异源代谢途径生产苯酚的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，更确切的说，本发明设及异源生物合成苯酪的代谢途 径，通过增强碳通量，选用苯丙氨酸高产菌株的衍生菌作为宿主细胞，最终提高了苯酪的产 量，实现苯酪的清洁生产。
【背景技术】
[0002] 苯酪又称石炭酸，是一种重要的苯系中间体，作为一种大宗化学品，具有广泛的应 用。它主要用作聚碳酸醋、环氧树脂和酪醒树脂的合成前体。此外，还可用于合成除草剂和 药物。在2008年，全球生产的苯酪超过八百万吨。目前，生产苯酪的主要途径是W苯为原料， 用异丙苯法生产苯酪。此方法首先是将丙締与苯在Ξ氯化侣的催化作用下生成异丙苯，接 着异丙苯被氧化生成过氧化异丙苯，之后再用硫酸分解，就可W得到苯酪，此方法具有不可 再生性，而且对环境污染较严重。随着人们对石油危机和环境污染问题的关注，人们越来越 重视开发新的可持续生产工艺，用于生产苯酪和其他化学衍生产品。代谢工程是一种很有 前途的替代品，并已实现了许多W可再生资源为原料的各种化学品的生物生产。
[0003] 目前，已经有几个研究小组报道过苯酪的生产途径，J.Wen^等人在恶臭假单胞菌 S12中构建了苯酪生物合成途径。通过导入一个外源的酪氨酸苯酪裂解酶(TTL)，可W实现 酪氨酸到苯酪的转化。为了增加苯酪合成路径中前体的供应，作者增强了莽草酸途径中3-deo巧-d-arabin〇-heptolosonate-7-phosphate(DAHP)合成酶的表达。在摇瓶培养中，最终 可W产生142mg/L的苯酪。同时作者又W正辛醇为萃取剂进行了双相培养，苯酪的产量进一 步提高到868mg/L"Kim等人将上述的途径构建在大肠杆菌中，为了提高酪氨酸的供应，用小 RNA下调了 csrA和tyrR的表达，摇瓶实验数据显示，工程菌可W从葡萄糖开始产419mg/L的 苯酪。同时ΚΞ下酸甘油醋作为萃取剂进行双相培养，苯酪的产量可W提高到3.79g/L。最 近，L.Miao等人通过引入4-径基苯甲酸脱簇酶，在大肠杆菌中构建了一种新的苯酪生产途 径。4-径基苯甲酸是大肠杆菌中的天然代谢产物，是丙酬酸裂解酶(ubiC)催化分支酸的产 物。作者将途径中的基因整合到染色体中，获得基因稳定的菌株。通过调苄基因的表达水 平，摇瓶培养苯酪的产量可W达到250mg/L。接着利用五种不同的溶剂进行双相萃取发酵， 研究表明邻苯二甲酸二下醋是提高苯酪产量的最好萃取剂。在化发酵罐中进行发酵，苯酪 的产量可W达到9.51 g/L。
[0004] 本实验中，我们通过连接水杨酸合成路径和脱簇路径设计了一个新的苯酪生物合 成途径。通过对路径和菌株的优化，最终摇瓶实验生产苯酪达到472.13mg/L。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供了生产苯酪的微生物，通过向微生物中导入Ξ种不同功能的 基因，构建异源生物合成苯酪的新路径。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述产苯酪的微生物的发酵生产方法。
[0007] 本发明的又一目的是通过增强路径中的碳通量，导入相应的质粒，实现微生物高 产苯酪。
[0008] 本发明的再一目的是选用一株苯丙氨酸高产菌株的衍生菌，进一步提高微生物生 产苯酪的方法。
[0009] 异源代谢途径生产苯酪的方法，其特征在于:所述方法包括分支酸到水杨酸的生 物合成W及水杨酸到苯酪的生物合成，其中，所述分支酸到水杨酸的生物合成路径中设及 到异分支酸合成酶和异分支酸丙酬酸裂解酶，即分支酸在异分支酸合成酶的催化作用下生 成异分支酸，之后异分支酸在异分支酸丙酬酸裂解酶的催化作用下生成水杨酸;在其中所 述水杨酸到苯酪的生物合成路径设及到水杨酸脱簇酶，即水杨酸在水杨酸脱簇酶的作用下 生成苯酪。
[0010] 能够完成分支酸到水杨酸的生物合成路径的微生物基因表达元件为下述1)或2) 中的一种：
[0011] 1 )由Lac启动子、氨节青霉素抗性、编码异分支酸合成酶（isochorismate syn1:hase)的基因 entC和编码异分支酸丙酬酸裂解酶（isochorismate pyruvate lyase)的 基因 pchB组成的100-150个拷贝数的质粒；
[001引2 )由Lac启动子、卡那青霉素抗性、编码异分支酸合成酶（isochorismate syn1:hase)的基因 entC和编码异分支酸丙酬酸裂解酶（isochorismate pyruvate lyase)的 基因 pchB组成的30-50个拷贝数的质粒。
[0013] 能够完成水杨酸到苯酪的生物合成路径的微生物的基因表达元件为下述1)或2) 中的一种：
[0014] 1 )由Lac启动子、氨节青霉素抗性、编码水杨酸脱簇酶（salicylate decarboxylase)的基因4口抓〔组成的100-150个拷贝数的质粒；
