专利名称：白念珠菌的菌丝发育相关基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物学领域，具体涉及一种白念珠菌菌丝生长调控相关基因 及其用途。
背景技术：
白念珠菌(Cfl"AWa a/Wca""是临床上分离到的一种机会性人体致病真 菌，免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛 的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道 炎等疾病，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液到达内脏器官，如肾脏，脑部 等，导致败血症，严重可以导致死亡(Odds，F.C. 1994. J Am Acad Dermatol. 31: S2-S5)。白念珠菌在不同的生长条件下，呈现不同的生长形态，包括菌体(yeast form),假菌丝(pseudohyphae)和菌丝(hyphae)。各种形态之间的相互转化能力直 接影响白念珠菌的致病能力(Odds, F.C. 1985. Crit Rev Microbiol. 12: 45-93; Brown， A丄P. et al. 1999. Trends Microbiol. 7: 334-338)，而形态转换缺陷的菌株 其系统感染能力下降或消失(Lo, H丄et al, 1997. Cell. 90: 939-949; Braun, B.R. et al. 2001, EMBO J. 20: 4753-61; Hwang, C.S. et al. 2003. Mol Microbiol. 47: 1029-43)。最近有些实验室利用减毒菌株作为疫苗来免疫小鼠，取得了比较好 的效果，并对其进行了深入的生物化学分析，为疫苗的研制提供了理论基础 (Elena FA et al， Proteomics 2004,4，3007-3020; Elena FA et al，Proteomics 2004,4,1204-1215)。许多培养条件可以引起白念珠菌的形态转换，包括血清， 温度，pH值，氮源利用以及氧压等等。细胞内调节白念珠菌形态转换的分子机 制主要有MAPK途径(mitogen隱activated protein kinase pathway)禾卩cAMP/PKA途 径(cAMP-dependent protein kinase A pathway)。同时还发现Cph2介导的，Efgl 介导的以及pH应答的信号途径也都和白念珠菌的形态发生相关(Lane， S. et al. 2001. Mol Cell Biol. 21: 6418-28; Stoldt, V.R., et al. 1997. EMBO J. 16: 1982 1991; El Barkani, A. et al. 2000. Mol Cell Biol. 20: 4635-4647)。在白念珠菌 中还存在具有抑制作用的信号途径，主要是由Tupl介导的信号转导途径，依靠特异性DNA结合抑制因子Rfgl， Nrgl等来发挥作用(Kadosh, D. et al. 2001. Mol Cell Biol. 21: 2496-2505; Braun, B.R. et al. 2001. EMBO J. 20: 4753-4761)。
而近些年来的研究表明，染色质重塑复合物Swi/Snf也在调控白念珠菌的菌丝 发育以及毒性发挥中起重要的作用(MAOetal， FEBS Lett 580， 2615-2622)。
目前对于白念珠菌真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚，因此本 领域还有必要研究白念珠菌的致病因子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白念珠菌减毒株(无毒株)，所述的减毒株中 CaiWG2基因缺失(cay"g27ca;;"g2—)。
本发明的另一目的在于提供一种白念珠菌毒性相关的复合物，所述的复合 物含有CaYng2蛋白和Efgl蛋白，两种蛋白相互结合。所述的复合物可作为筛 选抑制白念珠菌毒性的物质的筛选模型。
在本发明的第一方面，提供一种白念珠菌减毒株(无毒株)，所述的减毒株
中CaKVG2基因基本上不表达。
在另一优选例中，所述的减毒株中CflKVG2基因缺失。
在另一优选例中，相对于野生型白念珠菌，所述的减毒株中组蛋白H4的
乙酰化水平下降；或
相对于野生型白念珠菌，所述的减毒株中菌丝生长相关基因表达下降。 在另一优选例中，所述的菌丝生长相关基因包括/f『尸/基迈或EC五7基因。
在另一优选例中，所述的减毒株通过同源重组的方法从野生型白念珠菌染 色体中敲除Ca)WG2基因获得。
在本发明的第二方面，提供一种组合物，所述的组合物含有有效量的所述 的白念珠菌减毒株和药学上可接受的载体。 在另一优选例中，所述的组合物是疫苗。
在本发明的第三方面，提供一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方 法，所述方法包括(a) 在测试组中，向表达CaYng2蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检 测CaYng2蛋白的表达情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、表达 CaYng2蛋白的体系中，检测CaYng2蛋白的表达情况；
(b) 将步骤(a)测试组中CaYng2蛋白的表达情况与对照组中CaYng2蛋白的 表达情况进行比较，
如果测试组中CaYng2蛋白的表达情况在统计学上低于(优选显著低于，较 佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；进一步更佳的低60%或更低)对照 组，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
在本发明的第四方面，提供一种白念珠菌毒性相关的复合物，所述的复合 物含有CaYng2蛋白和Efgl(菌丝生长增强因子l)蛋白，两种蛋白相互结合。
在本发明的第五方面，提供所述的复合物的用途，用于筛选抑制白念珠菌 的毒性的物质。
在本发明的第六方面，提供一种利用所述的复合物筛选抑制白念珠菌的毒 性的潜在物质的方法，所述方法包括
(a) 在测试组中，向CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用的反应体系中添加待 筛选的候选物，并检测CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用情况；并且，在对照组 中，在不添加所述候选物的、CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用的反应体系中， 检测CaYng2蛋白和Efgl蛋白的相互作用情况；
