专利名称：一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法
技术领域：
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种提高携带外源基因的 重组腺病毒载体转染猪皮效率的方法。
背景技术：
烧伤是一类发生率及致残率均较高的特殊类型创伤，其根本问题就 是创面问题，如果烧伤创面得不到及时有效的覆盖、封闭，必将引起患
者机体内环境的紊乱、感染及多脏器功能障碍的发生；此外，还可能出 现创面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，残疾程度加剧。因此，对烧 伤创面进行皮肤移植的研究是现代烧伤治疗的迫切需要；也是烧伤研究 的热点及难点。
深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患 者自体皮源严重不足，需经非自体(同种异体或异种)皮覆盖创面方能取 得较好的临床效果，同种异体皮(主要是尸体皮)是目前烧伤创面治疗中 公认效果较好的生物敷料，但由于来源和伦理等多种条件限制，同种异 体皮无法满足临床需求。猪皮由于与人皮在组织结构和生理功能上的高 度相似性，是临床使用最为广泛的异种皮肤，但由于猪和人之间的种属差 异，其排斥反应比较严重，无法起到长期覆盖作用。
专利申请号为00103528.2,发明名称是"一种用重组基因转染的异 体皮肤，，的专利申请公开了利用传统的Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基 因CTLA4Ig对猪皮肤进行体外转染，可使CTLA4Ig蛋白在猪皮组织活细 胞内表达，从而起到抑制免疫排斥的发生，在烧伤创面诱导移植皮肤局 部特异性免疫耐受，达到延长移植异种皮肤成活的目的。但是，由于Ad5腺病毒载体和被转染细胞表面均带负电荷，相互之间 存在静电排斥力，所以上述利用Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因 CTLA4Ig对猪皮肤组织细胞的转染效率较低，需要较高滴度的病毒感染才 能发挥效果，使得基因转染猪皮的生产成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高基因转染猪皮转染效率的方法，该方 法可以提高Ad5重组腺病毒载体对猪皮肤细胞的转染效率。 实现本发明目的的技术方案如下
一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法，包 括如下步骤
1) 制备待转染的猪皮肤；
2) 使用浓度为500-5000jug/ml二乙氨乙基葡聚糖对l()8pFU/ml Ad5 重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；
3) 将步骤2 )制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。 其中，步骤l)所述猪皮肤是任何一种品系的猪皮肤，优选巴马香猪
皮肤，进一步优选小于6个月猪龄的猪皮肤，最优选4-6月龄的巴马香 猪皮肤。所述猪皮肤的厚度为0. 1-1. 0毫米，优选0. 4 - 0. 6毫米。
其中，步骤2)中所述Ad5重组腺病毒载体含有CTLA4Ig重组基因， 可按照专利申请号为00103528,发明名称是"一种用重组基因转染的异 体皮肤，，的专利申请公开的方法制备CTLA4Ig重组基因和含有CTLA4Ig 重组基因的Ad5腺病毒载体。
其中，步骤2)中所述孵育具体为4'C孵育10-20分钟。
其中，步骤3)中所述转染具体是在C02培养箱内37。C转染l-3小时。
其中，步骤3 )具体为将步骤2 )中处理后的转染液按0. 8 - 2. 2ml/cm2 的比例对步骤1 )中处理后的猪皮肤在C02培养箱内37。C转染1 - 3小时。其中步骤3)优选将步骤2)制备的转染液按lml/cm2的比例对步骤l ) 制备的猪皮肤在C02培养箱内37。C转染2小时。
本发明中使用的二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)是一种常见的 带有阳离子基团的有机分子，其阳离子基团二乙氨乙基(DEAE)结合有 一定的阳离子，当其与Ad5重组腺病毒载体采用适合的比例混合后转染猪 皮肤细胞时，可中和腺病毒载体和细胞表面的阴离子基团，降低了腺病 毒载体和细胞表面之间的静电排斥力，从而增加腺病毒与细胞的相互接
触，提高腺病毒载体对猪皮肤细胞的转染效率。
本发明在体外利用二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)对Ad5重组腺 病毒载体转染液进行处理，以此处理后的腺病毒转染液对猪皮组织进行 转染，与未经处理的腺病毒转染相比，发现可以提高转染效率75-130倍， 大大的提高了基因转染的效率，降低了生产成本。而且试验表明，二乙 氨乙基葡聚糖不会引起腺病毒载体和细胞的变性或失活，因此可以4艮好 地发挥协助腺病毒载体对猪皮肤的转染作用。
图l为CTLA4Ig标准品的吸光值标准曲线图。
具体实施例方式
以下通过实施例详细说明本发明。在下面的实施例中所涉及的实-睑
