乙型肝炎病毒单克隆抗体可变区序列以及含有所述可变区的基因工程抗体及其用途的制作方法

专利名称：乙型肝炎病毒单克隆抗体可变区序列以及含有所述可变区的基因工程抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对乙型肝炎病毒preSl的新鼠单克隆抗体可变区序 列，包括重链和轻链可变区及其保守性变异体，编码该变区氨基酸序 列的核酸分子，包含该核酸分子的重组表达栽体以及宿主细胞，由所 述可变区序列组装成的基因工程抗体，包含该基因工程抗体的融合蛋 白，由该基因工程抗体与一种或多种治疗乙型肝炎病毒的药物分子偶 联的复合物，该基因工程抗体用于制备诊断、预防和/或治疗乙型肝 炎病毒的药物的用途，以及包含该基因工程抗体和药学可接受的载体 和/或佐剂的药物组合物。
背景技术：
在我国每年平均有200万人患肝炎，其中50%为乙型肝炎感染， 并有约1亿人左右为乙型肝炎表面抗原(HBsAg )携带者。世界卫生组 织1996年的统计显示，全世界至少有30°/。的人口约20亿人感染过乙 型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)，其中约3.5亿人为慢性HBV 携带者 (chronic HBV carriers ) ( The world health report 1996-Fighting disease, fostering development )。 由HBV感染引 发的慢性肝病和肝癌是人类最严重的健康问题之一。更为突出的问题 是，目前世界上仍存在3亿多的成年慢性HBV携带者和数千万的慢性 肝病患者(Alper等人，1989.新英格兰医学杂志(N Engl J Med.) 321 (11): 708-712; Belloni 等人，1998. 疫苗(Vaccine). 16 (4): 399-402),如得不到有效的治疗，将意味着未来30-40年间有 数千万人可能因肝硬化或肝癌而死亡。
目前，人们对乙型肝炎病毒的认识已提高到分子水平。有关HBV 的基因组结构、编码蛋白、合成途径、装配途径等问题已基本被阐明。HBV是已知最小的真核细胞DM病毒之一，是一种逆转录病毒， 基因组结构相当精密、独特，为一全长约3. 2kb的小环形DNA。 HBV DNA 双链长度不对称，全长的负链与病毒mRNA互补；正链仅5，末端固定， 长度约n00-M00nt。 HBV负链有4个开放阅读框S、 C、 P和X，分 别编码膜蛋白、核壳、聚合酶和HBx蛋白。S开读框分别编码S基因、 preS2区和preSl区，三者各有其起始密码ATG。 HBV由大、中、主蛋 白三种外膜蛋白包裹毒粒，使病毒能够附着和侵入新的肝细胞。主蛋 白即HBsAg，由226个氨基酸组成。中蛋白即preS2+HBsAg，由281 个氨基酸组成。大蛋白即preSl+preS2+HBsAg，由389-400个氨基酸 组成(Lau等人，1993.柳叶刀(Lancet) ， 342: 1335-1340;骆抗先.乙 型肝炎-基础与临床(第一版)，北京人民卫生出版社，1997， pl3-16 )。 一般认为，preSl和主蛋白的功能与其空间构型相关，preS2功能与其 一级结构密切相关。 一个典型的HBV携带者血液中preSl、 preS2和S 的摩尔比约为1: 20: 10000 (骆抗先.乙型肝炎-基础与临床(第一版)， 北京人民卫生出版社，1997， p30-32 )。
HBV感染具有较严格的宿主种属特异性和组织嗜性，较为确切的证 据显示它只对人和黑猩猩具有感染性，主要侵害肝组织(Barker等人， 1975.感染性疾病杂志(J Infect Dis ) ， 132 (4) :451; Barker等人， 1975. Am J Med Sci， 270 (1) : 189)。膜蛋白决定了 HBV的感染嗜性, 膜蛋白通过与肝细胞膜上受体的结合介导病毒吸附和进入肝细胞(De 等人，1997.病毒性肝炎杂志(J Viral Hepat) ， 4 (3): 145-153 )。目 前多数人认为preSl是病毒与肝细胞膜受体的结合部位，因为preSl 21-47合成肽及其相应抗体可以体外抑制HBV与人肝癌细胞的结合， preSl 21-47的变异可导致HBV失去感染力。
preS蛋白在T细胞水平有较强的免疫原性，在preS区亦含有中 和抗体的把表位，preS抗体对宿主亦有保护作用。两个来自preSl的 多肽12-47和94-117和佐剂KLH偶联后免疫，均使猩猩得到保护 (Neurath等人，1989.疫苗(Vaccine ) ， 7 (3): 234-236 )。临床上， preS抗体的出现常被看作是HBV感染清除的早期标志。研究显示抗 preSl抗体是急性自限性乙肝患者HBV清除时出现最早的一种膜抗体。研究发现在产生抗preSl (21-47)阴性的人群中，仅有7. 6% ( 5/66 )的 患者成功地清除了病毒(Alberti等人，1990.肝脏病学(Hepatology ) 12 (2): 199-203 ) 。 Coursaget等(1999. 病毒学研究(Res Virol) ， 141 (5): 563-570 )。 Coursaget等(1999.病毒学研究(Res Virol) ， HI (5): 563-570 )对不同HBV感染人群的preSl抗体应答 进行了研究，发现急性自限性乙肝、慢性乙肝患者的抗preSl (21-47) 检出率分别为37%和1°/。。在Mi等(1999.中华医学杂志(Chin Med J (Engl) ) ， 112 (4): 321-324)的研究中，发现急性自限性乙肝患者血清 中抗preSl的出现与ALT水平的升降相关。
至今为止，人类病毒病的预防主要还是以病毒疫苗为主，而病毒 病的治疗除特异性抗病毒抗体外，任何病毒感染尚无特异性药物治疗。 由于目前大多数抗病毒药物仅能通过抑制HBV复制来緩解炎症活动 性，尚无法彻底清除病毒，故在临床试验中，标准的抗病毒治疗终点 是慢性HBV感染者血清HbeAg的消失(抗HBe阳转或无均可)及血清 HBV DNA水平降低至无法检出，而不是病毒的完全清除。
抗体分子的特性为专一针对某种抗原。抗病毒抗体以其特异性结 合不同病毒蛋白的特性而显示出不同的功能。许多抗病毒的多克隆抗 体、单克隆抗体以及不同形式的基因工程重组抗体由于其特异性结合 病毒表面蛋白或病毒胞膜糖蛋白，可以包裹病毒颗粒、阻断病毒吸附、 诱导体内杀伤细胞功能等机理来中和和阻断病毒感染，因此，可用于
制备抗病毒抗体药。
1984年Morrison等人将鼠单抗可变区与人IgG恒定区在基因水 平上连接在一起，构建成功了第一个基因工程抗体即人-鼠嵌合抗体 (human-mouse chimeric antibody)。此后，各种基因工程抗体大量 涌现。1986年，Jones等人用鼠源单抗的CDR区置换人IgG的CDR区， 成功构建了第一个改形抗体(reshaped antibody)，也称CDR移植抗 体(CDR grafting antibody )。此夕卜，包括Fab、 Fv、 scFv、 diabody、 单域抗体等在内的多种单价小分子抗体以及发展迅猛的双特异性抗 体、多特异性抗体陆续构建成功。应用人源噬菌体抗体库技术和抗体工程平台技术，抗病毒感染治 疗性的人源或人源化基因工程抗体的研究已取得了很大进展。目前，
乙肝病毒(HBV)人源抗病毒基因工程抗体获得实验室阶段成功。