(b) 将步骤(a)测试组中CaYng2蛋白和Efgl蛋白的相互作用情况与对照组 中CaYng2蛋白和Efgl蛋白的相互作用情况进行比较，
如果测试组中CaYng2蛋白和Efgl蛋白的相互作用在统计学上弱于(优选 显著弱于，较佳的弱20%或更弱；更佳的弱40%或更弱；进一步更佳的弱60% 或更弱)对照组，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
在另一优选例中，所述的相互作用是结合。
在另一优选例中，所述的CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用的反应体系为 酵母双杂交体系或免疫共沉淀体系；或为含有重组的CaYng2蛋白和Efgl蛋白 的溶液。在本发明的第七方面，提供一种白念珠菌CaKVG2基因或蛋白的拮抗剂的 用途，用于抑制白念珠菌的毒性。
在本发明的第八方面，提供一种组合物，含有
(1) 有效量的白念珠菌O^A^2基因或蛋白的拮抗剂(如抗体)；
(2) 有效量的DNA损伤试剂；和
(3) 药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的DNA损伤试剂选自(但不限于)羟基脲(HU)， 喜树碱(CPT)或甲磺酸甲酯(MMS)。
另一方面，提供一种CalWG2基因的用途，用于鉴定待测白念珠菌的毒性。
在另一优选例中，所述的鉴定待测白念珠菌毒性的方法包括检测待测白 念珠菌中CaKVG2基因的表达，
若相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌CalWG2基因正常表达或超表达， 则该白念珠菌具有一般毒性或高的毒性；
若相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌Ca7yW^基因低表达或不表达， 则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图1A显示了在白念珠菌中敲除C"1WG2基因的策略及其染色体上的酶切 图谱。
图1B显示了在白念珠菌CaKVG2基因的敲除过程中各个菌株的Southern 杂交图谱。所用探针为CalWG2编码框3端的0.7kb片断。
图2显示了白念珠菌ca:^g2/c^wg2缺失株组蛋白H4的乙酰化水平(图 2A)，在YPD液体培养基中的形态(图2B)，流式细胞分析其细胞周期进程(图 2C)，以及对DNA损伤的敏感性(图2D)。在菌丝诱导条件下，在固体培养基和液体培养基中的形态(图2E)以及对菌丝特异性基因表达的影响(图2F)。培养条件为YPD液体培养基，25。C培养12个小时；在Agar+Serum固体培养基37'C培养3天；在YPD +Serum液体培养基37。C诱导3.5 h。
图3显示了在小鼠系统感染试验中，OzKVG2基因的敲除使白念珠菌毒性降低。注射液浓度为5Xl(T细胞/毫升，每只小鼠尾静脉注射100ul菌液，共注射8只小鼠。
图4显示了在酵母双杂交系统(图4A)以及白念珠菌体内免疫共沉淀(图4B)检测到CaYng2与Efgl的相互作用。图中，ProtA表示蛋白A标签(Protein A)。
具体实施例方式
本发明人经过广泛的研究，首次在白念珠菌中分离出一种白念珠菌毒性相关的基因，本发明人将之命名为OzKVG2基因。利用同源重组原理，本发明人在白念珠菌中构建了 c^Mg2/c^"g2缺失株，并证明C"1WG2基因的表达与白念珠菌的菌丝发育和毒性表现密切相关。利用酵母双杂交以及免疫共沉淀方法，证明了 CaYng2蛋白通过协同作用与Efgl蛋白共同调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现，因此CaYng2蛋白与Efgl蛋白的相互作用体系可以用作筛选抑制白念珠菌毒性的药物的筛选模型。
除非另外说明，所述的"白念珠菌1WG2基因"，"CaKW 2基因"，"CaKVG2"， "y7VG2"可互换使用，都是指白念珠菌的1WG2基因。"白念珠菌Yng2蛋白"，"CaYng2蛋白"，"CaYng2"， "Yng2"蛋白可互换使用，都是指白念珠菌的Yng2蛋白。
除非另外说明，白念珠菌的减毒株(无毒株)用oy;wg2/c^wg2表示，或用ca^zg2/ca;;wg2缺失株表示，或用少wg2/;;"g2表示，或用-/-表示。白念珠菌的单拷贝缺失株用1WG2/;;wg2表示，或用Ca5WG2/c^wg2表示，或用+/-表示。白念珠c^wg2/caywg2缺失株导入空载体的用jywg2/;;wg2(V)表示。白念珠菌的回复菌株用戸g2/;;"g2(TiVG"，或用cay"g2/c^"g2(TalWG"表示，或用-/-(+)表示。白念珠菌的野生型菌株用WT表示，或用+/+表示。
如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然
8的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了 "包含"、"主要由构成"、"基本上由构成"、和"由构成"；"主要由构成"、"基本上由构成"和"由构成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
CaJWG2基因是本发明人分离自白念珠菌且经证实与白念珠菌的毒性相关的基因。本发明人通过敲除CalWG2基因，构建了 cw"g2/Caj;"g2缺失株，进行功能研究和毒性测试。CalWG2基因的缺失使得胞内组蛋白H4的乙酰化水平大大下降，细胞生长速度非常缓慢，其中有很多肿胀的，多个出芽位点的细胞，细胞周期以及有丝分裂明显滞后，而且对DNA损伤高度敏感。在菌丝诱导条件下，c^wg2/c^wg2缺失株不能形成真菌丝，菌丝特异基因的表达也大大下降。在系统感染实验中，c";^g2/c^;"g2缺失株没有毒性，说明CaYng2蛋白是白念珠菌中一个重要的毒性因子。利用酵母双杂交以及免疫共沉淀实验，本发明人检测到CaYng2蛋白与另 一个毒性因子Efgl蛋白相互结合，说明CaYng2蛋白通过协同作用与Efgl蛋白共同调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现。因此，CalWG2基因可以作为白念珠菌减毒的耙标。
所述的OzKVG2的基因具有SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列；CaYng2蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
