专利名称：鉴定和使用在d-葡萄糖存在下代谢戊糖的酵母菌株的材料和方法
技术领域：
各个方面总体涉及在显著水平的D-葡萄糖存在下，可以在除D-葡萄糖以外的糖上生长的酵母(Saccharomyces)菌株，以及开发和使用这些菌株的方法。
背景技术：
酵母属的各个种是非常重要的工业培养的微生物。长期以来，这些微生物用于发酵面包、生产啤酒和葡萄酒，并作为食物调味剂和微量营养素来源，它们现在在燃料生产中起到核心作用，有利于将糖储备转化成乙醇。作为一种代谢复杂的生物体，酵母能够在有氧条件下生长，也能够在无氧条件下生长至少数代。商业培养时，例如在生产用于支持市售焙烤食品工业的酵母时，可以在通气的发酵罐中培养酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae).在这些条件下可控制酵母生长，以提高酵母生物质的生成。可实现这一目的的一种方式是安排糖如D-葡萄糖的加入，以及氧气转移至酵母的速率以促进其有氧生长。 也可以在设计用于最大程度提高乙醇产量的条件下培养各种酵母菌株。通常，相对于目的是最大程度提高酵母生物质生成以利于无氧生长时发酵容器中采用的氧气水平，当目的是最大程度提高糖向乙醇的转化时发酵容器中的氧气水平可降低。大部分酵母菌株优选在D-葡萄糖上生长，尽管已知许多菌株也能够在其它天然产生的己醣、甚至是一些二糖上生长。不同酵母属品种在不同糖和不同氧气水平下生长的能力很大程度上代表它的商业利用价值，包括酵母在当前的燃料工业中将植物生物质转化成乙醇中起到的核心作用。一种最熟知的用酵母生产乙醇的途径是将6碳糖(己醣)，特别是D-葡萄糖发酵成乙醇(
图1)。乙醇生产中广泛使用的一种原料是多糖淀粉。淀粉是包含D-葡萄糖的简单聚合物。目前在美国，至少来自玉米的淀粉是通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 生产乙醇的优选原料。玉米是富含营养的作物，目前只有玉米仁是适用于酵母乙醇发酵的淀粉/D-葡萄糖的合适来源。基于酵母的乙醇生产所用的另一糖源是甘蔗。天然条件下， 甘蔗的可发酵糖含量更高，可能是用酵母生产乙醇的优选底物。然而，与甘蔗相比，玉米在美国的种植更广泛。鉴于气候原因，这种状况很可能保持如此。无论如何，基于玉米的乙醇生产的可持续性已经受到质疑，由于甘蔗在美国并不是可行的选择，生物燃料工业正在寻找除玉米和甘蔗外可发酵原料的其它来源。—种倍受追捧的原料是纤维素，认为它的可持续性优于玉米，并且比甘蔗更容易获得。经加工产生可发酵糖的纤维素完全可以作为将来乙醇生产的碳源选择。培养酵母以提高酵母生物质或由原料如淀粉或纤维素产生乙醇时，需要预先发酵加工步骤将生物聚合物纤维素降解成易由酵母发酵的糖单位，如D-葡萄糖、麦芽糖、三糖和四糖。无论来源如何，六碳糖，特别是D-葡萄糖是基于酵母的发酵过程的主要能量来源。已鉴定的酵母属的大多数品种优选在D-葡萄糖上生长。其中许多菌株，包括许多实验室衍生的酵母菌株都可以在除D-葡萄糖以外的己糖以及二糖和三糖上生长。然而，酵母菌对于在D-葡萄糖上生长的优选性非常强，以至于酵母的大部分变异体，包括几乎所有的工业重要菌株，都表现出分解代谢物抑制作用，即只要原料中存在可检测水平的D-葡萄糖， 该菌株就不会发酵除D-葡萄糖以外的糖。对于由包含含有D-葡萄糖的可发酵糖混合物的任何原料生产酵母生物质和/或乙醇而言，所有检测的酵母菌株不能在D-葡萄糖存在下借助D-葡萄糖以外的糖快速生长并产生乙醇是非常不幸的。例如，将纤维素性生物质降解成其可发酵组分时释放D-葡萄糖，可发酵糖混合物中存在D-葡萄糖会显著减缓其它糖向乙醇的转化(图1)。