抗乙肝病毒HBsAg的重组Fab抗体国内外均有成功的报道。由 于HBsAg基因工程疫苗的及HBsAg纯化的商品化，获得人源抗HBsAg 的重组抗体相对较其他抗病毒抗体容易，获得Fab抗体往往具有与 HBsAg较高的亲和力。然而，当前的HBV基因工程抗体研究，多数都 以HBsAg作为乾抗原。但临床研究表明，preSl的消失常预示着病程 的良好进展(Delfini等人，1989.医学病毒学杂志(J Med Virol )， 28 (3): 169-175 ) ， preSl抗体的出现则被看作是HBV感染清除的早期 标志 (Budkowska 等人，1986. 肝脏病 学
(Hepatology) ， 6 (3): 360-368 )。 PreSl可能含肝细胞膜受体结合位 点和病毒中和表位，preSl抗体可能通过两种机制参与病毒的清除 1. preSl抗体的调理作用可清除循环中游离的病毒；2. preSl抗体的中 和作用可阻止新生病毒对肝细胞的再感染。
针对preSl抗原的基因工程抗体的研究尚未取得成功。目前只有 张志超等人(2002. 生物化学与生物物理进展(Prog Biochem Biophys) ， 29 (4) :572-575 )进行了高亲和力抗preSl ( 20-47 )的人 源单链抗体的筛选研究，噬菌体抗体库进行3轮淘选后，抗原抗体反 应结果显示，从免疫库中获得了亲和力1(T7~10—8M的抗preSl的单链 抗体，高于从天然抗体库获得的结果(1(T 1(TM)。 Budkowska等人
(1995.病毒学杂志(J Virol ) ， 69: 840-848 )报道了鼠单克隆抗 体5al9，识别preSl ( 36-43 )的一个线性表位，Maeng等人(2000.病 毒学(Virology) ，270:9-16)证明此单抗能阻止HBV进入培养的人 肝细胞，Pizarro等人(2001. FEBS Lett, 509 (3): 463-468 )进一步
获得其重链和轻链可变区，对它的抗原结合动力学等方面进行了研究。 Choi等人(1998.杂交瘤(Hybridoma) ， 17: 535-540 )从天然重组抗 体库中筛选出人重组Fab抗体片段，识别preSl,随后提高了其亲和 力(Park等人，2000.生物化学与生物物理研究通讯(Biochem BiophysRes Commu) ， 275: 553-557 )。但是还没有进一步研究和应用的报道。 因此，在现有的抗病毒抗体药中，由于人源基因工程抗体尚未完 全成熟，血源性免疫球蛋白抗体制品仍然占市场主导，例如，Bayer 公司生产的抗HBV病毒高效免疫球蛋白BayHep BTM及美国Nabi公司 生产的Nabi-HBTM，由来源于抗乙肝病毒HbsAg抗体高的供体血浆提 纯制备而成。
本发明人针对乙型肝炎病毒preSl为靶点设计并制备鼠单克隆抗 体。在此基础上用RT-PCR法扩增出所述单克隆抗体的重链和轻链可变 区编码基因，进一步组装成单链抗体(scFv)，并在大肠杆菌中得到了 良好表达。经纯化后的4D11单链抗体保留了原鼠单单克隆抗体特异性 结合preSl (21-47)的能力。为成功研制本发明所述的基因工程重组 抗体奠定了基础。

发明内容
除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本 发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名 和在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为 相应领域内广泛使用的常规步骤。
本发明一方面涉及可特异性结合乙型肝炎病毒preSl的鼠单克隆 抗体的可变区序列，其中1)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:1 所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰保 守性突变而获得的保守性变异体；2 )轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、 修饰保守性突变而获得的保守性变异体。
抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链集合体，称为轻链和重 链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻 链都进一步分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可 变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可 变区)和单个的恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
"重链可变区"是指一种多肽，(1)其长度为110至125个氨基 酸；(2)其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸 开始的重链氨基酸顺序。同样，"轻链可变区"是指一种多肽，(l)其 长度为95至115个氨基酸；(2)其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗 体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。
本发明所用的术语"保守性变异体"是指基本上保留了其母本的 特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的 变异体。 一般的，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽。 但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非 常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸 序列上的差异可以是例如 一个或多个氨基酸残基及其任一组合的替 换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可 不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以 是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱 变技术或直接合成而产生。
本发明还涉及一种由所述的可变区序列中重链可变区部分或其保 守性变体，和/或轻链可变区部分的氨基酸序列或其保守性变异体组 装成的基因工程抗体，其仍保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力。
在本发明优选的实施方案中，所述的基因工程抗体，为包含所述 preSl的鼠单克隆抗体的可变区序列中重链可变区氨基酸序列或其保 守性变异体，和/或轻链可变区氨基酸序列或其保守性变异体的单链抗 体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、或其他人源化形式的单克隆 抗体，或所述抗体的片段，其仍保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力。
本发明又一方面，涉及一种包含两种或两种以上述基因工程抗体 或所述抗体片段的融合蛋白，其仍保留特异结合乙型肝炎病毒preSl 的能力。在本发明的一个优选实施方案中，所述融合蛋白为双特异抗 体。具体的，所述融合蛋白可以为包含选自至少一种本发明所述的单链抗体、或嵌合单克隆抗体、或改形单克隆抗体、或其他人源化形式
单克隆抗体，或保留特异结合乙型肝炎病毒喷入preSl的能力的所述 抗体片段的融合蛋白。