得。本发明所使用的含有CTLA4Ig重组基因的Ad5腺病毒载体，可按照 专利申请号为00103528,发明名称是"一种用重组基因转染的异体皮肤" 的专利申请公开的方法制备。
实施例l利用本发明方法制备CTLA4Ig基因转染猪皮 步骤l:取皮消毒
将猪处死后用洗衣粉清洗外部皮肤，手术刀刮毛，再用5%碘伏消毒，酒精脱色后无菌取皮，在洁净环境下用皮鼓将猪皮剖成厚度层为0.6mm 厚度皮块备用。
步骤2: 二乙氨乙基葡聚糖对Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体的处理
使用浓度为500-5000 jug/ml的二乙氨乙基葡聚糖(SIGMA公司产品) 对108PFU/ml Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体进行震荡混合，在4。C下孵育10-20 分钟，制备成转染液。 步骤3:腺病毒载体转染
将步骤2中处理后的转染液4姿lml/lcn^的比例对步骤1中处理后的 皮片进行转染，转染条件为C02培养箱内37X:转染2h,同时以未经二乙 氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)处理的腺病毒转染液为对照对步骤1中 处理后的皮片进行转染，对照组处理措施除腺病毒转染液未经二乙氨乙 基葡聚糖处理外，其余处理措施及转染条件和二乙氨乙基葡聚糖处理组 完全一致。
实施例2 二乙氨乙基葡聚糖处理组与对照组的目的基因转入量比较
提取实施例1中二乙氨乙基葡聚糖处理组和对照组中的基因组总DNA (提取方法参照《分子克隆实验指南》(第3版)463-471。科学出版社)。 然后进行目的基因转染的定量检测，以确定目的基因的转入量。目的基 因转染的定量检测的方法如下
用目的引物与内参引物分别对样品DNA进^f亍扩增。
目的引物5， AGGTCAAGTTCAACTGGTACG 3，，见SEQ ID NO: 1。
5， CTTGTACTCCTTGCCATTCA 3，，见SEQ ID NO: 2。 内参引物:5， TTTAACTCTGGCAAAGTGGAC 3，，见SEQ ID NO: 3。 5， GGTGGAATCATACTGGAACAT 3，，见SEQ ID NO: 4。 定量PCR反应程序 95°C 3min94°C 30s 60°C 30s 读板
40个循环 72 °C 3min 95°C lmin 55。C lmin
熔解曲线从55。C到95°C,每0. 5。C循环一次10s。
目的基因的量比上内参基因的量即为目的基因的导入量。实验结果 表明经用二乙氨乙基葡聚糖处理的腺病毒转染猪皮后目的基因导入量较 未经处理的腺病毒转染猪皮提高了 75-130倍。
实施例3 ELISA检测二乙氨乙基葡聚糖处理组和对照组的腺病毒转染 猪皮后猪皮组织中CTLA4Ig的表达量的比较 1)样品准备
将实施例1转染后的猪皮组织继续培养48小时，然后将不同处理的 猪皮组织在灭菌烧杯或一次性培p中用灭菌PBS漂洗三次，在一次性 培养m内剪碎，每张皮片加1.5ml灭菌PBS用匀浆器在离心管内制备匀 浆，再离心5000r/min， 3min取上清作为样品；培养皮片后的培养基也 作为样品。
2 ) ELISA检测
CTLA4Ig标准品标定曲线用CTLA4Ig标准品(R&D System USA) 制做标定曲线和曲线方程，结果见表1,根据表1结果制作CTLA4Ig标准 品的吸光值标准曲线图，见图1。表明随标准品浓度增力口，吸光值也随之 增力口，并呈线性相关趋势，相关系数112=0. 9622，表明相关程度较高，说明利 用此图可以准确;险测样品中0-24 )i g的CTljHIg浓度。样品中CTLA4Ig测试酶标板每孔加入100 jul (ljug/ml)大鼠抗 CTLA4Ig的一抗(Abnova)， 4'C包一皮过夜，洗板，然后每孔加入200jal 封闭液(l%BSA+0. 02%Tween—20+PBS) 4。C过夜，洗板，每孔加入100 jal 样品室温反应2h,洗板，每孔加入100 |il (liag/ml)羊抗大鼠二抗 (southern biotech),室温反应2h，洗—反，每孔加入100 y 1底物显色 液(双氧水+邻苯二胺)，室温反应30min,力口入100 |a 1 2MH2S04，用酶标 仪在49Gnm波长测定吸光度。
实验结果见表2,将表2数值带入CTLA4Ig标准品的吸光值标准曲线 方程(Y=0. 0444X+0. 1621 ),得出二乙氨乙基葡聚糖处理组匀浆中表达 CTLA4Ig量为225ng/ml，对照组匀浆中含量为130ng/ml，说明二乙氨乙 基葡聚糖处理组的Ad5-CTLA4Ig腺病毒转染猪皮组织匀浆中表达CTLA4Ig 量比对照组的高95 ng/ml; 二乙氨乙基葡聚糖处理组的Ad5-CTLA4Ig腺 病毒转染猪皮组织培养基中分泌的CTLA4Ig为189ng/ml,对照组为 70ng/ml， 二乙氨乙基葡聚糖处理组比对照组高119ng/ml。
表1 用CTLA4Ig标准品3次重复测试吸光值
标准品(ng) 02 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
吸光值(重复l) 0.124 0.216 0.327 0.392 0.586 0.54 0.708 0.937 0.839 1.06 0.899 1,032 1.254
