专利名称：：一种筛选解除葡萄糖代谢阻遏的丁醇产生菌突变株的方法
技术领域：
：本发明涉及一种筛选解除葡萄糖代谢阻遏的丁醇产生菌突变株的方法。
背景技术：
：世界范围内石油等化石燃料供应的短缺，天然气和其他原料价格的上扬，以及对温室气体减排的要求，迫使人们转向制备可再生能源，关注生物燃料的发展前景。丁醇就是备受关注的生物燃料之一。丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，全球年需求量超过140万吨。丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当；含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低、安全性高，且能与汽油以任意比混合。丁醇可由化学合成法和发酵法生产。化学合成法的主要路线包括两条，一是以丙烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛为原料，经醇醛縮合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。发酵法则是以粮食为原料，经发酵获得丙酮、丁醇和乙醇(三者质量比3:6:1)，再经精馏后分别制得丙酮、丁醇和乙醇。发酵法生产丙酮丁醇是仅次于乙醇发酵的全球第二大发酵工业。随着石油价格的不断上涨，丙酮丁醇发酵重新获得人们的重视。发酵法生产丁醇过程中所使用的菌种是成功生产丁醇的关键因素。研究表明，当培养基中有葡萄糖存在时，丙酮丁醇梭菌将首先利用葡萄糖，当葡萄糖利用完毕后，再开始利用其他糖类如淀粉、乳糖和蔗糖等。正是这种"葡萄糖抑制效应"的存在，使丙酮丁醇梭菌中的淀粉酶受到抑制，当培养基中的葡萄糖消耗完以后，菌株才能利用淀粉酶来分解淀粉。目前，主要是以丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)为出发菌株，以淀粉为原料，利用发酵法生产丁醇。现已有多篇针对发酵工艺进行改进的专利，如果能对丁醇产生菌自身进行改造，解除葡萄糖抑制效应，使丁醇产生菌能更加有效地利用葡萄糖使之转化为丁醇，则能够进一步提高丁醇的产量。
发明内容本发明的目的是提供一种筛选丁醇产生菌突变株的方法。本发明所提供的筛选丁醇产生菌突变株的方法，包括以下步骤1)将丁醇产生菌进行化学诱变，得到突变株；2)将上述步骤1)获得的突变株培养于含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基中，挑取降解淀粉的单菌落转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养，得到丁醇产生菌突变株。上述方法还包括将所述丁醇产生菌突变株进行淀粉降解能力的筛选得到突变株，将突变株转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养的步骤。可将上述筛选得到的丁醇产生菌突变株再进行化学诱变，将经过诱变的丁醇产生菌突变株培养于含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基中，挑取降解淀粉3的单菌落转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养，得到丁醇产生菌突变株的步骤。上述过程至少重复一次。当然，上述丁醇产生菌突变株的筛选方法也可以只包括步骤1)和2)的过程。上述方法中，所述葡萄糖结构类似物具体可为2-脱氧葡萄糖。上述方法中，所述含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基的组成为2-脱氧葡萄糖2g/L、可溶性淀粉5g/L、硫酸镁0.02g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.Olg/L、氯化钠0.01g/L、乙酸铵2.2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、生物素2yg/L、维生素B工lmg/L、对氨基苯甲酸lmg/L、琼脂2g/L，其余为水；所述葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基的组成葡萄糖20-70g/L、硫酸镁0.02g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、乙酸铵2.2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、生物素2iig/L、维生素Bllmg/L、对氨基苯甲酸lmg/L，其余为水。所述化学诱变所使用的诱变剂为硫酸二乙酯，所述硫酸二乙酯的终浓度为0.2-1%，具体可为1%，所述诱变时间为10-40min，具体可为15min。上述方f去中，所述丁醇产生菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)或糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)等，具体可为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287。采用上述筛选方法获得的丁醇产生菌突变株也属于本发明的保护范围。丁醇产生菌突变株DG123,已于2008年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCN22825。