本发明再一方面涉及一种复合物，其包含选自至少一种上迷的基 因工程抗体，或其保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力的片段， 以及与之相偶联的一种或多种治疗乙型肝炎的药物分子。目前已知的 具有乙型肝炎治疗效果的药物均能够用于与本发明所述的基因工程抗 体偶联，用以制备所述复合物，以增强治疗效果。
本发明还涉及一种核酸分子，其编码preSl的鼠单克隆抗体所述 的可变区氨基酸序列之重链可变区，其具有如SEQ ID N0:3所示的核 苷酸序列或其简并性序列；或者其编码preSl的鼠单克隆抗体可变区 氨基酸序列之轻链可变区，其具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列 或其简并性序列。
本发明还涉及一种包含上述核酸分子的重组表达栽体。和经上述 重组表达载体转化的宿主细胞，其能够表达本发明所述的基因工程抗 体，或其保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力的片段。
适用于表达本发明所述核酸分子的包括但不限于染色体的、非染 色体的和合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体 DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA结合的栽体、病毒DNA、杆 状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及伪狂犬病毒。不过，只要能 在宿主中复制和存活，其它栽体也可以利用。
特别值得提及的是，本发明也包括含有上述本发明核酸分子的编 码序列的重组构建体。该构建体包括载体，如质粒或病毒栽体，其中 正向或反向插入了本发明的一个序列。在此实施方案的一个优选方面， 该构建体还包含调节序列，例如启动子，它被有效地连接到该序列上。 对于本领域技术人员来说，许多载体和启动子都是已知的，并可通过 商业途径获得。下面列举几种载体。细菌的pQE-70、 pQE-60、 pQE-9 (Qiagen)、 pBS、 pD10、 phagescript、 psiX174、 pBluescript SK、 pBSKS、 pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A (Stratagene)、 pTRC99a、pKK223-3、 pDR540、 pRIT5 (Pharmacia);真核的pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44 、 pXTl 、 pSG (Stratagene) 、 pSVK3 、 pBPV、 pMSG、 pSVL (Pharmacia)。不过，只要是能在宿主中复制和存活，其它质粒或栽体 也可应用。
启动子区域可以利用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择标 记的栽体从想要的基因中选择出来。pKK232-8和pCM7是两个合适的 栽体。特称的细菌启动子包括LacI、 LacZ、 T3、 T7、 gpt、 PR、 PL 和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和 晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属疏蛋白I。合适栽体和启动 子的选择应在本领域普通的技术水平之内。
合适的DNA序列可以通过许多方法插到载体中。通常，DNA序列 用本领域中已知的方法插入到合适的限制性内切酶位点上。这些方法 相信处于本领域技术人员的知识范围内。
表达载体中的DM序列被有效地与一个合适的表达控制序列(启 动子)连在一起，从而指导mRNA的合成。下面提到的是这种启动子的 代表LTR或SV40启动子、大肠杆菌的Lac或trp启动子、噬菌体 的PL启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的其 它启动子。表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录 终止子。载体还可以具有增强表达的合适序列。
此外，表达载体优选包含能提供表型特征的一个或多个选择标记 基因，以便于转化宿主细胞的筛选，例如真核细胞的培养可用二氢叶 酸还原酶或新霉素抗性，大肠杆菌则可用四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述合适的DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以 用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。
宿主细胞是用本发明上述栽体进行遗传工程化(转导、转化或转 染)的，载体可以是一个克隆载体或表达栽体，如质粒、病毒粒子、 噬菌体等等。工程化的宿主细胞能在为适于活化启动子、筛选转化子 或扩增DRC2基因而改变的传统营养培养基上培养。培养条件诸如温 度、pH等与被选择的细胞原来所用的表达条件一致，对于本领域普通技术人员来说是很明显的。
本发明所述基因工程抗体均能够通过基因工程的方法由适当的宿 主细胞表达。本发明可以使用多种表达宿主细胞，如原核宿主细胞，
包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌林；真核宿主， 包括但不限于曲霉属、酵母属等的菌林，以及哺乳动物细胞、植物细 胞等。本发明上述述目标产物的表达并不局限于具体的表达栽体和表 达宿主，只要其能够表达本发明所述的基因工程抗体，其保守性变异 体。从这些讲授看，合适宿主的选择应该在本领域技术人员的知识范 围内。
在另一实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。宿 主细胞可以是高等真核细胞，比如哺乳类细胞，或者是低等真核细胞， 比如酵母细胞，还可以是原核细胞，比如细菌细胞。将构建体导入宿 主细胞的方法有磷酸钙转染、DEAE—葡聚糖介导的转染、电穿孔或 基因枪方法。
宿主细胞中的构建体能够通过传统的方法产生重组序列编码的基 因产物。另一途径是，可用传统的肽合成仪合成本发明的多肽。
在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细 胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA，也可以 用无细胞翻译体系产生这种蛋白质。适合于原核和真核宿主的克隆和 表达载体Sambrook等人已在《分子克隆实验指南》(第二版，冷泉港 出版社，纽约，1989 )中进行了描述。
在高等真核生物中，编码本发明所述可变区序列的DNA的转录可 以通过在载体中插入一增强子序列而被提高。增强子是DM的顺式作 用因子，通常有大约10-300bp，作用于启动子，提高它的转录。例如， SV40的位于复制起点后侧100-270bp处的增强子，巨细胞病毒早期启 动子增强子、位于复制起点后侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包含复制起点和用于转化宿主细胞的选择标 记，例如大肠杆菌的氨节青霉素抗性基因和哞酒酵母TRP1基因，还包
