMV-EGFP 分别以10 fu/mL的剂量免疫4-6周龄的Balb/c小鼠(购自武汉疾病预防控制中心)，每组6只， 100^1/只，于后腿肌肉注射，共免疫2次，每次间隔3周，并设磷酸缓冲液(PBS)免疫组作为阴性对照组。于二免后3周采集小鼠血液，检测血清中EGFP特异性的酶联免疫吸附抗体水平。 结果如图7所示，在首次免疫后第6周，两种杆状病毒免疫组抗体水平升高迅速，其中，本发 明所获得的重组杆状病毒Bac-G-SFV-EGFP免疫组平均抗体滴度水平达到l: 8250，而对照 Bac-G-CMV-EGFP免疫组抗体滴度水平只为l: 5000，磷酸缓冲液(PBS)免疫组未检测至ljEGFP 特异性的酶联免疫吸附抗体。该结果表明由本发明所获得的杆状病毒骨架质粒所包装出的杆 状病毒，在表达外源基因，促进免疫反应等多方面要显著优于普通杆状病毒骨架质粒。参考文献1 Smith GE ， Summers MD , Fraser MJ . Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol Cell Biol ,1983 ,3 (12) :2156-2165.2 Luckow VA， Baculovirus systems for the expression of human gene products. C鮮.C*p/". 所o化c/mo/. 1993， 4(5): 564 - 57213 Luckow V A ,Summers M D. High level expression of nonfused foreign genes with y4咖gra; /^ Ca争m/a nuclear polyhedrosis virus expression vector [J] . Vioriogy ，1989 ，170(1) :31 39.4 Hofmann C, Sandig V, Jennings G, et al. Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors. Proc Natl Acad Sci USA， 1995, 2 (22) :10099-101035 Y.C. Hu, Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells. Acta. Pharmacologica, Sinica, 26 (2005) 405416.6 A. Kohno, N. Emi, M. Kasai, M. Tanimoto, H. Saito, Semliki Forest virus-based DNA expression vector: transient protein production followed by cell death, Gene Ther 5(1998) 415^418.7 C.S. Hsu， Y.C. Ho， K.C. Wang, Y.C. 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权利要求
1、一种重组杆状病毒转移载体骨架质粒pFB-G-SFV，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNOM207070)。
2、 权利要求1所述的质粒在重组杆状病毒包装上的应用。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种重组杆状病毒载体骨架质粒的构建及应用。本发明克隆得到一种重组杆状病毒转移载体骨架质粒pFB-G-SFV，该质粒保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NOM207070。本发明还公开了质粒pFB-G-SFV在重组杆状病毒包装上的应用。
文档编号C12N15/866GK101260411SQ200710168929
公开日2008年9月10日 申请日期2007年12月17日 优先权日2007年12月17日
发明者方六荣, 江云波, 潘永飞, 肖少波, 骞 赵 申请人:华中农业大学