本发明的另一个目的是提供一种制备丁醇的方法。本发明所提供的制备丁醇的方法，是培养按照上述任一所述的方法得到的丁醇产生菌突变株，得到丁醇。上述方法中，所述培养丁醇产生菌突变株的培养基的组成为KH2P040.75g/L、K2HP043H200.75g/L、MgS047H200.4g/L、MnS04*H200.01g/L、FeS047H200.01g/L、NaCl1.Og/L、酵母粉5.Og/L、(NH4)2S042.Og/L、葡萄糖70g/L，其余为水；所述培养的培养条件为36-38。C，静置发酵72-96小时。本发明以丁醇产生菌-丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287为出发菌株，采用上述方法筛选得到解除葡萄糖代谢阻遏的丁醇产生菌突变株DG123CGMCCN22825，该突变株可以利用培养基中的淀粉，解除了葡萄糖代谢阻遏，培养该丙酮丁醇梭菌突变株DG123CGMCCN22825，发酵液中丁醇的产量可达13.5g/L。本发明方法将现代常用于PCR技术的96孔板、酶标仪及96孔深孔板应用于菌种筛选中，使筛选过程简化，有效的提高了筛选效率、縮短了筛选周期，使传统的诱变选育工作中耗时费力的筛选方法得到了明显的改善。图1为丙酮丁醇梭菌突变株的筛选流程图4图2为丙酮丁醇梭菌突变株的ELISA检测结果具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1、丙酮丁醇梭菌突变株的获得丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.2287。(中国专利，申请号200810102673.2)。下述实施例中所涉及的培养基和试剂的组成如下RCM培养基的组成葡萄糖5.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、淀粉10.0g/L、氯化钠5.Og/L、醋酸钠3.Og/L，其余为水。pH6.8。115。C条件下灭菌20分钟。含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基(P2-l培养基)的组成2_脱氧葡萄糖2g/L、可溶性淀粉5g/L、硫酸镁0.02g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、乙酸铵2.2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、生物素2yg/L、维生素B1lmg/L、对氨基苯甲酸lmg/L、琼脂2g/L，其余为水。p朋.9。115。C条件下灭菌20分钟。葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基(P2-2培养基)的组成葡萄糖20_70g/L、硫酸镁0.02g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、乙酸铵2.2g/L、磷酸二氢钾O.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、生物素2iig/L、维生素Bilmg/L、对氨基苯甲酸lmg/L，其余为水。P朋.9。115。C条件下灭菌20分钟。淀粉溶液的组成将10g可溶性淀粉溶于1L水中得到。碘液先将2.6g碘化钾溶于水中，再加入1.3g碘，定容至lOOmL，得到碘液。pH7.0的磷酸盐缓冲液将5.29gKH2P04和13.94gK2HP04溶于1L水中，pH7.0。生理盐水0.75%质量百分含量的氯化钠溶液。丙酮丁醇梭菌突变株的筛选流程图如图1所示，具体的筛选方法如下1、诱变处理将丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287接种于RCM培养基中，37t:厌氧培养36h，此时菌体生长至对数生长中后期；取培养液离心，将菌体沉淀用生理盐水离心洗涤两次，最后一次取沉淀加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，再加入硫酸二乙酯(购于Sigma公司)，使硫酸二乙酯在混合液中的终浓度为lX，37tH秀变15min;加入质量百分含量为25%的硫代硫酸钠溶液终止反应。将反应液离心，菌体沉淀用RCM培养基洗涤两次，去除剩余的诱变剂，将诱变后的菌体接入RCM培养基中37t:厌氧培养2436h。2、挑选单菌落初筛取上述步骤1中经诱变处理并用RCM培养基厌氧培养后的菌体涂布于P2-l培养基平板上，37t:厌氧培养，48h后可见单菌落。用已灭菌的牙签将随机挑取的有明显淀粉降解圈的单菌落转接入装有lmLRCM培养基的96孔深孔板中，37t:厌氧培养。36h后，用排枪吸取0.lmL菌液转接入葡萄糖终浓度为30g/L的lmLP2-2培养基中，96孔深孔板37"C厌氧培养72h;剩余的菌液于4t:保存用于复筛。3、丙酮丁醇梭菌突变株解除葡萄糖代谢阻遏情况的检测将上述步骤2的96孔深孔板5000rpm/min离心10min，用排枪取上清液100yL至96孔板中，加入100iiL淀粉溶液，37t:反应2h，再加入10yL碘液。当溶液内有淀粉没有被淀粉酶分解时，加入碘液就会显蓝色；当加入碘液后溶液为无色时，说明该株菌是已解除葡萄糖代谢阻遏的突变株。在检测时也可借助酶标仪来辅助读值，将96孔板于550nm处检测吸光度，吸光度值越小说明剩余的淀粉越少、淀粉酶活性越高，即是目的突变株。