含从高效表达基因而来的启动子，从而介导下游结构序列的转录。这些启动子可以从编码糖酵解酶的操纵子中得来，诸如3-磷酸甘油酸激 酶(PGK)、 因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白。异源的结构序列以适 当的方位与翻译起始和终止序列以及其它优选的序列装配在一起。可 选择的情况是，异源的序列可以编码一个融合蛋白，该蛋白含有一个 N末端确认肽，表现出预期的特征，例如所表达的重组产物的稳定化 和提纯简化。
细菌适用的有效表达载体这样来构建将编码目的蛋白的结构 DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号被插入到带有一个功能启动 子的可操纵的阅读框中。载体应包含一个或多个表型选择标记和复制 起点，复制起点保证了载体在宿主中能保留下来，更理想的是能使载 体得到扩增。适于转化的原核宿主有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤 寒沙门氏菌以及假单孢菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种细菌，其 它的宿主也可以被选择。
根据本发明制备的单克隆抗体重链可变区及轻链可变区序列，以 及根据遗传密码子的筒并性产生的不同变体，本领域技术人员可用多 种方法制备包含上述核苷酸序列之重組表达载体，以及由所得重组表 达载体转化的宿主细胞。宿主细胞的选择和转化为本领域技术人员周
知，只要其能够表达本发明所述的单克隆抗体，其保守性变异体，或 单链抗体或嵌合抗体或改形抗体或其他人源化形式的单克隆抗体或抗 体片段，或融合蛋白或双特异抗体或其他形式的多肽或多肽类似物。
因此，本发明还涉及一种包含编码本发明所述的单克隆抗体，其 保守性变异体，或单链抗体或嵌合抗体或改形抗体或其他人源化形式 的单克隆抗体或抗体片段，或融合蛋白或双特异抗体或其他形式的多 肽或多肽类似物等之核酸分子的重组表达栽体。以及由所述重组表达 栽体转化的宿主细胞。本发明可以使用多种表达宿主细胞，如原核宿
主细胞，包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌株； 真核宿主，包括但不限于曲霉属、酵母属等的菌林，以及哺乳动物细 胞、昆虫细胞、植物细胞等。本发明上述目标产物的表达并不局限于 具体的表达载体和表达宿主，只要其能够表达本发明所述的单链抗体，其保守性变异体，或单链抗体或嵌合抗体或改形抗体或其他人源化形 式的单克隆抗体或抗体片段，或融合蛋白或双特异抗体或其他形式的 多肽或多肽类似物。
本发明所述的单链抗体，其保守性变异体，或单链抗体或嵌合抗 体或改形抗体或其他人源化形式的单克隆抗体或抗体片段，或融合蛋知的。
作为一个代表性的但非限定性的例子，细菌适用的有效表达载体 包括一个选择标记和细菌的复制起点，它衍生于从商业途径获得的、
具有众所周知的克隆栽体pBR322 (ATCC37017)的遗传元件的质粒。 这些商业化的载体包括诸如pKK223-3 (Pharmacia) 和pGEMl (Promega)等。pBR322的"骨架"部分与合适的启动子和被表达的结 构序列组合在一起。
在转化合适的宿主菌株和宿主菌株生长到恰当的细胞密度之后， 用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子， 并将细胞再培养一段时间。
通常用离心的方法收获细胞，用物理或化学的方法破碎细胞，将 粗提物保留以进一步纯化。用于表达蛋白的微生物细胞可以用任何便 捷的方法破碎，包括冻融循环、超声波、机械破碎，或者使用细胞溶 解剂，这些方法都是本领域的技术人员熟知的。
各种哺乳动物细胞的培养系统也能用于表达重組蛋白。哺乳类表 达系统的例子有Gluzman (Cell 23: 175， 1981)所描述猴肾成纤维细 胞的C0S-7细胞系，及其它的能表达相容栽体的细胞系，例如C127、 3T3、 CHO、 HeLa和BHK细胞系。哺乳类表达栽体包括复制起点、适当 的启动子、增强子及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、拼 接供体和受体位点、转录终止序列和5，侧翼非转录序列。衍生于SV40 拼接序列的DNA序列和多腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传 元件。
多肽可以从重组细胞培养物中回收和纯化出来，回收和纯化的方法有硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤 维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素 层析。形成成熟蛋白的完整构象需要蛋白质的再折叠步骤。高效液相
层析(HPLC)应用于最后的纯化步骤。
本发明另一方面还涉及所述的基因工程抗体或其保留特异结合乙 型肝炎病毒preSl的能力的片段用于制备诊断、预防和/或治疗乙型 肝炎病毒的药物的用途。
本发明又一方面还涉及一种治疗乙型肝炎病毒感染的药物组合 物，其包含治疗有效量的本发明所述的基因工程抗体，或其保留特异 结合乙型肝炎病毒preSl的能力的片段或保守性变体，以及药学可接 受的载体和/或佐剂。
本发明中，"治疗有效量"是指能够对受试个体产生有效保护以及 中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述"治疗有效量"随治疗方
案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不 同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，临床医生应 当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的"治疗有效量"。优选的，本 发明中所述治疗有效量为每千克体重0. OOlmg-Mmg，特别优选为0, 01 -10mg，更优选为O.lmg-10mg。所述治疗有效量为每千克体重 0. OOOlmg-O. lmg ， 特别优选为 0. 001-0. 06mg ， 更优选为 0. Olmg-O. 04mg。
本发明更进一步涉及一种用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染 的方法，其包括将预防有效量或治疗有效量的至少一种本发明所述的 基因工程抗体或其保留特异结合乙型肝炎病毒preSl能力的片段或保
守性变异体施用于患者。
本发明所述"预防有效量"，是指能够在接种的个体中足以引发免 疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述"预防有效量"随免疫 接种的方式、时机、给药对象以及所用单克隆抗体或其片段的不同而 不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技 术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的"预防有效量"。优选的，本发明中所述预防/免疫有效量为每次免疫千克体重
0. OOOlmg-0. lmg ， 特别优选为 0. 001-0. 06mg ， 更优选为 0. Olmg-O. 04mg。