所述的O^AW2的基因可以作为一种白念珠菌毒性鉴定的标志物。例如可通过检测待测白念珠菌中a^A^2基因的表达情况来确定白念珠菌的毒性；若相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌OziWG2基因正常表达或超表达(即相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌中(^1WG2基因的表达高20n/。或更高，更佳的高50%或更高)，则该白念珠菌具有一般毒性或高的毒性；若相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌CaKVG2基因低表达或不表达，则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。
本发明还提供一种白念珠菌减毒株，该减毒株中CalWG2基因基本上不表达。所述的"基本上不表达"是指白念珠菌减毒株中CaKVG2基因不表达或低量低于野生型白念珠菌的20%;较佳的是低于野生型白念珠菌的10%;更佳的是低于野生型白念珠菌的5%或更低，最佳的低于2%。 CalWG2基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因抑制、基因沉默、基因敲除等技术来构建。例如，可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将OzIWG2基因从染色体上敲除，从而使得CalWG2基因缺失；可以针对OziWG2基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使CalWG2基因表达抑制或沉默。
一种使得CaKVG2基因缺失的方法是基因敲除技术，在本发明的优选实施方式中，体外构建CalWG2基因敲除质粒，通过同源重组的方法，把白念珠菌染色体CaFAW2基因中的0.9 kb DNA同源片段用//"G-WL43-历sG替换，从而敲除染色体上的CalWG2基因。在含5-氟乳清酸平板上，通过压力筛选，使两个同向HisG同源序列得以重组，从而环出筛选标志基因t7/"3和一个拷贝//"G序列，丢失了 WM3筛选标志基因的重组子可在5-FOA平板上筛选得到。通过进行第二轮的转化进而敲除第二条染色体上的CalWG2基因。
所述的白念珠菌减毒株可以用于研究OzKVG2基因基本上不表达对于白念珠菌中其它基因表达情况的影响，以及研究OzKVG2基因基本上不表达后白念珠菌的菌丝生长情况以及毒性情况。
所述的白念珠菌减毒株可以用于制备疫苗，来免疫动物，从而在不对动物造成危害的情况下使得动物对白念珠菌感染产生免疫力。
本发明还提供一种白念珠菌毒性相关的复合物，所述的复合物含有CaYng2蛋白和Efgl蛋白，两种蛋白相互结合。本发明人通过酵母双杂交以及免疫共沉淀技术证明，CaYng2与Efgl在白念珠菌内能够相互结合，这种结合不受生长方式的调控，也即CaYng2通过协同作用与Efgl共同调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现；并且，本发明人还发现，Efgl可介导CaYng2调节菌丝表达相关基因的启动。因此，所述的复合物可以作为筛选抑制白念珠菌毒性的药物的筛选模型。
因此，本发明还提供了一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法，所述方法包括向CaYng2蛋白禾卩Efgl蛋白相互作用(相互结合)的反应体系中添加待筛选的候选物，并检测CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用情况；如果CaYng2蛋白和Efgl蛋白的相互作用在统计学上减弱，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用的变化，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物的、CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用的反应体系。
作为本发明的另一种优选方式，还提供了一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法，所述方法包括向表达CaYng2蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检测CaYng2蛋白的表达情况；如果CaYng2蛋白的表达情况在统计学上减弱，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。其中，酵母双杂交是一种大规模快速研究蛋白-蛋白间相互作用的方法，具有简单、稳定的优点。在本发明的一个优选例中，采用了酵母双杂交系统来鉴定CaYng2蛋白和Efgl蛋白的相互作用。更具体的，在酵母细胞中， 一种与DNA-结构域融合的诱饵蛋白与一种与活化域融合的猎物蛋白相互作用。相互作用的成对分子结合于专一的序列模式，从而活化两个独立的报道基因的转录。
在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的白念珠菌毒性抑制或菌丝生长抑制试验，以进一步选择和确定对于抑制白念珠菌毒性有用的物质。
本发明还提供一种白念珠菌Oz!WG2基因或蛋白的拮抗剂的用途，用于抑制白念珠菌的毒性。所述的白念珠菌CalWG2的拮抗剂例如是针对于CalWG2基因的干扰性RNA或反义核苷酸，其能够特异性感染CalWG2的表达；或是特异性抗CaYng2蛋白的抗体；或是特异性结合CaYng2蛋白的配体等。
作为本发明的一种方式，提供一种组合物，其含有有效量(如0.0001-10wt%;较佳的0.001-5wt%)的所述的白念珠菌减毒株以及药学上可接受的载体。优选的，所述的组合物是疫苗。所述的组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。
所述"有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。对于疫苗，所述的药学上可接受的载体例如包括一种佐剂。所述组合物在用于给药时，通常0.001-10mg/kg体重，较佳的0.005-2mg/kg体重是适合的；优选的可进行多次给药，以产生良好的免疫效果，例如可间隔l-3周进行重复给药。
作为本发明的一种优选方式，还提供一种组合物，含有(1)有效量(如0.0001-10wt%;较佳的0.001-5wt。/。)的白念珠菌CalWG2基因或蛋白的拮抗剂；和(2)有效量(如0.0001-10wt%;较佳的0.001-5wt。/o)的DNA损伤试剂。可以釆用多种本领域已知的DNA损伤试剂，例如所述的DNA损伤试剂选自(但不限于)HU， CPT或MMS。所述拮抗剂和DNA损伤试剂的联合应用可使得白念珠菌生长速度明显变慢，而且发生细胞肿胀、多位点出芽等异常现象。适用的药学上可接受的载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。所述的组合物的剂型没有特别的限制，如针剂、粉剂、栓剂、片剂、胶囊剂、喷雾剂、软膏剂、乳膏剂、搽剂或凝胶剂等。组合物剂型应与给药方式相匹配。所述组合物在用于给药时，通常0.001-10mg/kg体重，较佳的0.005-2mg/kg体重是适合的。当然，具体剂量还应考虑给药途径、用药者健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