实验设三次重复。其中，96株突变株的筛选效果如图2和表1所示。表l96株突变株的吸光度值测定结果12467891011123bcdfgh0.2800.2150.6352.9890.2083.3151.0830.2260.1361.7353.3062.9973.0581.6180.9510.3610.4573.1141.7510.2611.5090.9133.3062.1562.7992,6281.1762.8460.1872.7801.3190.3492,8650.1802.1212.5120.4960,6440.2022.9820,2410.3081.1402.0570.9091.1372,1421.9831.0421.8073.0980.3240.5470.4800.1770.7071.0432.9333.3462.3460.2670.7073.1460.7112.2450.2792.1280.9290.6951.8783.0960.3070.3170.7880.4432.3760.2720.2262,4080.8842.5231.1570.4700.3930.9710.8070.7490.1850.4350.3932,3250.3153.2282.4752.8263.1204、复筛从上述步骤2中4t:保存的菌液中吸取0.lmL经步骤3检测颜色较浅的孔中的突变株，接入装有lmLRCM培养基的96孔深孔板中，37。C厌氧培养36h，用排枪吸取0.lmL发酵液转接入葡萄糖终浓度为40g/L的lmLP2-2培养基中，96孔深孔板37。C厌氧培养48h;按上述步骤3的检测方法进行检测，挑选检测结果颜色较浅的突变株接入葡萄糖终浓度为40g/L的5mLP2-2培养基中，接种量为0.5mL，37。C厌氧培养48h，结束发酵。采用高效液相色谱法测定发酵液中丁醇的产量，具体的测定条件如下样品前处理方法将发酵液12000rpm/min离心lmin，取上清液，用滤径为0.22ym的滤膜过滤。色谱条件为Agilent1200液相色谱仪，示差检测器；BioRadAminexHPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15°C;上样量10y1;流动相为0.05慮112504，流速0.5ml/min;丁醇标准品购自Sigma公司(目录号4C006217);在如上色谱条件下标准品的保留时间为40.9分钟。采用上述筛选方法，使用一块96孔深孔板可同时检测96株突变株的去葡萄糖分解代谢物阻遏情况。对500株菌采用上述方法进行筛选，共获得三株解除葡萄糖分解代谢物阻遏的突变株，分别命名为DGD4、DGH3和DGG3，将DGD4、DGH3和DGG3分别接入葡萄糖终浓度为20g/L、40g/L和50g/L的P2-2培养基中，37t:厌氧培养72h，测定发酵液中丁醇的产量，实验设三次重复，结果如表2所示。表2去葡萄糖代谢阻遏的丙酮丁醇突变株的丁醇产量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2中，当P2-2培养基中葡萄糖的终浓度为50g/L时，丁醇产量基本没有变化，说明这三株菌可利用的初始葡萄糖浓度为40g/L。实施例2、丙酮丁醇梭菌突变株的获得选择由实施例1诱变丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.2287，(中国专利，申请号200810102673.2))得到的突变株丙酮丁醇梭菌DGG3为出发菌株继续进行诱变筛选。实验中所涉及的培养基和试剂的组成同实施例1。1、诱变处理与实施例1步骤1不同的是，使用的硫酸二乙酯在混合液中的终浓度为1%，诱变时间为30min。2、挑选单菌落初筛与实施例1步骤2不同的是，转接入P2-2培养基中，葡萄糖的终浓度为70g/L。3、丙酮丁醇梭菌突变株解除葡萄糖抑制的检测同实施例1步骤3。4、复筛与实施例1步骤4不同的是，P2-2培养基中，葡萄糖的终浓度为70g/L。采用高效液相色谱法测定发酵液中丁醇的产量，具体的测定条件同实施例1步骤4。对300株菌采用上述方法进行筛选，结果共获得2株解除葡萄糖代谢阻遏的突变株，分别命名为DG61和DG123，将DG61和DG123分别接入葡萄糖终浓度为70g/L的P2-2培养基中，37t:厌氧培养72h，测定发酵液中丁醇的产量，实验设三次重复，结果表明，突变株DG61丁醇的平均产量为9.5g/L，突变株DG123丁醇的平均产量为10.8g/L。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)DG123已于2008年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCN22825。实施例3、利用丙酮丁醇梭菌DG123CGMCC漁2825发酵生产丁醇将上述实施例2获得的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DG123CGMCC漁2825接种于RCM培养基中，37。C温箱中静置培养至对数期，作为发酵种子液。将上述获得的发酵种子液按照5%的体积百分含量接种到装有3LCGM培养基(CGM培养基的组成KH2P040.75g/L、K2HP043H200.75g/L、MgS047H200.4g/L、MnS04H200.01g/L、FeS047H200.01g/L、NaCl1.0g/L、酵母提取物5.Og/L、(NH4)2S042.Og/L、葡萄糖70g/L，其余为水。