类似地，"治疗有效量"是指能够对受试个体产生有效保护以及中 和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述"治疗有效量，，随治疗方案、 病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。 结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，临床医生应当能 够凭借其经验得出所用单克隆抗体的"治疗有效量"。优选的，本发明 中所述治疗有效量为每千克体重0. 001mg-20mg，特别优选为0.01 -10mg，更优选为0. lmg-10mg。所述治疗有效量为每千克体重 0. OOOlmg-0. lmg , 特别优选为 0. 001-0. 06mg ， 更优选为 0. Olmg-O. 04mg。
本发明利用本领域熟知的方法方便地从分泌4D11鼠单克隆抗体的 杂交瘤细胞系中获得编码本发明单克隆抗体重链可变区和轻链可变区 的编码序列。本领域内熟练的技术人员可方便地利用这些编码序列分 析出对于单克隆抗体结合特异性重要的氨基酸区域，如存在于抗体基 因轻链和重链可变区的决定簇互补区域(CDR) CDR1、 CDR2和CDR3， 其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。利用这些氨 基酸序列，用重组方法可制得具有与单克隆抗体相同或相似特异结合 能力的多肽，如将抗体重链可变区基因与轻链可变区基因顺序连接表 达而成的单链抗体(ScFv);将抗体重链可变区基因与轻链可变区基因 或CDRs基因置换到人类抗体的相应位置，表达出更接近于人类抗体而 又具有原单克隆抗体结合特异性的人源单克隆抗体如嵌合抗体或改形
抗体；也可以与另一个或多个单克隆抗体共同构建成多种形式的双特 异抗体或多特异抗体；等等。
单克隆抗体作为载体，携带毒素蛋白、放射性核素以及药物在肿 瘤的临床治疗中具有极大的应用潜力，但常用的鼠源性单克隆抗体在 临床的应用中具有许多限制其疗效和使用的障碍，最主要的是鼠单抗 对人体而言具有较强的免疫原性，可产生较强的人抗鼠抗体(humananti-mouse antibody, HAMA)反应。本发明通过基因工程技术改造， 构建成了保留原鼠单抗特异的抗原结合活性的单链抗体，可以很大程 度地降低抗体的鼠源性，降低人体对抗体的排斥反应。单链抗体的分 子较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位。根据诊断或治疗的需 要，还可以进一步制备出多种用途的新型抗体。


图1示乙型肝炎病毒preSl与GST的重组融合表达与纯化产物的 SDS-PAGE电泳结果。第1道为蛋白分子量标记；第2道为菌体裂解液； 第3道为Glutathione-Sepharose 4B柱纯化后的GST-preSl重组抗
原
图2示preSl单抗与HBV天然抗原的结合能力。 3H5， 1G5， 6F1, 7B6， 2A6， 7H11， 4D11为抗乙型肝炎病毒preSl 21-47合 成肽的鼠单克隆抗体。
图3示4D11单链抗体表达和初步纯化的SDS-PAGE电泳结果。第 第l道为蛋白分子量标记；第2道为菌体裂解液；第3道为菌体超声 上清液；第4道为菌体超声沉淀；第5道为hmol/L尿素洗涤上清； 第6道为4mmol/L尿素洗涤上清；第7道为8mmol/L尿素洗涤上清。
图4示4D11单链抗体初纯品在His柱纯化过程中各部分收集液 SDS-PAGE电泳结果。第1道为过柱前样品即初纯品；第2道为穿透峰； 第3道为第一次洗涤液；第4道为第二次洗涤液；第5道为第一次洗 脱液；第6道为第二次洗脱液；第7道为第三次洗脱液；第8道为第 四次洗脱液；第9道为再生液。
下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述。所述实 施例旨在以举例方式具体阐明本发明。载体和宿主的选择以及试剂的 浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对 本发明的限制。实施例
实施例1:用做抗原的GST-preSl融合蛋白的制备 目的基因的分离、克隆
利用蛋白酶K-酚氯仿法，从我室保存的慢性乙肝患者血清标本 (编号263 )中的提取HBV DNA。将血清装入新的灭菌过的1.5ml Eppendorf管，每管200ul。在每管中加入STE 156ul，簡DS 40ul 和100x蛋白酶K 4ul。然后在56T中水浴2-3小时，每隔一段时间 轻轻摇晃混匀一次。加入400ul的酚氯仿异戊醇，摇匀后静置5-10 分钟，不宜剧烈。12000g离心10分钟。小心将上清取出，加入两倍 体积以上(780ul )的无水乙醇和终浓度为0. 3M的NaAc(40ul)，置于 液氮中3分钟。12000g离心IO分钟。迅速弃去乙醇，再用70%乙醇洗 一遍。在恒温器(55。C )干燥5分钟左右至无乙醇气味，再加入20ul ddH20溶解。
设计多条引物，PCR分段分离HBV基因，并克隆至pMD 18-T载体 进行测序。克隆质粒pT-preS包含全长的preSl和preS2基因。另行 设计两条特异引物S1F (5， -AGA TCT CAT ATG AAA AAA TGG TCT TCC AAA CCT CG-3， )、 SIR(GGA TCC GGC CTG AGG ATG ACT G-3，)用来亚 克隆preSl基因，引物的5，末端或3，末端均添加了 1-2个内切酶识 别位点。以pT-preS为模板，S1F-S1R为引物扩增357bppreSl基因。 PCR产物回收后与pMD 18-T连接，得到克隆质粒pT-preSl。考虑到 preSl的分子量较小，我们选择了融合型原核表达质粒PGEX-20T作为 表达质粒。GST可作为载体蛋白提高乙肝抗原的免疫原性。选用该质 粒的另外的好处是该表达系统具有稳定、高效等优点，且表达的融合 蛋白也易于用亲和层析进行纯化。用pGEX-20T构建的重组质粒表达出 来的产物为GST和p reSl的融合蛋白，其中26kD的GST蛋白位于融合 蛋白的氨基端。BamH I/EcoR I双酶切处理表达质粒pGEX-20T，乙醇沉 淀法回收线性载体。用Bgl II/EcoR I双酶切pMD 18-T质粒，胶回收 试剂盒回收preSl片段。用T4连接酶将目的片段与pGEX-20T连接， 得到pGEX-20T-preSl质粒。重组蛋白在大肠杆菌中的表达
将pGEX-20T-preSl质粒转化E. coli ER2566菌株，从平板上糸(l取 单菌落接种到2ml的LB (含Ap抗生素)液体培养基中，37'C振荡培 养过夜。取200ul过夜培养液接种于2ffil LB液体培养基，37C振荡培 养2小时，至OD固0.6左右。加入IPTG终浓度达0. 5mM， 28C或37 'C诱导培养4小时。取lml菌液，离心收集菌体，扣干。用60ul水悬 浮菌体，加入30ul 3xSDS-PAGE凝胶加样緩沖液，沸水浴5分钟。 12000g离心IO分钟。取5ul菌体裂解液上清上样，用12% SDS-PAGE 电泳分析。由图1可知工程菌的全菌裂解物可观察到一条明显的诱导 蛋白带，表达蛋白约为菌体总蛋白的10%，实际分子量大小与理论预 期值39kD近似，重组蛋白主要以可溶性形式存在。
可溶性抗原的纯化