尽管目前由纤维素产生乙醇有技术障碍，但2007年能源独立和安全法案(Energy Independence and Security Act, EISA 2007)要求美国要快速开发生产纤维素乙醇的技术，以替代进口的石油。因此，需要即使在显著量的D-葡萄糖存在时，也易于将糖、而不是仅将D-葡萄糖转化成生物质或乙醇的新型工业酵母菌株，以及产生这些工业菌株的方法。 本发明某些方面解决了这些需求。发明概述本发明某些方面包括分离酵母的方法，包括以下步骤提供生长培养基，其中该培养基包含2-脱氧-葡萄糖；木糖和谷胺酰胺，木糖是唯一的碳源；用至少一种酵母菌株接种该培养基；从所述培养基中分离至少一种酵母细胞；其中所述酵母细胞能够在约0. 1重量％ 2-脱氧-葡萄糖存在时，以D-木糖作为唯一碳源生长。在一些实施方式中，所述生长培养基包含约0.03重量％ 2-脱氧-葡萄糖。在一些实施方式中，在所述培养基上或之中生长的菌株只有在大约14天后才在所述培养基上表现出可检测的生长。在其它实施方式中，可能在接种约21天后才表现出可检测的生长。在一些实施方式中，用于选择酵母菌株的培养基包含约2.0重量％的木糖和约 0. 5重量％的谷胺酰胺，尽管这些试剂的任何浓度都足以支持可能加入生长培养基的特定菌株的生长。在一些实施方式中，分离的酵母菌株是酿酒酵母的单倍体、二倍体或大于二倍体的多倍体菌株。在一些实施方式中，由所述培养基分离的酵母菌株甚至在至少0. 1重量％的2-脱氧-葡萄糖存在时，也能够代谢至少一种戊糖。在一些实施方式中，所述原料包含至少约 0. 03重量％的2-脱氧-葡萄糖。在一些实施方式中，所述菌株在至少0. 1重量％的2-脱氧-葡萄糖存在时，能代谢至少一种除D-葡萄糖以外的己糖。在一些实施方式中，所述生长培养基包含约0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖。在一些实施方式中，所述菌株是自发突变体。但在其它实施方式中，所述菌株可通过特定事件产生，例如通过以已知引起突变的方式处理酵母来靶向破坏开放阅读框。加速突变速率的方法和试剂包括但不限于使酵母接触电离辐射、紫外线和影响DNA结构的试剂，例如嵌入剂、烷化剂、DNA加合物等。本发明的其它实施方式包括酵母变异体，包括在至少0. 1重量％ 2-脱氧-葡萄糖存在时，以至少一种戊糖作为唯一碳源生长的酿酒酵母菌株。在一些实施方式中，所述生长培养基中包含约0.03重量％ 2-脱氧-葡萄糖。在一些实施方式中，所述变异体是单倍体、二倍体或大于二倍体的多倍体。在一些实施方式中，酿酒酵母的变异株选自JH015、⑶)(R2 以及弗门狄斯乙醇红O^ermentis Ethanol Red)reglA和弗门狄斯乙醇红grrl_/_(GXl)寸。其它实施方式是发酵糖源的方法，包括以下步骤提供至少一种酿酒酵母菌株，其中在至少0. 2-脱氧-葡萄糖存在时，所述至少一种酿酒酵母菌株能够在至少一种戊糖上生长；提供包含至少一种糖的原料，和在所述原料上培养所述酵母菌株。在一些实施方式中，所述原料包含D-葡萄糖，其含量足以支持该酵母菌株在没有任何其它糖源的情况下生长。在其它实施方式中，所述原料包含可发酵的戊糖。在其它实施方式中，所述原料包含至少约0. 2-脱氧-葡萄糖。在一些实施方式中，所述原料包含至少约0. 03重量％的 2-脱氧-葡萄糖。在其它实施方式中，所述原料包含除D-葡萄糖外的可发酵己糖，而在其它实施方式中，所述原料还包含D-葡萄糖。