I.通用方法
1. 白念珠菌基因组DNA抽提
白念珠菌细胞培养过夜，用ddH2O洗l次，悬浮在50(^l溶液A中(1M山 梨醇，lOOmM EDTApH8.0)，加入5|il 20mg/ml的Zymolase， 37。C放置1小时 后，高速离心去上清，细胞用50(Hd的TE缓冲液(20mMTris.HClpH7.5， lmM EDTA)洗一次，悬浮在350pl的TE缓冲液中，并加入溶液B (250mM EDTA pH8.0， 400mMTris'HClpH8.0， 2% SDS)， 65。C放置30分钟，加入80nl的5M KAc，冰上放置l小时，高速离心5分钟，吸取上清并加入lml的无水乙醇， -20。C放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70%乙醇洗一次，离心后烘干。
2. Southern分析
白念珠菌基因组DNA抽提后，基因组DNA用Hind III完全酶切，电泳完 成后的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡45min，尼龙膜用双蒸水或10X SSC浸透，搭好转膜平台，胶与膜间用Parafilm封闭，加一个500g砝码。以 IOXSSC为转膜液转移过夜，第二天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管， 加入10ml预杂交液(6XSSC， 5XDenhardt，s Reagent, 0.5%SDS， 100|ig/ml鱼 精DNA),于42'C预杂交12h，探针在IO(TC变性5min，加入150pl (约1/3所 标记的探针)，42。C杂交10-16h。 O.IXSSC， 0.1% SDS洗2-3次，每次40min， 取出膜，晾干，室温或-70'C压片。探针标记用Invitrogen的随机引物标记试剂 盒，照其说明操作。将含25ngDNA的溶液于100。C加热变性5-10min，置于冰 浴中，再依次力卩入Random Primers Buffer Mixture, 2pl dCTP， 2pl dGTP， 2|nl dTTP， 3)!l[a-32p]-dATP(10!xCi/iLU)，混匀后加入lplKlenow酶，于25。C保温lh， 以Sephadex G-25柱以3000rpm离心4min，收集离心液，即为纯化后的探针溶 液。探针于IO(TC变性5min，冰上冷却后加入杂交体系中。
3. 白念珠菌的转化准备PEG/LiAc溶液(pH7.5)10ml;在1.5ml Eppendof管中依次加入质 粒5|ug， 10|nl 10mg/ml鱼精DNA，混匀；加入O.lml感受态细胞和0.6ml PEG /LiAc，振荡混匀；30°C 200rpm培养30min;加入70plDMSO，轻轻混匀； 42'C热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴2min:高速离心15s，吸掉上清， 用O. 2mlTE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。
4. 流式细胞分析
将野生型(SC5314)以及Cfl戸g2/ca;;wg2缺失株(CLY3)的细胞培养在 YPD平板上，25。C培养36小时。然后将菌从板上刮下来，以2X10Vml细胞密 度培养在缺乏碳源的SC培养基中，24小时之后，收集细胞。将其释放到YPD 培养基中，在不同的时段收集细胞。收集下来的细胞用1 ml水洗一次，加入 70%乙醇固定过夜。收集细胞，重悬于1 ml0.2MTrisPH7.5。超声振荡一次， 重悬于1 ml 0.2M Tris PH7.5 + 1 mg/ml RNase A， 37。C培养过夜。用1 ml 0.2M Tris PH7.5洗一次，重悬于1 ml 0.2M Tris PH7.5 + 0.05 mg/ml PI (Propidium Iodide), 0。C培育15 min。用1 ml 0.2M Tris PH7.5洗一次，重悬于1 ml 0.2M Tris PH7.5 + 0.01 mg/ml PI (Propidium Iodide),取10-100 u 1用来流式细胞分析。
5. DNA损伤检验
将处于对数期生长的细胞依次稀释10倍，将其中的5pl点到YPD，以及 分别含有25 mM HU(羟基脲，购自SIGMA)， 30吗/ml CPT(喜树碱，购自 SIGMA), 0.02"/。MMS(甲磺酸甲酯，购自SIGMA)YPD中，在3(TC培养56小 时，拍照。
6. Northern分析
各菌株在YPD， 30。C中培养至对数生长期后期，转接至YPD起始OD二 0.05，并在相应温度下培养指定时间，用热酚法抽提白念珠菌总RNA。 20pl上 样量包括RNA样品12pl(25|Lig)， 4^1甲醛，2(al 10XMOPS， 2(^l上样缓冲液、 65。C加热10min， (TC冷却2min，离心5s，上样。电泳在含甲醛的变性胶上进 行(lg琼脂糖，10ml 10XMOPS， 87ml DEPC处理水，加热融化稍冷后加入2.7ml 37%甲醛)。电泳条件为100mA， 50-70V， 5-7h电泳完成后同样用毛细法转膜，转膜液用5XSSC。转膜过夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-Ra GS Gene Linker C3 protocol紫外交联，加入10 ml预杂交液，65°C， 2h后更换为10ml 杂交液，加入探针65'C杂交过夜，用2XSSC， 0.1%SDS， 65'C洗膜两次，每 次30min。杂交好的膜不要晾干，用保鲜膜包好后-7(TC压片。重杂交洗膜用0.5% SDS， 90-100。C加热5-10min，或按照Clontech推荐用0.5%SDS， 90-100。C加热 10min后让其自然冷却10min后取出备用，若不立即位用，用保鲜膜包好后置 于-2(TC保存。
7. 小鼠系统感染实验
以体重在16-18glCR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射10(^1白念珠 菌各种菌株，并培养观测25天。各个菌株注射浓度为5乂107细胞/毫升。
8. 免疫共沉淀与Western杂交