挑单菌落接种于25ml LB(含Ap抗生素)，37C振荡培养过夜。将 250ml菌液按l: 4扩种，至1000ml。 37^C振荡培养，至0D6。。 1. 0左 右。使菌液冷却，加IPTG至终浓度为0.2fflM， 28匸，诱导4小时。收 休菌体，10000g离心4分钟。PBS洗涤后，再以适量PBS将菌体 悬浮。水水浴，超声破碎。超声条件如下输出控制-7，占空因数-70。/n， 工作时间-35sec。重复7-9次，每次间隔5分钟。收集上清并过柱纯 化。轻摇介质瓶，4吏介质Glutathione-Sepharose 4B混匀，吸取1. 33ml 体积介质匀浆(介质比为75%,即1. 33ml体积介质浆中含lml介质) 上柱。轻敲柱子除去气泡，让柱子自然流干。用10ml 4C预冷的BVS 平衡柱。堵住下样口，上样。室温下孵育30分钟，其间应不断轻摇柱 子，以达以良好的结合效果。打开下样口，让穿透峰自然流下，让柱 子流干。用10ml4X:预冷的1 xPBS洗柱，重复3次。堵信下样口，加 入lml的谷胱甘肽洗脱緩冲液，室温下孵育30分钟，其间应不断轻摇 柱子，以达到良好的洗脱效果。打开下样口，用1. 5ml的离心管收集 样品。重复洗脱多次，直到用力摇样品时观察不到气泡时为止。SDS-PAGE结果显示(图1)纯化后的重组抗原的纯度在85°/。以上。
实施例2:杂交瘤细胞系4D11的产生 小鼠免疫及脾细胞与杂交瘤的融合
纯化的Dane颗粒静脉免疫6=8周龄雌性BALB/c小鼠，2w后用50ug 重组抗原GST-preSl与CFA混合后肌肉注射免疫小鼠。30天后，尾静 脉加强注射5 p g不加佐剂的抗原，之后72小时取眼球血检测效价。 杀死小鼠，收集血液，取脾制备脾细胞悬液(悬于预冷的RPMI 1640 培养基中)，细胞计数板细胞计数。按1/6于脾细胞的数量取培养的 SP2/0小鼠骨髄瘤细胞，混合后离心，利用聚乙二醇(PEG 1500 )使 脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。将细胞悬液与等体积的铜养细 胞混合后，分置于96孔细胞培养板中(200jLi 1/孔)于5%二氧化碳 培养箱(ESPEC BNA-311) 37C培养。3天后，用HT培养基(黄嘌呤 (hypoxanthn， H) 1. 361mg +胸腺嘧咬核苷(thymidine, T) 0.388mg， 加RPMI1640 (GIBC0公司)培养基至100mL。 45 ~ SOC条件下溶解后， 过滤除菌。)半保留换液。7天后，用2147合成肽包被板，利用如下 述酶联免疫吸附法(ELISA)检测96孔细胞培养板中所得杂交瘤细胞 上清培养液。对于ELISA检测为阳性的细胞克隆，利用有限稀释法进 行克隆化。
ELISA检测法
21-47合成肽溶解于0. 05mol/L碳酸包被緩冲液(20. 02g Na2C03， 2. 52gNaHC03加去离子水至l升，pH为9. 5 )中，浓度约为3pg/ml， 在96孔聚乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附2小时(37匸)，再置于 4'C过夜。用PBST洗涤液(8. 0g NaCl、 0. 2g KH2P04、 2. 9g Na風"2眼 0. 2gKCl和0. 5ml吐温20，加去离子水至l升，pH为7.4)洗涤滴定 板以除去未结合的抗原蛋白。然后用200jal/孔的封闭液(lxPBS溶 液，组成同前)中加入2%明胶、0.2%酪蛋白和2%蔗糖)37C封闭2 小时。甩净、拍干后真空封闭，4C保存。检测时，于每孔中加入100 p 1细胞培养液上清；每块96孔微量 滴定板设一阳性对照，加入100ju 1小鼠抗GST-preSl多抗血清(1: 100 稀释使用)；另设一阴性对照，加入100jLi 1 ht细胞培养液。37。C温浴 30分钟，用PBST洗涤液洗5遍，拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗 鼠免疫球蛋白(HRP-GAMIg， DAKO公司)，37t:温浴30分钟，取出后 用pbst洗涤液洗5遍，拍干后先后加入底物液a、 b各50 m 1 (底物 液A成分为13. 42g Na2HP04 12H20、 4. 2g柠檬酸 H20和0. 3g过氧 化氢，用去离子水中调节体积为700ml;显色液B成分为0. 2g四曱 基联苯胺、20ml 二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为700ml)， 37 。C显色10分钟，加入50jul终止液(2MH2S04)终止反应，并于酶标 仪上检测各孔的OD450值，通常以OD450值高于阴性对照2倍以上者 视为阳性。
单克隆抗体腹水的获得及纯化
取10周龄的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐剂，每只 0. 5ml。 2-7天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清，加入不含 血清的培养基，调节细胞密度至2xl05 - 2xl(^个/ml，每只小鼠注 射O. 5ral。 7-10天后小鼠腹部增大，开始收集腹水。3000rpm离心15 分钟，吸取中间澄清部分的液体，0. 45|um的微孔滤膜过滤除菌，分
装后-2ox:保存。
将处理好的腹水用0. 02mol/L、 pH7. 4的PBS ( 81ml 0. 2mol/L Na2HP04， 19ffll 0. 2mol/L NaH氛加生理盐水至100ml)对倍稀释， 搅拌下逐滴緩慢加入硫酸铵(浓度达到50°/。饱和度)，4X:过夜。4T， 12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS 中。搅拌下逐滴緩慢加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到33%饱和度，4匸 静置过夜。4'C， 12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水 体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴緩慢加入硫酸铵，(浓度达到50°/。饱和 度)，4'C过夜。4匸，12000rpm离心15分钟，弃上清。将沉淀溶于适 量的PBS中，装入透析带中，放入50-100倍含Mmmol/LNaCl， pH 7. 8的120mmol/L Tris-HCl緩冲液中4C搅拌下脱盐12小时左右，期间 更换3次以上透析液。取出后分装-2ox:保存。
以上述方法，筛选出了 7林分泌抗HBV preSl (21-47)单克隆抗体 的杂交瘤细胞林(3H5、 1G5、 6F1、 7B6、 2A6、 7H11、 4D11)。
实施例3、 ELISA检测4D11单抗与HBV天然抗原的结合能力
按10Vge/孔包被Dane颗粒(含少量的管状颗粒和管状颗粒，被 作为HBV天然抗原使用)，37^C温育2小时后4t:过夜。PBST洗板一次， 封闭液37'C封闭2小时。加稀释后的纯化单克隆抗体，所有样品均为 双孔重复)O. lml于上述已包被之反应孔中，置37。C孵育30分钟，PBST 洗涤5次。于反应孔中加入羊抗鼠酶标抗体0. lml。 37'C孵育30分钟， PBST洗涤5次。加底物液显色15分钟后终止反应，并于酶标仪上检 测各孔的OD450值。结果(图2 )显示，所有7种preSl单抗均可以 识别HBV天然抗原。作为阴性对照，戊型肝炎病毒(HEV)的单抗E1、 E2不能识别病毒天然抗原。相同浓度下(20ug/ml) 口种preSl单抗 中，4D11与HBV天然抗原的结合能力最强。
实施例4、4D11单克隆抗体轻链基因和重链基因可变区的分离
半贴壁培养107个4D11鼠源杂交瘤细胞，吹管吹起贴壁细胞使悬 浮，转移到新的4ml离心管中，1500rpm离心3min,收集沉淀的细胞， 重悬于100 jil无菌PBS (pH7.45)中，转移到一新的1.5ml离心管 中。力口入800 pl Trizol (Roche, Germany),轻轻颠倒混匀，静置 10min。加入200 p 1氯仿，剧烈振荡15s ，静置10min， 4 X: 12000rpm 离心15min，转移上层液体至一新的1. 5ml离心管中，加入等体积的 异丙醇，混勻，静置10min。