其它方面包括产生酵母突变菌株的方法，包括以下步骤提供至少一个选自Grrl 和Regl的基因有活性的酵母菌株，例如酿酒酵母的单倍体、二倍体或多倍体菌株；去除 Grrl和Regl的活性以产生突变菌株；和测试该菌株以确定在0. 035重量％ 2-脱氧-葡萄糖存在时该菌株能否在戊糖上生长。其它实施方式包括选择或鉴定酵母菌株的方法，包括以下步骤提供在选自下组的至少一个开放阅读框中含有突变的酿酒酵母的单倍体或多倍体菌株ALR063W、YMR167W、 YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、YHR154w、YCL048w、 YLR133w、Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、YOUOIc, YML124C、YMR116C、YDR028c、 YDR074c、YDL088c和YGR271，其中所述开放阅读框编码功能性基因且所述开放阅读框中的突变会破坏该开放阅读框所编码基因的活性；在包含作为唯一碳源的木糖和约0. 1重量％ 2-脱氧-葡萄糖的培养基中培养所述酿酒酵母菌株；和分离在所述培养基中生长的酿酒酵母菌株。在一些实施方式中，所述生长培养基包含约0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖。其它实施方式包括分离酿酒酵母菌株的单倍体或多倍体菌株的方法，包括以下步骤提供一种菌株，其包含选自下组的开放阅读框编码的至少一种基因的功能性拷贝 YLR063w、YMR167w、YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、 YHR154w、YCL048w、YLR133w、Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、Y0L101C、YML124C、 YMR116C、YDR028c, YDR074c、YDL088c和YGR271w ；将突变引入选自下组的至少一个开放阅读框中YLR063w、YMR167w、YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、 YHR103w、YHR154w、YCL048w、YLR133w、Y0R138C、Y0R177C、YDR269c、YIL064w、YOLlOlc、 YML124C、YMRl 16C、YDR028C, YDR074C、YDL088c 和 YGR271w，以产生酿酒酵母突变体；在选择培养基上培养所述酿酒酵母的突变体，其中所述选择培养基包含作为唯一碳源的木糖和 0. 1重量％ 2-脱氧-葡萄糖；和分离在所述培养基上生长的突变体。在一些实施方式中， 所述生长培养基包含约0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖。本发明的一些实施方式包括选择酵母菌株的方法，所述酵母菌株包括例如在 2-脱氧-葡萄糖存在时和D-葡萄糖存在时，在除D-葡萄糖以外的糖上生长的工业或实验室酵母菌株，所述除D-葡萄糖以外的糖包括例如，在纤维素生物质中发现的一些戊糖。另外一些实施方式包括使用在2-脱氧-葡萄糖存在时能在除D-葡萄糖以外的糖上生长的工业酵母菌株，以便在显著量的D-葡萄糖存在下从除D-葡萄糖以外的糖产生额外的酵母生物质和/或最终产物或发酵副产物如乙醇。生产纤维素乙醇的优异性能。纤维素生物质含有多种糖，最主要是D-葡萄糖和 D-木糖。然而，酵母代谢生理常常受到分解代谢物抑制，调控使用D-葡萄糖而排除许多其它糖。