pH6.8)的7L发酵罐中进行发酵，发酵温度为37t:，静置发酵72小时。采用高效液相色谱法测定发酵液中丁醇的产量，具体的测定条件同实施例l，实验设三次重复，结果表明，发酵液中丁醇的平均产量达到13.5g/L。权利要求一种筛选丁醇产生菌突变株的方法，包括以下步骤1)将丁醇产生菌进行化学诱变，得到突变株；2)将上述步骤1)获得的突变株培养于含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基中，挑取降解淀粉的单菌落转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养，得到丁醇产生菌突变株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括将所述丁醇产生菌突变株进行淀粉降解能力的筛选得到突变株，将突变株转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法还包括将所述丁醇产生菌突变株进行化学诱变，将经过诱变的丁醇产生菌突变株培养于含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基中，挑取降解淀粉的单菌落转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养，得到丁醇产生菌突变株的步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述权利要求3的过程至少重复一次。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基的组成为2-脱氧葡萄糖2g/L、可溶性淀粉5g/L、硫酸镁0.02g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、乙酸铵2.2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、生物素2iig/L、维生素Bllmg/L、对氨基苯甲酸lmg/L、琼脂2g/L，其余为水；所述葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基的组成葡萄糖20-70g/L、硫酸镁0.02g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、乙酸铵2.2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、生物素2iig/L、维生素Bllmg/L、对氨基苯甲酸lmg/L，其余为水。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述化学诱变所使用的诱变剂为硫酸二乙酯，所述硫酸二乙酯的终浓度为0.2-1%，优选为1%，所述诱变时间为10-40min，优选为15min。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述丁醇产生菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)或糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)，优选为丙酮丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287。8.—种制备丁醇的方法，是培养按照权利要求1-7中任一所述的方法得到的丁醇产生菌突变株，得到丁醇。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述培养丁醇产生菌突变株的培养基的组成为KH2P040.75g/L、K2HP043H200.75g/L、MgS047H200.4g/L、MnS04H200.01g/L、FeS047H200.01g/L、NaCl1.Og/L、酵母提取物5.Og/L、(NH4)2S042.Og/L、葡萄糖70g/L，其余为水；所述培养的培养条件为36-3『C，静置发酵72-96小时。10.丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DG123,其保藏号为CGMCCN22825。全文摘要本发明公开了一种筛选丁醇产生菌突变株的方法。该方法包括以下步骤1)将丁醇产生菌进行化学诱变，得到突变株；2)将上述步骤1)获得的突变株培养于含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基中，挑取降解淀粉的单菌落转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养，得到丁醇产生菌突变株。本发明以丁醇产生菌-丙酮丁醇梭菌SMB1CGMCCNo.2287为出发菌株，采用上述方法筛选得到解除葡萄糖代谢阻遏的丁醇产生菌突变株DG123CGMCCNo2825，该突变株可以利用培养基中的淀粉，解除了葡萄糖代谢阻遏，培养该丙酮丁醇梭菌突变株DG123CGMCCNo2825，发酵液中丁醇的产量可达13.5g/L。文档编号C12N15/01GK101768587SQ200810240858公开日2010年7月7日申请日期2008年12月26日优先权日2008年12月26日发明者张天瑞,张延平,李寅申请人:中国科学院微生物研究所