4 1C 12000rpm离心10min，弃上清， 加入600ial 75%乙醇洗涤，4 X: 12000rpm离心5min，弃上清，沉 淀于60。C真空抽干5min。透明的沉淀溶于70 jli 1 DEPC H20中，分装 成两管，每管35jil。其中l管加入各0.5jal反转录引物MFdRl(5' -ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3， )/ MFdR2 ( 5， —ACT AGT CTTGGG TAT TCT AGG CTC-3，)，另 一管加入各0. 5 p 1反转录引物MKCR1 (5， -TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGA A-3， ) /MVkR(5， -CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA-3，)。每管再加入1 ju 1 dNTP (上 海生工)，置72C水浴lOmin，立即放到冰浴中置5min，加入10yl 5x反转录緩沖液，1 jLi 1 AMV (10u/ ja 1， Pormega) ， 1 p 1 Rnasin (40u/ M 1 ， Promega)，混匀后于42将RNA反转录成重链Fd和轻链的cDNA。
抗体基因分离聚合酶链式反应(PCR)法，使用Novagen公司的 Ig-Prime kits以及另外设计合成的5条上游轻链可变区引物和5条 下游轻重链引物(上海博亚公司合成)，模板即为以上合成的4D11 重 链Fd和轻链的cDNA。
轻链可变区基因的分离使用K轻链的MuIgkVJ， -A至G的7组上 游引物和另设计合成的5条上游引物，即VkFl (5'-CCA CCA Tgg AgA CAg ACA CAC-30/VkF2 (5'-TTT TCA AgT gCA gAT TTT CAg-30 / VkF3 (5'-ATg gAg (A/T)CA CA(g/T) (A/T)CT CAg gTC -3')/ VkF4 (5'-TCC ACC ATg (g/T)CC CC(A/T) (A/g)CT CAg-3') / VkF5 (5'-ACC ATg AAg TTg CCT gTT Agg-3'),下游引物为MVJkR( 5， -CCg TTT (T/g) AT (T/C) TC CAgCTTggT (g/C)CC-3，)。分别使用这些上游引物和MVJkR组成引物 对，以4D11轻链cDNA为模板进行PCR扩增。PCR条件为94'C 5min, 94。C 30s 52X: lmin 721C 40s 35循环，72匸15min。结果有5条 上游引物与MVJkR组合能扩增出与预期大小一致的片段，分别回收并 克隆至pMD18-T载体，送至上海博亚公司测序，序列经blast比对后 确定由MulgkVj' -G2 (5， -CGACATGGT (C/T)CT (C/T) AT (A/C/G)TC CTT GCT GTT CTG G-3， ) / MVJkR及VkF5/MVJkR两对引物都能扩增出 4D11轻链可变区序列，(见SEQ ID NO: 4)，其推测的氨基酸序列见 SEQ ID NO:2。
重链可变区基因的分离使用IgG的MuIgGVH5， -A至F的6组上游 引物，下游引物为MVDJhR (5， -C ggT gAC Cg (T/A) ggT (C/g/T)CCTTg (g/A)CCCCA-3，)，模板为4D11 重链Fd的cDM，进行梯度PCR扩增。 PCR扩增条件为94X: 5min， 94T 30s 40s 72"C 40s，35个循环，72°C 15min。结果有5条上游引物与MVDJhR组合可扩增出约400bp 条带，分别回收并克隆至pMD18-T栽体，送至上海博亚公司测序，序 列经blast比对后确定MuIgGVH5， —C2 ( 5， —CGA C—AT GG (A/C/G) TTG G (C/G) T GTG G-A (A/C) CTT GC (C/T) ATT CCT-3， ) / MVDJhR、 MuIgGVH5，
厶V j —wua i/ii uvj va/^/u乂 iibvj 、1/ i \jivj vjA 、a/ l乂 111 uv / 、1/丄乂
ATTCCT-3， )/MVDJhR引物对可扩增出4D11重链可变区序列(见SEQ ID NO: 3)，其推测的氨基酸序列见SEQ ID NO: 1。
实施例5、 4D11单链抗体的克隆、表达、纯化及活性测定
将4D11抗体基因的重链和轻链可变区通过(GGGGS) 3短肽连接成 单链抗体DNA片段。以4D11HF1 (5'- ggA TCC CAG ATT CAG CTG CAG CAG TC-3， ) /4DllHRl(5'-gCT ACC ACC CCC TCC AgA TCC gCC ACC TCC AgA AgA TTC CgT gAC CgA g-3，)为引物对扩增出4D11重链基因可 变区片段，以4D11KF1 (5'—A TCT ggA ggg ggT ggT AgC ggT ggA ggC ggg AgT gAT gTT gTg ATg ACC C-3， ) /4D11KR1 ( 5'-gTC gAC CCgTTT gAT TTC CAg CTT gg-3，)引物对扩增出4D11轻链基因可变区片段。 分别回收两个片段，再以这两个片段互为引物及模板在新的PCR系统 中进行重叠延伸，得到少量完整单链抗体片段，然后以完整片段为模 板，以4D11HF1/4D11KR1为引物进行大量扩增，回收单链抗体片段， 克隆至pMD 18-T载体中。再从得到的质粒中以BamH I/Sal I酶切回 收到单链抗体片段，克隆到相同酶切的pT0-T7原核表达载体中。将得 到的重组质粒pT0-T7-4D11转化ER2566大肠杆菌菌林，糸t单菌落于 500ml LB(含KanlOOug/ml )培养基中,37T振荡培养过夜，菌液0D600 值达0. 8左右，0. 2mmol/L的IPTG诱导，30C表达6hr后收获菌体， 超声破碎，15000rpm离心10min，沉淀溶于与上清等体积的20mmol/L Tris-HC1 (pH7. 6)中，取等量上清和沉淀溶液进行SDS-PAGE电泳。堆 积胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。发现表达蛋白质达菌体总蛋白量 的15°/。左右，主要以不溶性的包涵体形式存在。超声沉淀用2%Triton 洗涂两次后，分别用2M、 4M、 8M尿素溶解，各部分溶解液经12%SDS-PAGE电泳，发现单链抗体主要溶解于8M尿素中(图3 )。将溶解 于詣尿素中的单链抗体蛋白用8M尿素稀释至50-100ng/ml，逐步对 lx PBS透冲斤复性，之后再浓缩6倍，12000rpm离心10分钟去除沉淀， 将最终得到的单链抗体溶液用间接ELISA法进行活性测定。包被的抗 原为preSl的21-47合成肽，单链抗体初纯品经倍比梯度稀释后，各 取100ul至孔中，反应l小时后洗涤，再加入l: 2000稀释HRP标记 的羊抗Histag酶标抗体，反应30分钟后显色15分钟，读板。结果初 纯品原液的OD值为3.210，稀释8倍后为0. 687 (表1)。表明表达的 4D11单链抗体有很好的特异性结合抗原的活性。
表l.间接ELISA检测4D11 scFv的抗原结合活性
