专利名称：2-酮基-d-葡萄糖酸连续发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品添加剂D-异抗坏血酸及其盐类合成前体2-酮基-D-葡萄糖 酸的连续发酵生产工艺。
背景技术：
2-酮基-D-葡萄糖酸是D-异抗坏血酸及其盐类(如D-异抗坏血酸钠)合成
的前体，D-异抗坏血酸及其盐类可作为食品抗氧化剂和肉制品的防腐助色剂。 根据公知的间接发酵技术(如US 3, 381, 027 )可以将2-酮基-D-葡萄糖酸 转化为D-异抗坏血酸及其盐类(如D-异抗坏血酸钠)。2-酮基-D-葡萄糖酸的 生产方法主要有酶法(如US 4, 351， 902 )、化学合成法(如US 6， 018， 034 ) 和发酵法(如US 3，255，093 )等3种。由于生产成本方面的原因，目前在工 业生产中均釆用细菌发酵的方法。
公知的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵技术釆用的是分批发酵或补料分批发酵模 式，其基本特征是分批次的。每完成一批次发酵后，需要对发酵罐进行清理和 重新接种才能进行下一批次发酵，导致生产成本的上升和发酵设备生产能力的 损失。在发酵转化率上，现有的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵技术虽已达到一定的水 平；但在发酵产率和产品质量上，现有的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵技术仍存在着 一定欠缺，表现在发酵产率较低， 一般只能达到4. Og/L/h左右，且产品质量不 够稳定。
发酵工艺的改变直接影响到发酵转化率、发酵产率、产物质量及生产成本 等。因此，在不影响发酵转化率的基础上，开发高产率、高质量、低成本的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产工艺是本发明的目的。
发明内吝
本发明披露的是一种通过连续发酵从葡萄糖或淀粉水解糖高产率发酵生产
2-酮基-D-葡萄糖酸及其盐类的方法。连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添 加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定 的发酵过程。本发明所述方法包括以下步骤
O)在发酵容器中培养能够利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵转化2-酮基-D 葡萄糖酸的细菌；
(2;向发酵容器中连续补给含有葡萄糖的培养基，发酵液的稀释率控制在 0. Ollf'至0. 15h—所述培养基中的葡萄糖浓度在100g/L至"0g/L之间；
(3) 与发酵液的稀释率相对应，连续从发酵容器中放出发酵液(放出的发 酵液中的葡萄糖浓度应低于2g/L );
(4) 从放出的发酵液中回收2-酮基-D葡萄糖酸或其盐。
细菌选择能够利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵转化2KGA的细菌较多，有荧 光假单胞菌(尸化〃&腳/7^ /7〃or"ce/7i1)、 粘质沙雷氏菌(5"err/'〃s 历srcesce/7S)、 Xl血藤区夂文氏菌(fr 7'/n'<3 /z7/7/ez^'a )、 J求3犬节才干菌(爿rf力ro/wCer g/o6i尸or肌、)、恶臭假单胞菌(A. )和产酮产碱菌("《e/ "
h^^e"")等，其中荧光假单胞菌是国内外2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产中最 主要的工业用菌，本发明主要采用了该种细菌。
培养基配制培养基中的碳源主要为葡萄糖，氮源主要为玉米浆。培养基 中的葡萄糖浓度可以在100g/L至250g/L之间，优选的葡萄糖浓度为18%左右； 培养基的含氮量在O. 2g/L至1.6g/L之间，优选的含氮量在1. Og/L左右。连续 发酵过程中，发酵液的稀释率控制在0. Olh—i至0. 15 h-'。
连续发酵系统可以由培养基贮罐、l个或多个发酵罐和发酵液贮罐构成。发 酵过程中，培养基的补给速率等于发酵液的排出速率，从而使发酵罐的工作体 积保持大致恒定。
本发酵方法在pH为4. Q至7. 5之间进行，适宜的发酵pH为5. 3左右。发 酵液PH的控制过程中，可以釆用轻质碳酸钙、碳酸钠或氢氧化钠等作为中和剂。
本发酵方法可以在大约3(TC至大约4(TC的温度下进行，适宜的发酵温度为 33。C左右。
本发酵方法需要在有氧条件下进行，发酵过程中的通气量大约为0.2v/v/m (每分钟每体积单位发酵液中的空气体积)至2.0v/v/m，适宜的通气量为 0. 7v/v/m左右。
虽然本发明的发酵几乎可以在常压下进行，但最好选择在 0. 02MPa--0. 05MPa的压力下进行发酵。