吸光值(重复2) 0.135 0.238 0.338 0.394 0.655 0.54 0.706 0.989 0.841 1.075 1.057 1.041 1.243
吸光值(重复3 ) 0.162 0.217 0.325 0.4 0.665 0.53 0.734 0.641 0.866 1.071 1.057 0.983 1.289
平均值 0.1403 0.224 0.33 0.395 0.635 0.54 0.716 0.856 0.849 1.069 1.004 1.019 1.262表2 二乙氨乙基葡聚糖处理组与对照组转染猪皮CTLA4Ig吸光值比较
实验次数对照组勾浆 OD值对照组培养基 分泌OD值处理组匀浆 OD值处理组培养基 分泌OD值
第一次0. 81270. 46941. 20011. 1200
第二次0. 65340. 52391. 14210. 9934
第三次0. 75180, 42541. 14110. 8905
平均值0. 73930. 47291. 16111. 0013
以上实施例只是用于进一 步说明本发明，而不是用来限制本发明的 保护范围。凡是在本发明保护范围内所做出的具体实施方式
及应用范围 上的些许变动，也属于本发明的保护范围。序列表
<110> 重庆宗申军辉生物技术有限公司
<120> —种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法
<130> MP080771
<160> 4
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 目的引物
<400> 1
aggtcaagtt caactggtac g 21
<210> 2
<211> 20
<212> 腿<213> Artificial <220>
<223> 目的引物
<400> 2
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<223> 内参引物
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<220><223> 内参引物 <400> 4
ggtgga"ca tactggaac3 t 2权利要求
1、一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法，其特征在于包括如下步骤1)制备待转染的猪皮肤；2)使用浓度为500-5000μg/ml二乙氨乙基葡聚糖对108PFU/ml Ad5重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是巴马香猪 皮肤。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是小于6个 月猪龄的猪皮肤。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是4-6月龄 的巴马香猪皮肤。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤的厚度为 0. 1-1. 0毫米。
6、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于步骤2)中所述Ad5重 组腺病毒载体含有CTLA4Ig重组基因。
7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中所述孵育具 体为4t:孵育10-20分钟。
8、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述转染具 体是在C02培养箱内37。C转染1 - 3小时。
9、 权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3 )具体为将步骤2 ) 制备的转染液按0. 8-2. 2ml/cm2的比例对步骤1)制备的猪皮肤在C02 培养箱内37。C转染1 - 3小时。
10、 权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3 )具体为将步骤2 ) 制备的转染液按lml/cm2的比例对步骤1)制备的猪皮肤在C02培养箱内/37。C转染2小时,
全文摘要
本发明涉及一种利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因转染猪皮转染效率的方法，包括如下步骤1)制备待转染的猪皮肤；2)使用浓度为500-5000μg/ml二乙氨乙基葡聚糖对10<sup>8</sup>PFU/ml Ad5重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。本发明中二乙氨乙基葡聚与Ad5重组腺病毒载体混合后转染猪皮肤细胞时，其携带的阳离子可中和腺病毒载体和细胞表面的阴离子，降低了腺病毒载体和细胞表面之间的静电排斥力，从而增加腺病毒载体与猪皮肤细胞的相互接触，提高腺病毒载体对猪皮肤的转染效率。
文档编号C12N15/67GK101613709SQ20081012682
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者志 刘, 军 吴, 葛良鹏, 泓 魏 申请人:重庆宗申军辉生物技术有限公司