白念珠菌细胞在SD培养基中于3(TC培养至饱和，按A6QQ 0.05转接于SD 培养基中，30。C振荡8-16h，至A綱为0.6-1.0。 100 ml培养物离心收集，10 ml 无菌水洗一次。以下步骤均在4r进行。白念珠菌细胞重悬于0.5ml白念珠菌 细胞裂解液(200 mM Tris-HCl pH 8.0， 400 mM (NH4)2S04， 10 mM MgCl2， 1 mM EDTA， 10%甘油，7mM P-mercaptoethanol ， 2 mM benzamidine， lmMPMSF， 2ug/ml抑肽素A， 2ug/ml亮肽素，4 U g/ml抗痛素)，加入0.4g酸洗玻璃珠 (425-600um， Sigma)。在振荡器FP120上振3次，每次30 s，间隔冰浴5min。 裂解液12,000 rpm离心5 min，上清再离心5 min，收集上清并测定蛋白浓度， -70^保存。
取500W白念珠菌细胞抽提物，与等体积的IP缓冲液混合，加入lOpl床 体积的protein G agarose beads,在4"C旋转混合1小时后低速离心，吸取上清 加入5(ig的FLAG单抗，在4t:旋转混合1小时，然后加入30)al床体积的protein G琼脂糖珠，继续混合2小时。用IP缓冲液洗免疫共沉淀物五次，然后重悬 在2X蛋白质电泳上样缓冲液中，进行SDS-PAGE电泳。用湿法将蛋白条带转 移到硝酸纤维素膜上，用含5y。脱脂奶粉的TBS-T溶液封闭膜2-3小时， 一抗4 "结合过夜。用TBS-T室温洗膜1次，5分钟。用相应的二抗于室温结合1小 时，再用TBS-T洗膜四次，每次5分钟，用ECL试剂显色。
15II.实施例
实施例l、白念珠菌中CVzKVG2基因的敲除
为了研究白念珠菌Ca)WG2基因在白念珠菌形态发生和毒性表现中的功 能，首先在白念珠菌中敲除CalWG2基因。
图1A显示了基因敲除的策略。体外构建CaKVG2基因敲除质粒，通过同 源重组的方法，把染色体CaKVG2基因中的0.9 kb DNA同源片段用 //"G-t/iL43-ZfeG替换，从而敲除染色体上的Ot1WG2基因。在含5-氟乳清酸 (5-fluoro-orotic acid， 5-FOA)平板上，通过压力筛选，使两个同向7/^G同源 序列得以重组，从而环出筛选标志基因和一个拷贝i/kG序列，丢失了 t/7L43筛选标志基因的重组子可以在5-FOA平板上筛选得到(Boeke et al. 1984. Mol Gen Genet. 197: 345 346)，该重组子可以进行第二轮的转化进而敲除第二 条染色体上的OzlW(^基因。
具体方法如下
利用5引物(SEQIDNO: 3):
GTCGGTACCGGATAATAGGGAAACACATG:禾卩 3引物(SEQ ID NO: 4):
GTCGAATTCTTGTCTGTGCTACGTCAATC;
从野生型白念珠菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增大约0.68kb的片段， 连接到质粒pCUB6 (参见N.A.R.Gow et al.， iVoceed/wg;yMz"owa/^cac/emy 。/5Wewces o/ f/ie t/mYed 5Yafes o/ ^men'c", Vol. 91, No. 13 (Jun. 21, 1994), pp. 6216-6220)的Sstl/BamHI位点，获得质粒pCaKVG2-KO;
利用5引物(SEQIDNO: 5):
GTCGGATCCAGAACTGAGTGTATAGTATG:禾口 3引物(SEQIDNO: 6):
GTCTCTAGAGAATATATTGACAACTCGGA;
从野生型白念珠菌株基因组DNA中用PCR的方法获得扩增产物，继续连接 到质粒pCa KVG2-KO的Pstl/Kpnl位点，从而体外构建了 Ca IWG2基因敲除质粒， 在此质粒中CalWG2开放阅读框(open reading frame, ORF)中约0.9kb DNA片 段被7f"G-L^43-历sG替代。质粒pCaKVG2-KO用尺/ wIAS^I酶切并转化白念珠 菌"m-营养缺陷型菌株，在缺少尿嘧啶的合成培养基上可以筛选到转入质粒的 转化子。通过0.68kb和0.74kb两个同源片段和基因组上的CaKVG2同源片段重组，可以把染色体上的OzKW72基因中的0.9 kb DNA同源片段用 //^G-WL43-i/^G给替换掉，从而破坏染色体上的CalWG2基因，正确插入的转 化子通过Southern杂交分析确定。然后将正确插入的转化子涂在含5-氟乳清酸 (5-fluoro-orotic acid， 5-FOA)平板上，由于5-氟乳清酸对含有L^43的菌株来说 是具有毒性的，所以可以通过两个同向/Z"G同源序列在同一条染色体上的重组 而将W^3环出，那么在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid， 5-FOA)平板上长 出的都是丢失了C/^43筛选标记的重组菌。利用丢失了L^43筛选标记的重组菌 可以进行下一轮的转化进而敲除另一条染色体上的C"JWG2基因。
所得重组子的基因型用Southern杂交技术检测确定。这些菌株的基因组 DNA用^awM酶解，与含0.7 kb CalWG2 DNA片段的探针杂交，杂交结果表 明野生型菌株显示一条2.1 kb杂交条带，CaKVG2单拷贝缺失株显示2.1 kb和 6.6 kb两条杂交带，在5-FOA平板上将一份拷贝的/f&G和t7/M3环出后，呈 现一条较小的3.9kb杂交带，通过两轮转化和环出，得到CoKVG2双拷贝缺失 的菌株ca戸g2/ca;;"g2。图1B显示了 CalWG2基因敲除过程中各个菌株Southern 杂交分析的图谱。
实施例2、 CaKVG2基因的敲除对白念珠菌的影响
通过同源重组的方法在白念珠菌中敲除Ca!WG2基因，Southern杂交分析 证明敲除是成功的。为了检测CaKVG2基因的缺失是否对胞内组蛋白H4的乙 酰化水平产生影响，本发明人将野生型菌株(SC5314)以及caj;"g2/ca;;"g2缺失株 (CLY3)在25"C， YPD培养基中分别培养6个小时和10个小时之后，抽提它们 的总蛋白，利用Western-blot检测组蛋白H4，乙酰化的组蛋白H4以及组蛋白 H4N末端特定Lys位点的乙酰化在胞内的表达水平。结果显示，与野生型细胞 相比，c"3mg2/ccymg2缺失株的细胞中组蛋白H4的乙酰化水平显著下降(图2A)， 同时，组蛋白H4的第5位Lys的乙酰化水平也随之大大下降，但是组蛋白H4 的第16位Lys的乙酰化水平并没有发生显著的变化，可能是由于在白念珠菌 中存在功能冗余的乙酰转移酶可以乙酰化组蛋白H4的第16位Lys。以上的结 果表明，相比于野生型细胞，白念珠菌cay"g2/c^^g2缺失株的细胞内，NuA4 复合物催化的活性显著下降。
DNA损伤试验显示，白念珠菌cayng2/ca;;wg2缺失株的细胞显示出生长速 度以及细胞周期进程方面的缺陷，并且对DNA损伤敏感。它们生长速度明显(图2B)。