虽然这未在D-木糖或D-木酮糖中证实，但我们目前证明利用D-木糖和D-木酮糖也会受限于分解代谢物抑制。因此，在这些戊糖存在时，野生型酵母菌株优选代谢D-葡萄糖。 而且，我们现在证明，工业酵母菌株受到己糖和戊糖的分解代谢物抑制。这是利用大部分酵母菌株产生纤维素乙醇的重要技术障碍。为了在多种糖发酵过程中克服这一障碍，需要消除D-木糖的分解代谢物抑制。一种实施方式包括通过除去至少一种下列基因来消除分解代谢物抑制GRR1、REG1和HXK2。本发明的一些实施方式包括选择工业酵母菌株，例如，在 2-脱氧-葡萄糖存在时，在除D-葡萄糖以外的糖，特别是戊糖上生长的酵母。在一些实施方式中，这是一种方法，其包括选择在显著水平的2-脱氧-D-葡萄糖存在时，在除D-葡萄糖以外的糖源上生长的工业酵母变异体。在一些实施方式中，这些菌株缺少，或至少不表达有效水平形式的至少一种下列以下基因GRR1、REG1和HXK2。在其它实施方式中，可突变这些基因，从而不产生可检测水平的活性蛋白质。另外一些实施方式包括使用在2-脱氧-葡萄糖存在时能在除D-葡萄糖以外的糖上生长的工业酵母菌株，在显著量的D-葡萄糖存在下，从除D-葡萄糖以外的糖产生额外的酵母生物质和/或最终产物或发酵副产物如乙醇。一些实施方式包括发酵包含混合糖(包括D葡萄糖)的原料的方法，该方法包括使用具有不同代谢要求的多种酵母菌株有效产生生物质或代谢物如乙醇的步骤。在一些实施方式中，用至少两种不同的酵母菌株进行发酵，其中至少一种菌株优先在D-葡萄糖上生长，并可能在可检测水平的D葡萄糖存在下显示出分解代谢物抑制，而至少一种其它菌株解除抑制，并且即使在可检测水平的D葡萄糖存在下也可以将除D-葡萄糖以外的糖发酵成乙醇和/或生物质。在一些实施方式中，此种方法可提供能有效同时发酵D-葡萄糖和戊糖如D-木糖的系统。酿酒酵母的分解代谢物抑制抗性菌株包括酿酒酵母菌株变异体CEN. PKgrrl Δ 或酿酒酵母菌株变异体乙醇红(Ethanol Red)GXl，其中所述变异株的单细胞分离物在固体培养基上生长，该培养基包含D_木糖和2-脱氧-D-葡萄糖，其中所述培养基中的主要碳源是D-木糖，所述变异体在该培养基上生长两天就能产生强大菌落。其它实施方式包括酿酒酵母的分解代谢物抑制抗性菌株，包括例如，酿酒酵母菌株变异体CEN. I3Kgrrl Δ或酿酒酵母菌株变异体乙醇红(Ethanol Red)GXl，其中所述变异体菌株的单细胞分离物在固体培养基上生长，该培养基包含麦芽糖和2-脱氧-D-葡萄糖， 其中所述培养基中的主要碳源可以是含D-葡萄糖的糖，包括但不限于麦芽糖，所述变异株在该培养基上生长两天就能产生强大菌落。其它实施方式包括酿酒酵母的分解代谢物抑制抗性菌株，其中所述培养基包含约2% D-木糖和约0. 2-脱氧-葡萄糖。其它实施方式包括在培养基上生长的变异体，该培养基包含约2%麦芽糖或另一种含D-葡萄糖的糖，以及约0. 1 %的2-脱氧-葡萄糖。其它实施方式包括酿酒酵母的分解代谢物抑制抗性菌株，其中所述变异株选自 单倍体实验室菌株CEN. PK衍生物CDXK1、CEN. PK(113-7D) Xdxe2和CDXK3，以及二倍体工业酵母菌株乙醇红GXl和RX4的衍生物。在一些实施方式中，用所述方法选择的分解代谢物抑制抗性酿酒酵母菌株在固体培养基上生长，所述培养基包含D-葡萄糖作为主要碳源。一些实施方式包括酿酒酵母的分解代谢物抑制抗性菌株，其中所述变异株在包含 2% D-半乳糖和约0. 03% 2-脱氧-葡萄糖的固体培养基上生长其中所述D-半乳糖是该培养基中的主要碳源。