(来源于巧光假 单胞菌pchB编码)生产水杨酸。通过对路径设计和菌株的优化，摇瓶实验水杨酸的产量达到 1180mg/L。运一路径进一步延伸可W用于生产4-径基香豆素和粘慷酸。在自然界中，水杨酸 脱簇酶(SDC)催化水杨酸脱簇生成苯酪和C〇2。测酶活的方法具体如下:大肠杆菌JM109用于 质粒祀T-kp抓C的转化。将过夜培养的大肠杆菌接种到50mL的LB中37°C培养。当0D600达到 0.6-0.8时，在培养基中加入0.25-0.5mM的诱导剂IPTG，之后30°C生长化。菌体离屯、后用800 yL的PBS缓冲液处理，细胞破碎时加入0.1mm的玻璃珠，蛋白质的纯化用是蛋白提取纯化试 剂盒（ZYMO Research)。蛋白浓度的测定采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（Pierce 化emicals).测定脱簇酶活性的反应体系如下：2化L的蛋白纯化液，底物水杨酸溶解在60-70mM Na2HP04-K肥P04(pH 5.0)的缓冲液中，总体积是ImL。反应在1.5-mL微型离屯、管中，30 °C反应4h.水杨酸的浓度变化从0到2.5mM。酶活的测定是通过利用高效液相色谱检测苯酪 的生成量来实现的，脱簇酶的动力学参数是通过米氏方程的非线性回归计算得到。尽管该 反应是可逆反应，但二氧化碳的生成有利于其向苯酪的生成方向进行。基于此，我们将水杨 酸的合成及脱簇连接设计了一个新的苯酪生物合成途径。
[0031 ] 具体实施例2
[0032] 导入异源代谢途径产苯酪的微生物
[0033] 分别提取大肠杆菌、巧光假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌的基因组，利用所设计引物， 如表2，从基因组上PCR获取目的基因，entC，pchB，kpBDC。接着用对应的酶对片段和载体进 行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒PZE12-1UC(高 拷贝）和质粒PCS27 (中拷贝）上，得到连接液备用。
[0034] 电转法感受态的制备:将大肠杆菌BW25113和QH4的单菌落分别接种至lj3mL的液体 LB培养基中，37°C，250巧m过夜培养。之后接种500化菌液到50mL的LB培养基中，37°C， 250rpm振荡培养至0D = 0.4-0.6。将菌液于4°C，5000rpm离屯、lOmin，弃掉上清，沉淀用3mL 10 %的甘油重悬混匀。接着将菌液于4°C，500化pm离屯、lOmin，弃掉上清，沉淀用3血10 %甘 油重悬混匀。之后将菌液于4°C，500化pm离屯、lOmin，用40化L 10 %的甘油重悬细胞，分装成 9化L的小管用于转化。
[003引取构建好的高拷贝质粒化L，中拷贝质粒化L加入到含有gOiiL感受态细胞的1.5mL 离屯、管中，混合均匀。接着将混合物转移到电转杯中。设置电压为1800V，将电转杯放入卡槽 中，按电击按钮一次。电击完成后，加入80化L LB培养基，并将混合物转移到1.5mL离屯、管 中，复苏45min。之后取2(Κ)化的菌液涂到含有氨节和卡那抗生素的平板上，37°C过夜培养。
[0036] 表1实验所用菌株和质粒
[0037]
[0039] 表2实验所用引物
[0040]
[0041 ]具体实施例3
[0042] 产苯酪微生物的发酵
[0043] 在大肠杆菌基因工程中的平板上挑取单菌落，接到3mL液体LB中，向培养基中加入 氨节和卡那抗生素，抗生素的终浓度都是l〇〇mg/L，37°C，250rpm振荡培养，之后将菌液转接 至lj50mL的液体M9Y培养基中，向培养基中加入氨节和卡那抗生素，抗生素的终浓度都是 lOOmg/L，振荡培养至0D 600达到0.6，向培养基中添加 IPTG，IPTG在培养基中的终浓度是 0.25mM，30°C诱导。诱导后每隔12虹S取样测0D，用高效液相色谱测定苯酪和水杨酸的浓度。
[0044] 发酵结果显示，将质粒pZE-EP-BDC导入大肠杆菌BW25113,定义菌株为BPIdBPI菌 株在培养4她后，只能产67.65 ± 1.65mg/L的苯酪，培养液中还有209.80 ± 1.42mg/L的水杨 酸剩余。为了增加通路中的碳源，向菌株BP1中导入质粒pCS-APTA,定义为BP2。质粒pCS-APTA中设及到莽草酸途径中四个关键的基因 （aroL，ppsA，tktA和aroG扎r)。对菌株BP2进行 摇瓶实验，苯酪的产量是132.78mg/L，提高了将近一倍，中间代谢产物水杨酸还存在积累。 为了解决水杨酸积累的问题，我们试图调节通路中基因的表达水平，将质粒pZE-BDC和质粒 pCS-APTA-EP导入大肠杆菌BW25113，定义菌株为BP3。摇瓶数据显示BP3菌株，能产8.63 ± 0.37mg/L的苯酪，水杨酸的积累达到359.57 ±2.43mg/L。第二个策略是将质粒pZE-EP-抓C 和质粒pCS-APTA-BDC导入到大肠杆菌BW25113,定义菌株为BP4。菌株BP4摇瓶发酵可W产 220.61 ± 8.97mg/L的苯酪，水杨酸的积累只有40.13 ± ο. 1 Img/L，运表明增加抓C的表达水 平能够有效促进水杨酸转化。