流式细胞分析(FACS)的结果表明，相比于野生型细胞，Ca_y g2/C^ g2 缺失株细胞G2/M期明显滞后，大多数野生型的细胞在180 min内完成了 DNA 复制，进而进入有丝分裂。然而大多数caj^g2/c^ywg2缺失株细胞完成DNA复 制则需要260 min(图2C)。
而且，ca戸g2/ca少"g2缺失株细胞对HU， CPT， MMS所介导的DNA损伤 高度敏感(图2D)。
在液体YPD+10。/。血清和37'C菌丝诱导条件下，野生型菌株(WT)、单拷贝 缺失株(YNG2/yng2)以及回复菌株(yng2/yng2(YNG2)，即少"g2/，g2 + pBAl-YNG2 ， 其中 pBAl-YNG2 的构建如下利用引物 GTCATCGATATGGATACATCAACTGTACT (SEQ ID N。 7) 禾口 GTCGGTACCTACTATACACTCAGTTCTTC (SEQ ID NO: 8)扩增获得YNG2 扩增产物，用0^///&"/酶切后插入经过同样酶切的？8八1(参见0&0 et al Afo/ 5/o/ Ce〃2006， 17(1):295-307)均能形成很好的真菌丝，而ca，g2/ca戸g2缺失株 却仍然有很多肿胀的，多出芽位点的细胞，只有少量顶端细胞(<10%)有所延长， 但是仍然能清楚地观察到细胞间有缢缩，细胞壁也不平行，这些顶端细胞并不 具备真菌丝的特征(图2E)。在37"，含血清的琼脂固体平板上诱导3天后，野 生型菌株、单拷贝缺失株以及回复菌株均产生大量的菌丝，形成细长而有分叉 的丝状菌落(图2E)。但是ca^g2/c^;"g2缺失株在同样的诱导条件下，3天后只 能形成非常小的菌落，只有极少量的菌丝从菌落周围伸出(图2E)。以上结果 表明在血清诱导条件下，CaYng2对白念珠菌的菌丝形成是必需的。图2中， yng2/yng2(V)表示yng2/yng2 +空载体(pBA1)。
白念珠菌从酵母态到菌丝态的转变伴随着一些菌体特异基因表达的关闭 和菌丝特异基因表达的开放。if『尸7基因编码一个细胞壁蛋白，作为白念珠菌 细胞表面一个重要的黏附因子，是哺乳细胞谷胺酰氨转移酶的底物，而且H『尸7 mRNA在菌丝形成的过程中被不断诱导合成。Northern杂交实验表明，在YPD 菌体培养条件下野生型菌株和其它菌株不表达i/『/57，而在含血清培养基的菌 丝诱导条件下，野生型菌株、两种单拷贝缺失株以及回复菌株中/Z『P7均被诱 导大量表达，而ca少wg2/caywg2缺失株中的表达量大大下降(图2F)，但 仍有少量的/f『尸7被诱导出来，说明caj^g2/c^wg2缺失株并没有完全阻断 i/『尸7的表达，可能是由于在c^;wg2/ca;^g2缺失株中仍残存着微弱的组蛋白相似，另外一个菌丝特异性基因五C^7，在 ca;;"g2/ca;;wg2缺失株中的表达水平也下降很多(图2F)。
实施例3、 C"KVG2基因的敲除对白念珠菌毒性的影响
酵母-菌丝形态之间的转换能力与白念珠菌的致病能力密切相关，不能形成 菌丝的菌株会丧失毒性，而组成型形成菌丝的菌株也是或丧失或大幅下降其毒 性。
本发明人构建的ca;;"g2/ca;;"g2缺失株不能形成真正的菌丝，于是本发明 人通过小鼠系统感染试验来检测缺失株的感染能力或者毒性。通过尾静脉对每 只小鼠注射5"06个细胞，然后观察小鼠的存活率来判断菌株的致病能力。将 野生型菌株CAF2-1(参见Fonzi et al. Ge"e"cs 1993, 134(3):717-728)和Ca]WG2 基因回复菌株Ozg2/;;"g2 + pBAl-YNG2)作为对照，每种菌株注射8只小鼠，结 果显示，注射CAF2-1的小鼠到第7天时全部死亡，注射C"1WG2回复菌的小 鼠在第19天时全部死亡，而注射了 c^wg2/c^^g2缺失株的小鼠并没有出现任 何不适症状包括体重下降，活动减少，精神委靡等现象，在本发明人的实验记 录时间内(30天)都没有观察到死亡现象，并且小鼠的生长很正常(图3)。
因此，本发明人认为OzlWG2基因是白念珠菌的致病能力所必需的，而对 应的CaYng2蛋白是白念珠菌的毒性因子。
实施例4、 CaYng2能与Efgl相互作用 1.酵母双杂交
Efgl是APSES真菌特异性的转录调控因子家族中的一员，在调控白念珠 菌的菌丝发育和致病过程中发挥至关重要的作用。为了检测CaYng2对白念珠 菌菌丝的调控是否与Efgl相关联，本发明人将CflKVG2全长基因克隆于带有 B42激活结构域的质粒pJG4-5(参见Gyuris et al Ce〃 1993， 75(4):791-803); Efgl 全长基因(参见GenBank登录号XM—709104)克隆于带有LexA DNA结合结构 域的质粒pEG202(参见Gyuris et al Ce// 1993, 75(4):791-803)，将两种质粒共转 化EGY48酵母(参见Gyuris et al Ce// 1993， 75(4):791-803)，利用酵母双杂交系 统检测LexA-Efgl与B42AD-Yng2的相互作用。
酵母转化子P-半乳糖苷酶活力的测定如下
取一张Whatman滤纸，覆盖于相应的选择性培养基上(碳源为半乳糖)，用灭菌牙签从选择性培养基平板上挑取酵母转化子菌落(直径l 2mm)点到滤纸 上，30。C培养2天，然后取出小心浸入液氮中(菌落面朝上)，约半分钟后取出， 置室温几分钟，将滤纸(菌落面朝上)放于用Z buffer/X-gal溶液(100ml Z buffer中 加入1.67ml20g/L的X-gal， 0.27 ml卩-巯基乙醇；Z buffer含60 mM Na2HP04, 40mMNaH2PO4， 10mMKCl， 1 mM MgS04)预湿的滤纸上，30'C培养0.5 8 h， 检验菌落是否显蓝色，8h内显蓝色的菌落P-半乳糖苷酶活性为阳性。
在P半乳糖苷酶测活试验中，共转化pEG202-EFGl和pJG-YNG2的酿酒 酵母菌株显蓝色，而pEG202-EFGl和pJG-YNG2分别与空质粒共转化时则不 显色(图4A)，说明Efgl与CaYng2的相互作用是专一的。
2.免疫共沉淀
然后，本发明人利用白念珠菌体内的免疫共沉淀实验来检测CaYng2能否 与Efgl在体内发生相互作用。本发明人构建了 TAP-Efgl和13Myc-Yng2共表 达菌株，用免疫共沉淀实验检测CaYng2与Efgl的相互作用。 TAP-Efgl和13Myc-Yng2共表达菌株构建方法具体如下 将1WG2的全长基因片段插入到载体pPR671(参见Cao et al Mo/ 5!'o/ Ce// 2006, 17(1):295-307)的iVort-M/iJ位点中，构建ACT1启动子下诱导表达C端融 合的13Myc标记的Yng2表达质粒13Myc-Yng2。将13Myc-Yng2导入TAP-Efgl 表达菌株HLY3234(参见Cao et al Mo/5/o/Ce〃 2006, 17(1):295-307)中，用免疫 共沉淀实验检测Efgl与Eaf7， Epll以及Yng2的相互作用。