其它实施方式包括产生在除D-葡萄糖以外的糖上生长的酿酒酵母菌株，包括一些工业菌株的方法，该方法包括以下步骤提供第一种酿酒酵母变异株，其中所述变异体在 2-脱氧-D-葡萄糖存在时，能在除D-葡萄糖以外的糖，特别是戊糖上生长；和在第一种变异体菌株中过度表达至少一种基因以形成第二种变异株，所述基因分离自代谢除葡萄糖以外的糖的分解代谢途径。其它实施方式包括在D-葡萄糖存在时，能够在戊糖上生长的酿酒酵母变异株的生成方法。在一些实施方式中，第一种变异株选自，例如GX1、RX4、Cdxki、CEN. H((113-7D)、 Cdxe2和CDXK3，其中可使该菌株适应表达分离自D-木糖分解代谢途径的至少一种基因。其它实施方式包括在除D-葡萄糖以外的糖源上培养酿酒酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤提供第一种酿酒酵母菌株，其中所述菌株在2-脱氧-D-葡萄糖存在时， 能在除D-葡萄糖以外的糖源，特别是戊糖上生长；在第一种菌株中过度表达至少一种基因以形成第二种菌株，所述基因分离自分解代谢除葡萄糖以外的糖，特别是戊糖的代谢途径； 和在培养基上培养所述第二菌株，其中所述培养基中的主要碳源是除葡萄糖以外的糖，特别是戊糖。在一些实施方式中，所述第一种菌株是酿酒酵母菌株CEN. 1 的变异体，其选自 CDXK1、CEN. PK(113-7D)、cDXE2和CDXK3，至少一种过度表达的基因来自D-木糖分解代谢途径。在其它实施方式中，第一种菌株是工业酿酒酵母菌株乙醇红的变异体，其选自 GXl和RX4，且至少一种过度表达的基因来自D-木糖分解代谢途径。其它实施方式包括鉴定参与酿酒酵母的分解代谢物抑制的开放阅读框的方法，该方法包括以下步骤培养在D-葡萄糖，或D-葡萄糖和D-木糖，或D-木糖存在时受到葡萄糖抑制的第一种酿酒酵母菌株变异体；增殖对葡萄糖抑制不敏感的第二种酿酒酵母菌株变异体，所述第二种变异体在D-葡萄糖，D-葡萄糖和D-木糖，或D-木糖存在时，能够在除D-葡萄糖以外的主要碳源上生长；和比较所述第一种变异体和所述第二种变异体的蛋白质组以鉴定所述第一种和所述第二种变异体的蛋白质组之间的差异。在一些实施方式中，用另外的第二种糖代替D-木糖，例如麦芽糖或麦芽三糖，但不限于麦芽糖或麦芽三糖。如权利要求10所述的方法，其中所述第一种和所述第二种变异体的蛋白质组之间的差异表明以下开放阅读框的至少一种产物的差异ALR063W、YMR167W、YPL176c、 YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、YHR154w、YCL048w、YLR133w、 Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、Y0L101C、YML124C、YMRl 16C、YDR028c、YDR074c、 YDL088c 和 YGR271w。附图简要说明图IA是酵母将玉米淀粉和植物生物质转化成乙醇的途径的示意图。图2是将D-葡萄糖或D-木糖转化成乙醇的途径的示意图。正在出芽的酵母细胞的照片。