[004引具体实施例4
[0046] 利用BW25113的衍生菌进行苯酪的发酵生产
[0047] 我们利用大肠杆菌BW25113作为宿主细胞实现了苯酪的从头合成，为了提高产量， 我们把大肠杆菌ATCC 31884的pheA和tyrA基因进行了敲除，定义为地4。运菌株地4已被成 功地用于来自莽草酸途径中各种有价值的化合物的生产，如咖啡酸、粘慷酸。将质粒pZE-EP-BDC导入大肠杆菌地4菌株中，定义菌株为QP1，摇瓶发酵结果显示QP1菌产的苯酪较多， 只有微量的水杨酸积累。将质粒pZE-EP-BDC和质粒pCS-APTA导入大肠杆菌卵4菌株中，定义 菌株为QP2，QP巧日强了上游途径，能够产405.63 ± 13.72mg/L的苯酪，运是所有构建的菌株 中最好的。将质粒pZE-抓C和质粒pCS-APTA-EP导入大肠杆菌卵4菌株中，定义菌株为QP3，将 质粒pZE-EP-BDC和质粒pCS-APTA-EP导入大肠杆菌卵4菌株中，定义菌株为QP4，与BP3和BP4 相比较，菌株QP3和QP4产苯酪的量都有提高。
【主权项】
1. 异源代谢途径生产苯酚的方法，其特征在于:所述方法包括分支酸到水杨酸的生物 合成以及水杨酸到苯酚的生物合成，其中，所述分支酸到水杨酸的生物合成路径中涉及到 异分支酸合成酶和异分支酸丙酮酸裂解酶，即分支酸在异分支酸合成酶的催化作用下生成 异分支酸，之后异分支酸在异分支酸丙酮酸裂解酶的催化作用下生成水杨酸;在其中所述 水杨酸到苯酚的生物合成路径涉及到水杨酸脱羧酶，即水杨酸在水杨酸脱羧酶的作用下生 成苯酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:能够完成分支酸到水杨酸的生物合成路径 的微生物基因表达元件为下述1)或2)中的一种： 1) 由Lac启动子、氨节青霉素抗性、编码异分支酸合成酶（isochorismate synthase)的 基因 entC和编码异分支酸丙酮酸裂解酶（isochorismate pyruvate lyase)的基因 pchB组 成的100-150个拷贝数的质粒； 2) 由Lac启动子、卡那青霉素抗性、编码异分支酸合成酶（isochorismate synthase)的 基因 entC和编码异分支酸丙酮酸裂解酶（isochorismate pyruvate lyase)的基因 pchB组 成的30-50个拷贝数的质粒。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:能够完成水杨酸到苯酚的生物合成路径的 微生物的基因表达元件为下述1)或2)中的一种： 1) 由Lac启动子、氨节青霉素抗性、编码水杨酸脱羧酶(salicylate decarboxylase)的 基因 kpBDC组成的100-150个拷贝数的质粒； 2) 由Lac启动子、卡那青霉素抗性、编码水杨酸脱羧酶(salicylate decarboxylase)的 基因 kpBDC组成的30-50个拷贝数的质粒。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:苯酚生产途径的宿主微生物选自于大肠杆 菌BW25113、JM109或QH4。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:在大肠杆菌中导入了质粒pCS-APTA，该质 粒上含有包括莽草酸途径中四个关键的基因：aroL，ppsA，tkt A和aroGf br。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过选用一株高产苯丙氨酸的菌株 ATCC31884,敲除pheA和tyrA基因的QH4作为宿主菌进行发酵实验。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于:菌株QH4作为宿主菌进行发酵实验，在M9Y培 养基中培养产苯酚微生物，试管摇菌过夜，选用1%_2%的体积接种量，加入IPTG诱导，保证 IPTG在体系里的终浓度为0.5mM，表达蛋白，选用30°C或37°C诱导温度，诱导时间为48小时。
【专利摘要】异源代谢途径生产苯酚的方法及其应用属于生物合成苯酚领域。所述产苯酚的微生物中导入了生产苯酚的代谢途径。更确切的说，是在大肠杆菌中高效表达了异分支酸合成酶(isochorismate？synthase)，异分支酸-丙酮酸裂解酶(isochorismate？pyruvate？lyase)和水杨酸脱羧酶(salicylate？decarboxylase)。这些酶所编码的基因构建在带有Lac启动子，含有抗生素抗性的表达质粒上。将构建好的质粒导入大肠杆菌中，结果得到了可以利用葡萄糖生产苯酚的生产菌株，通过增加通路中的碳源，使本发明的苯酚生产方法更为有效，选用一株苯丙氨酸高产菌株的衍生菌作为宿主菌，更有利于苯酚的生产。
【IPC分类】C12R1/19, C12P7/22
【公开号】CN105506001
【申请号】CN201510813248
【发明人】袁其朋, 孙新晓, 任彦仙, 杨森
【申请人】北京化工大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月22日