结果表明，CaYng2与Efgl在白念珠菌内能够相互结合，这种结合不受生 长方式的调控，在酵母和菌丝形态的细胞中都能检测到它们的相互结合(图4B)， 说明CaYng2通过协同作用与Efgl共同调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现。 并且，Efgl可介导CaYng2调节菌丝表达相关基因的启动。
实施例5、抗CaYng2蛋白抗体的制备
从野生型菌株SC5314基因组DNA中扩增CaYNG2全长片段，用Ndel/Xho1 酶切后连入pET28 (a)(购自MERCK)载体的相应位点。导入大肠杆菌表达菌 株BL21， 1.0 mM IPTG诱导3 h之后，镍柱纯化His-CaYng2蛋白，然后常规 方法免疫兔子，获得CaYng2蛋白的抗体，作为CaYng2蛋白的一种拮抗剂。实施例6、筛选方法
如实施例4的方法，基于酵母双杂交技术，建立LexA-Efgl与B42AD-Yng2 的相互作用系统，并将所述系统分为 对照组不给予候选物质；和 测试组给予候选物质。
检测对照组和测试组酵母细胞中情况，若相对于对照组，测试组中 LexA-Efgl与B42AD-Yng2的相互作用在统计学上有减弱，则说明候选物质是 抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
实施例7、利用减毒菌株制备疫苗
本实施例中，本发明人检测c^^g2/caywg2缺失株作为减毒菌株能否可以 使小鼠产生免疫力。
本发明人采用注射过ca;^g2/ca;;wg2缺失株(将5 X 106个白念珠菌 C。_yMg2/ca_y g2缺失株溶解于0.1ml的生理盐水溶液中，用于注射)15天后的存 活小鼠，再一次向其体内注射5X1()S野生型的白念珠菌，再过25天后，发现 10只小鼠有8只依然存活。事先未注射过ca3^g2/cwwg2缺失株而仅注射过生 理盐水的小鼠，15天后注射5乂106野生型的白念珠菌后，7天之后IO只小鼠 全部死亡。说明c^wg2/c^ng2缺失株能使小鼠对野生型的白念珠菌产生免疫 力，因此本发明的减毒菌株可以作为一种安全有效的免疫疫苗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，
本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
21序列表
<110〉中国科学院上海生命科学研究院 <120〉白念珠菌的菌丝发育相关基因及其用途
<130〉 084389
<160> 6
<170> Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211〉 897
<212〉 DNA
<213〉 白念珠菌(Candida albicans)
<400> 1
atggat3C3tcaactgtacttg3g犯atacacacaggatttatctaatctaccscttgaa60
gtgaggcatttEitta^gga3犯gatgtac犯gtctcag33gcaagga^ei120
cga^cca犯ctcgtgaccatcaacttcata^atttfitacg犯ca幼tgggac3cta^ct180
aaacat cca3"gttgtattcc犯gatcg^igaagatatgaagcttgtgcag240
aaacta^csgatctattggctaacactgcattgtttttgat3tcga^acat300
ctatatcattttgagacagacattgccaagctaga^gagatgaattgttgcctccttta360
tcgagctaactgaagtatctacgcaaaatcactt犯tggc420
ttttctgatagtgcctctgccaceicc犯cgccteiggaa^ggatcatcggc犯CtCC2Lgtg480
gcaga犯caga^cttagtgtt犯鄉ggcgtcctcttct540
ctggctcagtcatcctctgcttcaagacaggtg犯gcgactccggtcagaagagatagag600
gatcctctacCgt3tg3ggg鄉gtcattggcgttc犯tgg3Mtgtagc660
aatagtgcagcagatgcaaatggtcc犯acggcga,tgctgataataatctatattgt720
ttttgtcaacgtgtttcatttggtga犯tgattggUgtgataatgaagactgtaagtat780
gaatggtttc3ttggagUgtgttgggatcacatcacctcct6ia^g3tgacgaaatttgg840
tattgtcctgattgtgcttcaaagatggagaaaagaa犯aaga犯cgga^gaactga897
<210〉 2
<211〉 298
<212〉 PRT
〈213〉 白念珠菌(Candida albicans)
<400> 2
Met Asp Thr Ser Thr Val Leu Glu Lys Tyr Thr Gin Asp Leu Ser Asn
15 10 15
Leu Pro Leu Glu Val Arg His Leu Leu Glu Glu lie Lys Ser Lys Asp
20 25 30
Val Gin Val Ser Glu Ala Arg Lys Arg Tyr Gin Thr Arg Asp His Gin
35 40 45
Leu His Lys Phe lie Arg Thr Asn Gly Thr Leu Thr Lys His Pro Lys
50 55 60
Glu Asp Gin Leu Tyr Ser Lys lie Glu Glu Asp Met Lys Leu Val Gin65 70 Lys Leu Gin Lys Glu Lys 85
lie Ser Lys His Leu Tyr 100
Arg Asp Glu Leii Leu Pro 115
Lys Asp Glu Tyr
Val Ser 130 Ala Ser 145
Ala Glu
Ala Ser
Arg Leu
Ser Leu 210 Asp Ala 225
Phe Cys
Asp Cys
Pro Pro
Met Glu 290
Ala Thr Pro Thr 150
Thr Val Lys Lys 165
Ser Ser Ser Ala 180
Arg Ser Glu Glu 195
Ala Phe Asn Gly
Asn Gly Pro Asn 230
Gin Arg Val Ser 245
Lys Tyr Glu Trp 260
Lys Asp Asp Glu 275
Lys Arg Lys Lys
75 80 lie Leu Leu Ala Asn Thr Ala Leu Phe Leu
90 95 His Phe Glu Thr Asp lie Ala Lys Glu
105 110 Pro Leu Glu His Pro lie Glu Leu Thr Glu