图3是一些酵母菌株在D-木糖上生长的培养装置。图4是提出的用啤酒酵母发酵D-木糖的途径。图5是显示加有2% D-木糖的YP上所培养CEN. PK突变酵母菌落生长的平板照片。图6是显示CEN. PK的2_脱氧-葡萄糖抗性衍生物的补充分析结果的平板照片。图7是在2-脱氧-葡萄糖存在时，在D-木酮糖、D-木糖混合物上生长的酵母的平板照片。图8是通过各种工业酵母菌株将玉米芯水解产物发酵成乙醇的示意图。图9是用于鉴定GRRl基因的缺失的PCR分析结果。图10是用于检测REGl基因的缺失的PCR分析的结果。图11是由GXl同时发酵麦芽糖和D-葡萄糖的示意图。发明详述出于促进对新技术原理的理解的目的，下面参考优选实施方式并采用特定术语进行描述。然而应理解，不应据此限制新技术的范围，该范围也应包括该新技术所属领域技术人员根据该新技术的原理通常能够想到的这些改变、修饰和其它应用。除非另有说明，本文所用术语“约”指加上或减去百分之20，例如，约1.0包括 0. 8-1. 2的范围。除非另有说明，本文所用术语“可检测的生长”指包括和直到人裸眼观察可明显看出的生长迹象的生长状况。除非另有具体说明，基因的命名采用Demerec，M.，Adelberg，Ε. Α.，Clark，A. J.和 Hartman，P. Ε. “对细菌遗传学统一命名的提议”(A proposal for a uniform nomenclature in bacterial genetics). J. Gen. Microbiol 50，1-14 (1968)中提议的命名法。在几个世纪前，驯化酿酒酵母用于将糖发酵成乙醇(见图1和2)。驯化酵母导致产生在将D-葡萄糖转化成乙醇方面很有效率的工业酵母菌株。意义深远的是，这些工业酵母菌株对乙醇的耐受性大大高于大多数微生物。当用于酵母生长和/或乙醇生产的糖是一些自然界中含量最丰富的己糖，特别是D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖时，这一过程非常高效。为了在工业企业中将纤维素工业转化成乙醇，在优化将纤维素转化成可发酵糖如葡萄糖的过程时花费大量精力。虽然在基于酵母的乙醇生产中优化纤维素向可发酵糖的转化很重要，但从植物材料中存在的除D-葡萄糖以外的糖，特别是D-木糖中简化产生乙醇同样重要。植物材料中最丰富的化合物是葡萄糖聚合物纤维素；然而，还有大量植物生物质以称为木聚糖的糖聚合物形式存在(图1 ；参见例如，Warren 1996)。实际上，在许多纤维素来源中，木聚糖可能占该聚合物中生物质的20%以上。木聚糖本身由戊糖D-木糖链构成。 为了由酵母例如酿酒酵母的大部分工业和实验室菌株发酵，必须先将木聚糖如纤维素转化成其单体D-木糖。这一过程已经相当复杂，再加上发酵环境中存在D-葡萄糖使其更为复杂，因为大部分商业生产的酿酒酵母菌株(特别是原料中不存在D-葡萄糖时)不能有效发酵戊糖如D-木糖。通常认为酿酒酵母(S. cerevisiae)不能发酵D-木糖，实际上上世纪七十年代就有报道称酿酒酵母不能利用D-木糖作为碳源(Barnett 1976)。根据文献，树干毕赤酵母(Pichia stipitis)能够发酵D-木糖。基于这一信息，若干实验室尝试通过在酿酒酵母中表达D-木糖利用所需的毕赤酵母基因，产生能够发酵D-木糖的酵母菌株(参见例如 Kotter和Ciriacy, 1993 ；Ho等，1998 Jin等，2003)。虽然在各个情况下都报道D-木糖的利用改进，但在D-葡萄糖存在时D-木糖发酵效率仍然变化很大。一些因素可能可以解释这一结果，包括实验性生长和预生长条件的差异。以及D-木糖代谢途径的异源表达水平。Ho博士(普杜大学(Purdue U.))对酿酒酵母的研究工作以及Ingram博士(佛罗里达大学(U. of Florida))对革兰(-)和革兰(+)细菌的研究工作集中于重组表达用于分解代谢D-木糖(树干毕赤酵母)和产生乙醇(来自各种微生物)的其它生物体的代谢途径中的外源性基因。