本发明还涉及通过多级连续发酵从葡萄糖或淀粉水解糖生产2-酮基-D葡萄 糖酸的方法。所述多级连续发酵系统中具有2个或更多的发酵罐，并依级连续 放置。
附图为2-酮基-D-蔔萄糖酸连续发酵工艺流程框图。
具体实施方式
实施例1
本实施例种子培养采用5L的自控发酵罐。将荧光假单胞菌K1005的菌悬液 接入3. 5L含有2. 0%的葡萄糖、1. 0%的玉米浆、0. 2%的尿素、0. 2%的KH2P04、 0. 05% 的MgSOr7H20、 0. 25°/。的轻质CaC03 (灭菌前pH 7.0)的种子培养基中，控制搅 拌转速楊rpm、罐温33°C 、罐压0. 030MPa、通气量0. 5v/v/m培养20h。
连续发酵釆用50L的自控发酵罐，其具有搅拌系统以及温度、pH、溶解氧 (DO)的控制与监测系统。其工作体积为35L，温度被控制在33士rC，搅拌速 度和通气速率被分别设置为400rpm和3. 5L/min。连续发酵过程中，用蠕动泵控 制补料的速率，用另外1台蠕动泵将含有2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵液从发酵罐 连续排至发酵液贮罐中，保持发酵罐的工作体积恒定。
发酵培养基的组成为16.2%的淀粉水解糖、1.5%的玉米浆和4.5%的轻质 CaC03(灭菌前pH 6. 7 )。将前述培养好的种液接入35L的发酵培养基中培养30h, 然后转为连续发酵模式，设置稀释率为0. 06h—以2. 1L/h的补料速率连续流加 发酵培养基。连续发酵共进行了 120h，生产2-酮基-D-葡萄糖酸44"9. 7g，发 酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为159. 2g/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为 0.006%。根据上述结果计算，平均发酵转化率(mol/mo1)为89. 平均发酵 产率约为5. 99g/L/h。
实施例2
种子培养及发酵条件控制同实施例1。 一
发酵培养基的组成为18. 0%的淀粉水解糖、1.7%的玉米浆和5. 0%的轻质 CaC03 (灭菌前pH6. 7)。将培养好的种液接入35L的发酵培养基中培养S0h,然 后转为连续发酵模式，设置稀释率为0. 055h—、以1.925L/h的补料速率连续流 加发酵培养基。连续发酵共进行了 12Qh,生产2-酮基-D-葡萄糖酸"916. 9g, 发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为173. 6g/L，发酵液中残留的葡萄糖平均 为0.011%。根据上述结果计算，平均发酵转化率(mol/mo1)为8S. 9S%,平均 发酵产率约为6. 12g/L/h。
实關3
种子培养及发酵条件控制同实施例1。
发酵培养基的组成为18. 0%的淀粉水解糖和1. 5%的玉米浆(灭菌前pH 4. 5, 灭菌后用无菌氢氧化钠溶液调节至6. 2 )。将培养好的种液接入的发酵培养 基中培养，并用氢氧化钠溶液控制发酵液PH为5. 3左右，30h后转为连续发酵 模式，设置稀释率为0. 0551T1,以1. 925L/h的补料速率连续流加发酵培养基。
连续发酵共进行了 l"h,生产2-酮基-D-葡萄糖酸54072. 8g,发酵液中2-酮基 -D-葡萄糖酸的浓度为173. 3g/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为0.009%。根据 上述结果计算，平均发酵转化率(mol/mo1)为89.28%,平均发酵产率约为 6. 22g/L/h。 实施例4
种子培养同实施例l。
连续发酵采用2台50L的自控发酵罐，其具有搅拌系统以及温度、pH、溶 解氧(DO)的控制与监测系统。第1台发酵罐的工作体积为30L,第2台发酵罐 的工作体积为40L,温度被控制在34士rC,搅拌速度被设置为400rpm,通气速 率被分别设置为3. OL/min和4. OL/min。连续发酵过程中，用蠕动泵控制第1台 发酵罐的补料速率，用第2台蠕动泵将含有2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵液从第1 台发酵罐连续排至第2台发酵罐中，用第3台蠕动泵将第2台发酵罐的发酵液 连续排至发酵液贮罐，保持发酵罐的工作体积恒定。
发酵培养基的组成为18. 0%的淀粉水解糖和1. 7%的玉米浆(灭菌前pH 4。 5, 灭菌后用无菌氢氧化钠溶液调节至6.2)。将培养好的种液接入第]台发酵罐的 30L发酵培养基中培养，并用氢氧化钠溶液控制发酵液pH为5. 3左右。30h后 转为连续发酵模式，设置稀释率为0. 125h-、以3. 75L/h的补料速率连续流加 450L的发酵培养基。第2台发酵罐接受来自第1台发酵罐的发酵液40L后，以 3. 75L/h的速率连续将成熟的发酵液排至发酵液贮罐(第2台发酵罐中发酵液的 稀释率为0.09375 h-"。该过程共耗时162h左右，生产2-酮基-D-葡萄糖酸 82944. 7g,发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为172. 9g/L,发酵液中残留的 葡萄糖平均为0.014%。根据上述结果估算，平均发酵转化率(mol/mo1)约为 89.07%,平均发酵产率约为5. 12g/L/h。