120 125 Ala Lys Ser Leu Asn Gly Phe Ser Asp Ser 135 140 Pro Arg Asn Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val 155 160 lie Gin Lys Lys Lys Leu Ser Val Lys Gly
170 175 Gin Ser Ser Ser Ala Ser Arg Gin Val Lys
185 190 lie Glu Asp Pro Leu Pro Tyr Glu Gly Gly
200 205 Asn Val Ala Met Ser lie Asn Ser Ala Ala 215 220 Gly Glu Asp Ala Asp Asn Asn Leu Tyr Cys 235 240 Phe Gly Glu Met lie Gly Cys Asp Asn Glu
250 255 Phe His Trp Ser Cys Val Gly lie Thr Ser
265 270 lie Trp Tyr Cys Pro Asp Cys Ala Ser Lys
280 285 Lys Arg Lys Asn 295
<210〉 3
<211〉 29
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature <223〉 引物
<400〉 3
gtcggtaccg gataataggg aaacacatg 29
<210> 4
〈211〉 29
<212> DNA <213〉人工序列<220> <221〉 <223〉
misc—feature 引物
<400〉
gtcgaattct tgtctgtgct acgtcaatc
<210〉 5
<211〉 29
<212〉 DNA <213〉人工序列
〈220>
<221> misc一feature
<223〉 引物
<400> 5
gtcggatcca gaactgagtg tatagtatg 29
<210〉 6
〈211> 29
<212〉 腿 <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<210〉 7
<211〉 29
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400〉 7
gtcatcgata tgg3tacatc aactgtact 29
<400>
gtctcteig3g 3atatattg3 caactcgga
<210〉 8<211> 29 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<221〉 misc—feature <223〉 引物
<400> 8
gtcggtacct actatacact cagttcttc 29
权利要求
1.一种白念珠菌减毒株，其特征在于，所述的减毒株中CaYNG2基因基本上不表达。
2. 如权利要求1所述的减毒株，其特征在于，相对于野生型白念珠菌，所 述的减毒株中组蛋白H4的乙酰化水平下降；或相对于野生型白念珠菌，所述的减毒株中菌丝生长相关基因表达下降。 较佳的，所述的菌丝生长相关基因包括//『尸/基因或五GW基因。
3. 如权利要求l所述的减毒株，其特征在于，其通过同源重组的方法从野 生型白念珠菌染色体中敲除CflKVG2基因获得。
4. 一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的权利要求l-3任 一所述的白念珠菌减毒株和药学上可接受的载体。
5. —种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法，其特征在于，所述方 法包括(a) 在测试组中，向表达CaYng2蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检 测CaYng2蛋白的表达情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、表达 CaYng2蛋白的体系中，检测CaYng2蛋白的表达情况；(b) 将步骤(a)测试组中CaYng2蛋白的表达情况与对照组中CaYng2蛋白的表达情况进行比较，如果测试组中CaYng2蛋白的表达情况在统计学上低于对照组，就表明该 候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
6. —种白念珠菌毒性相关的复合物，其特征在于，所述的复合物含有 CaYng2蛋白和Efgl蛋白，两种蛋白相互结合。
7. 权利要求6所述的复合物的用途，其特征在于，用于筛选抑制白念珠菌 的毒性的物质。
8. —种利用权利要求6所述的复合物筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物 质的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在测试组中，向CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用的反应体系中添加待 筛选的候选物，并检测CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用情况；并且，在对照组 中，在不添加所述候选物的、CaYng2蛋白和Efgl蛋白相互作用的反应体系中，检测CaYng2蛋白和Efgl蛋白的相互作用情况；(b)将步骤(a)测试组中CaYng2蛋白和Efg 1蛋白的相互作用情况与对照组 中CaYng2蛋白和Efg 1蛋白的相互作用情况进行比较，如果测试组中CaYng2蛋白和Efgl蛋白的相互作用在统计学上弱于对照 组，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。
9. 一种白念珠菌Cfl)WG2基因或蛋白的拮抗剂的用途，用于抑制白念珠菌 的毒性。
10. —种组合物，其特征在于，含有(1) 有效量的白念珠菌O^A^2基因或蛋白的拮抗剂；(2) 有效量的DNA损伤试剂；和(3) 药学上可接受的载体。较佳的，所述的DNA损伤试剂选自羟基脲，喜树碱或甲磺酸甲酯。
全文摘要
本发明公开了一种白念珠菌的菌丝发育相关基因(CaYNG2)及其用途，CaYNG2在白念珠菌中是一个重要的毒性因子。本发明还公开了一种白念珠菌减毒株，所述的减毒株中CaYNG2基因基本上不表达。本发明还公开了一种含有CaYng2蛋白和Efg1蛋白的复合物，所述的复合物可以用于筛选抑制白念珠菌毒性的物质。
文档编号C12N1/15GK101638624SQ200810041219
公开日2010年2月3日 申请日期2008年7月31日 优先权日2008年7月31日
发明者杨 逯, 陈江野 申请人:中国科学院上海生命科学研究院