OD42。1: 11: 21: 41: 8
4D11 scFv3. 212. 5021. 3720. 687
PBS0. 038
将4D11 scFv初纯品进一步经His柱纯化，以提高纯度进行亲和 力常数测定。His柱用去离子水洗三遍，然后用lx抽提Buffer(pH7, 0 PBS)洗一遍。悬浮Talon树脂，吸lml到柱子里，除掉乙醇，用20ml 的PBS分两次平衡柱子。除掉PBS，加入2. 5ml复性好的化ll - scFv (0. 283mg/ml)和2ml PBS，混匀，置4C2h。收集穿透峰，然后用 PBS洗3遍，每次2分钟。加lx洗涤Buffer (PBS，含SmM咪唑，pH 7.0) 1.2ml到柱子，混匀，静置5min，收集洗涤液，重复此步骤三 遍，均收集洗脱液。加lx洗脱Buffer ( PBS，含150 mM咪唑，pH 7. 0 ) 1.2ml到柱子，混匀，静置5min，收集洗脱液，重复此步骤三遍，均 收集洗脱液。加5mlMES再生。对所收集的溶液进行SDS-PAGE电泳， 银染结果(图4 )可知4D11 scFv经His柱纯化后的纯度达到95°/。以上，对纯化过程中的各部分收集液进行间接ELISA检测，结果见表2，发 现第一次和第二次洗脱液的活性较高，0D楊分别为1. 403和1.008。
表2.间接ELISA ^^-测His柱纯化过程中各部分收集液的活性
一次一次洗二次洗三次洗洗脱液对
原液穿透峰再生
洗涤脱脱脱照
OD42。3. 2750. 1090. 0331. 4031. 0080. 1830. 0550. 044序列表
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<170> Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial
<400> 1
Gin lie Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
Tyr lie
Glu Trp lie
Gly Trp lie 50
Phe Pro Gly Ser Gly Asn lie Lys Tyr Asn 55 60
Glu Asn Phe
Lys Gly Lys 65
Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn 70 75
Thr Ala Tyr 80
Met Gln Leu
Tyr Phe Cys 95
Thr Arg Pro
Ala Asn Met lie Thr Thr Leu Ala Tyr Trp
Gly Gln Gly100 105 110
Thr Ser Val Thr Glu Ser Ser 115
〈210> <211> <212〉 <213>
2
113 PRT
artificial
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Thr 85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110<210〉 3
〈211〉 357
〈212〉 DNA
<213〉 genome
〈400〉 3
cagatccagc tgcagcagtc tcctgcaagg cttctggcta cctggacagg gacttgsgtg
atgcaactca gcagcctgac aatatgatta cgEicgct"tgc
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<211> 339
<212〉 DNA
〈213〉 genome
〈400〉 4
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权利要求
1.可特异性结合乙型肝炎病毒preS1的鼠单克隆抗体的可变区序列，其中1)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰保守性突变而获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰保守性突变而获得的保守性变异体。
2. —种由权利要求1所述的可变区序列中重链可变区部分或其保 守性变体，和/或轻链可变区部分的氨基酸序列或其保守性变异体组 装成的基因工程抗体，其仍保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力。
3. 权利要求2所述的基因工程抗体，其为包含权利要求1所述的 可变区序列中重链可变区氨基酸序列或其保守性变异体，和/或轻链可 变区氨基酸序列或其保守性变异体的单链抗体、嵌合单克隆抗体、改 形单克隆抗体、或其他人源化形式的单克隆抗体，或所述抗体的片段， 其仍保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力。
4. 一种包含至少一种选自权利要求2所述基因工程抗体或所述抗 体片段的融合蛋白，其仍保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力。
5. 权利要求4所述的融合蛋白，其为双特异抗体。
6. —种复合物，其包含选自至少一种权利要求2所述的基因工程 抗体或其保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力的片段，以及与之 相偶联的一种或多种治疗乙型肝炎的药物分子。
7. —种核酸分子，其编码权利要求1所述的可变区氨基酸序列之 重链可变区，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列或其简并性序 列；或者其编码权利要求1所述的可变区氨基酸序列之轻链可变区， 其具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列或其简并性序列。
8. —种包含权利要求7所述核酸分子的重组表达载体。
9. 一种经权利要求8所述重组表达栽体转化的宿主细胞，其能够 表达权利要求2所述的基因工程抗体或其保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力的片段。
10. 权利要求2所述的基因工程抗体或其保留特异结合乙型肝炎 病毒preSl的能力的片段用于制备诊断、预防和/或治疗乙型肝炎病 毒的药物的用途。
11. 一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求2所述的基 因工程抗体或其保留特异结合乙型肝炎病毒preSl的能力的片段或其 保守性变体，以及药学可接受的栽体和/或佐剂。
全文摘要
本发明涉及针对乙型肝炎病毒preS1的新鼠单克隆抗体可变区序列，包括重链和轻链可变区及其保守性变异体，编码该可变区氨基酸序列的核酸分子，包含该核酸分子的重组表达载体以及宿主细胞，由所述可变区序列组装成的基因工程抗体，包含该基因工程抗体的融合蛋白，由该基因工程抗体与一种或多种治疗乙型肝炎的药物分子偶联的复合物，该基因工程抗体用于制备诊断、预防和/或治疗乙型肝炎病毒的药物的用途，以及包含该基因工程抗体和药学可接受的载体和/或佐剂的药物组合物。
文档编号C12N15/13GK101538326SQ20081017860
公开日2009年9月23日 申请日期2003年10月23日 优先权日2003年10月23日
发明者夏宁邵, 军 张, 朱子恒, 李利峰, 罗文新, 颖 顾 申请人:厦门大学;北京万泰生物药业股份有限公司