[001引2)由Lac启动子、卡那青霉素抗性、编码水杨酸脱簇酶（salicylate decarboxylase)的基因4口抓〔组成的30-50个拷贝数的质粒。
[0016] 苯酪生产途径的宿主微生物选自于大肠杆菌BW25113JM109或地4。在大肠杆菌中 导入了质粒pCS-APTA，该质粒上含有包括莽草酸途径中四个关键的基因：aroL，ppsA，tktA 和aroGfbr。
[0017] 通过选用一株高产苯丙氨酸的菌株ATCC31884,敲除地eA和tyrA基因的卵4作为宿 主菌进行发酵实验。
[0018] 菌株地4作为宿主菌进行发酵实验，在M9Y培养基中培养产苯酪微生物，试管摇菌 过夜，选用1 %-2 %的体积接种量，加入IPTG诱导，保证IPTG在体系里的终浓度为0.5mM，表 达蛋白，选用30°C或37°C诱导溫度，诱导时间为48小时。
[0019] 本发明还提供了微生物产苯酪的方法：第一种是体外添加水杨酸，向大肠杆菌 BW25113中导入质粒pZE-kp抓C。将单菌落接种于3ml LB培养基中，内含有10化g/ml的氨节 青霉，37°C过夜培养。将过夜培养的菌液接种到含氨节青霉素的50ml的M9Y培养基中。菌体 在37°C的摇床中培养至0D600值为0.6时，加入0.25mM的IPTG进行诱导。之后分别在诱导后8 小时，16小时，24小时和36小时的时候添加水杨酸(最终浓度为400mg/L)。从发酵液中取样， 利用高效液相色谱对产物的浓度进行了分析;第二种是苯酪的从头合成，将产苯酪的菌株 过夜培养之后，转接到含有抗生素的M9Y培养基中，37°C摇床摇3个小时后，向培养基中添加 0.25mM的IPTG，30°C或37°C的条件下培养4她。诱导后每隔1化取样测0D，高效液相色谱测苯 酪和水杨酸的浓度。
[0020] 本发明还提供了微生物高产苯酪的方法，具体有W下几种:第一是增加通路中的 碳源，在菌株BP1中导入质粒pCS-APTA.。质粒pCS-APTA包括莽草酸途径中四个关键的基因 (aroL，ppsA，tktA和aroG扎r)。对菌株进行摇瓶实验，苯酪的产量提高了将近一倍。第二是 利用大肠杆菌卵4,即把菌株ATCC31884的基因曲eA和tyrA进行了敲除，用于苯酪的生产，菌 株QH4已被成功地用于来自莽草酸途径中各种有价值的化合物的生产，如咖啡酸、粘慷酸。 对导入不同模块的菌株进行摇瓶实验，最好的菌株对应的苯酪产量能够达到405.63± 13.72mg/L。第Ξ是发酵条件的优化，将试管摇菌时间控制在12hrs，转接到摇瓶的接种量为 2%，菌体在37°C的摇床中培养至0D600值为0.6时，加入0.25mM的IPTG进行30°C诱导，苯酪 的产量提高到472.13 ± 19.81mg/L。
[0021] 如上文所述，本发明设及苯酪的有效生产方法，所述方法的特征在于:通过增强通 路中的碳源，向高产苯丙氨酸的衍生菌中导入异源生物合成苯酪的路径，菌株在30°C的培 养条件下，在培养基中生长并达到生产苯酪的目的。
【附图说明】
[0022] 图1苯酪生物合成的新路径
[0023] 图2导入质粒pZE-lq)BDC的重组大肠杆菌生物转化水杨酸到苯酪的发酵结果
[0024] 图3不同组合的质粒导入大肠杆菌菌株BW25113(A)和QH4(B)后发酵结果
[0025] 图4对高产苯酪的菌株进行发酵条件的优化
[0026] 图5 QP2菌株在最优的发酵条件下发酵结果
【具体实施方式】
[0027] 具体实施例1
[0028] 微生物异源合成苯酪代谢途径的构建
[0029] 许多细菌可W自然合成芳香族化合物。合成芳香族氨基酸的途径，被称为莽草酸 途径。在莽草酸途径中，葡萄糖经中屯、代谢途径合成憐酸締醇式丙酬酸(PEP)和赤薛糖4-憐 酸巧4P)。运两种化合物在酶催化下形成3-脱氧-D-阿拉伯糖基-7-憐酸化ΑΗΡ)，在经过几步 反应后形成分支酸。从分支酸开始，该途径分成几条支路，W形成多种芳香族化合物，包括 苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，叶酸等。到目前为止，莽草酸途径已被用于合成多种芳香族化合 物，其中一些已经商业化。莽草酸途径的7种酶最初是通过对细菌的研究而被发现，主要是 大肠杆菌和鼠伤寒沙口氏菌。虽然在原核和真核生物中，运些酶的底物和产物，也就是莽草 酸途径的中间体是相同的，但是有时候原核和真核生物在酶的一级结构和性质上却存在很 大差异。分支酸是莽草酸途径的最终产物，也是Ξ种芳香族氨基酸W及很多植物次级代谢 产物合成的前体。莽草酸途径中的中间代谢物也可W作为次级代谢产物合成的起始点。很 明显，莽草酸途径对于许多具有商业价值的化合物的生物合成至关重要。
[0030] 水杨酸是一种广泛存在的芳香代谢物，在植物中作为一种激素，在细菌中是铁载 体合成的中间产物。水杨酸作为一种重要的天然化合物，具有多种生理功能和广泛的商业 用途。在我们W前的研究中，已经实现了大肠杆菌生物合成水杨酸。分支酸经过两步酶催反 应:异分支酸合成酶(来源于大肠杆菌，entC编码)和异分支酸丙酬酸裂解酶