对照例1
种子培养同实施例l。
起始发酵培养基的组成为9. 0%的淀粉水解糖、1. 0%的玉米浆和2. 5%的轻 质CaC03(灭菌前pH 6.7)。补料培养基的组成为18. 0%的淀粉水解糖、1.0%
的玉米浆和5. 0。/。的轻质CaC03 (灭菌前pH 6.7)。将种液接入UL的起始发酵培 养基中，控制搅拌转速400rpm、罐温35。C、罐压0. 020MPa、通气量1. Ov/v/m 培养12h，然后以2. OL/h的速率流加28L的补料培养基。流加结束后，继续发 酵至发酵液中的残糖为0. 1%以下。该发酵周期为29h，生产2-酮基-D-葡萄糖酸 5905. 8g,发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为154. lg/L,发酵液中残留的葡 萄糖平均为0.013%。根据上述结果计算，平均发酵转化率(mol/mol)为89.54%, 平均发酵产率约为4. 07g/L/h。 对照例2
种工培养同实施例4。
起始发酵培养基的组成为11. 65。/。的淀粉水解糖、2. 45%的玉米浆和8.0% 的轻质"C03 (灭菌前pH 6.7)。补料培养基的组成为30. 0%的淀粉水解糖。将 种液接入25L的起始发酵培养基中，控制搅拌转速400rpm、罐温35°C、罐压 0. 02画Pa、通气量1. Ov/v/m培养16h,然后以2. 0L/h的速率流加l化的补料培 养基。流加结束后，继续发酵至发酵液中的残糖为0. 1%以下。该发酵周期为36h， 生产2-酮基-D-葡萄糖酸7160. 6g,发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为 179. lg/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为0.003%。根据上述结果计算，平均发 酵转化牟(raolAnol)为89.63%,平均发酵产率约为3. 98g/L/h。
权利要求
1、一种通过连续发酵从葡萄糖或淀粉水解糖高产率发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸及其盐类的方法，其特征是所述连续发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸及其盐类的方法包括如下步骤在所述发酵容器中培养能够利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵转化2-酮基-D-葡萄糖酸的细菌，向所述发酵容器中连续补给含有葡萄糖的培养基，发酵液的稀释率控制在大约0.01h-1至大约0.15h-1，所述发酵培养基中的葡萄糖浓度在大约100g/L至大约250g/L之间，与发酵液的稀释率相对应，培养基的补给速率等于发酵液的排出速率，连续从所述发酵容器中放出发酵液(放出的发酵液中的葡萄糖浓度应低于2g/L)，从放出的发酵液中回收2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中所述的发酵容器中发酵液PH值 控制在4. 0至7. 5之间。
3、 根据权利要求l所述的方法，其中所述的发酵容器中发酵液发酵温 度控制在3(TC至4(TC之间。
4、 根据权利要求l所述的方法，可使用多级连续发酵，多级连续发酵 系统中具有2个或更多的发酵罐，并依级连续放置。
全文摘要
一种通过连续发酵从葡萄糖或淀粉水解糖高产率发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸及其盐类的方法，包括在发酵容器中培养能够利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵转化2-酮基-D-葡萄糖酸的细菌；向发酵容器中连续补给含有葡萄糖的培养基；与发酵液的稀释率相对应，连续从所述发酵容器中放出发酵液；从连续放出的发酵液中回收2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐。
文档编号C12R1/39GK101363033SQ20081010705
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月4日 优先权日2008年9月4日
发明者彬 余, 余泗莲, 刘敬泽, 强 周, 孙文敬, 李中兵, 杨晓军, 转 魏, 黄达明 申请人:江西省德兴市百勤异Vc钠有限公司;江苏大学;河北化工医药职业技术学院