如果不受任何理论或假说的束缚并以解释而非限制方式，可用若干被忽视的或至少未受充分重视的理由来解释这些观察结果。例如，与报道结果相一致的一种解释是这些实验所用D-木糖的确切组成的易变性。实际上，从化学品供应公司购得的糖很少是“纯” 的。实际上，标称为纯的大部分糖的纯度只有约99或98%。通常，糖中的主要污染物是丰度极高的D-葡萄糖。不幸的是，对于酵母代谢研究而言，已知低至0. 的D-葡萄糖含量都会影响除D-葡萄糖以外的糖，如D-半乳糖的利用。因此，非常可能在至少部分已公开研究中所用的至少一些98-99%纯的D-木糖实际上被D-葡萄糖污染。在旨在确定某给定酵母菌株可否在D-木糖上生长的研究中，即使少量D-葡萄糖的污染就可能极大扭曲了这些研究中观察到的结果。大部分糖被D-葡萄糖污染是一个历史性的问题。例如，只有在工业上引入包含少于0.01% D-葡萄糖(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))的D-半乳糖后，才能可靠鉴定使用D-半乳糖的酵母。不幸的是，不被D-葡萄糖污染的D-木糖很难获得。因此，称某些酵母菌株无法在D-木糖上生长的报道可能有误，这可以解释文献中一些矛盾的报道。对于文献报道中涉及木糖发酵的不一致内容的另一解释可以是这些研究中采用的各种实验室和工业酵母菌株的基因型组成不同。虽然大部分实验室酵母菌株来自少数起源(Mortimer和Johnston，1986)，但随着时间推移它们的后代可能发展出迥然不同的生长特性(Winston等，1995 ;van Di jken等，2000)。事实上，近期文献都提示，至少一个酿酒酵母菌株不用遗传修饰就可以在D-木糖上生长(参见kdlak和Ho，2004 ；图3 ；标为野生型的小图；Toivari等，2004)。菌株MC996A似乎能够在市售级D-木糖上生长，而不需加入毕赤酵母的D-木糖利用基因。该菌株是已证明具有很强遗传背景的CEN. PK菌株家族的衍生物。这些菌株明显丰富的遗传多样性使得它们能够发酵多种糖(van Dijkens等，2000)。纤维素生物质包含多种糖，最主要是D-葡萄糖和D-木糖。然而，酵母代谢生理常常受到代谢物抑制，即调控使用D-葡萄糖而排除许多其它糖。虽然这没有在D-木糖或 D-木酮糖中证实，但本文中证明利用D-木糖和D-木酮糖也会受到代谢物抑制。因此，野生型酵母菌株优先代谢葡萄糖。这是利用大部分酵母产生纤维素乙醇的重要技术障碍。为了在多种糖发酵过程中克服这一障碍，需要消除D-木糖的代谢物抑制。可通过(例如)产生缺少己糖激酶基因HXKl和HXK2的菌株来产生不能利用D-葡萄糖的酵母菌株。还发现，携带HXK2和GRRl突变的酵母菌株也表现出类似于REGl突变体的行为(数据未显示)。因此，无论是分析强野生型菌株或过度表达D-木糖途径的毕赤酵母基因的菌株，存在D-葡萄糖都可能阻止D-木糖的利用。大部分酵母菌株具有与D-木糖降解必需基因高度相关的基因。按照现在情况，即使是引用存在发酵D-木糖的酿酒酵母的报道，也认为它们的效率很低。例如，Sedlak和Ho (2004)报道称，在据信可代谢D-木糖的CEN. PK酵母菌株利用大部分(如果不是全部)D-葡萄糖之前，消耗的D-木糖非常少。文献的当前状态明确说明， 缺少强大的筛选机制来鉴定可以在戊糖如D-木糖上可靠生长的酵母变异体。假定酿酒酵母中存在发酵D-木糖的途径，那么建立强大的筛选机制后对这些途径的研究、改进和增加会更为容易。参见图3A。本文所示结果说明，可筛选和分离能在木糖上生长的CEN. 1 的自发突变体。这一结果与酵母基因组全序列的分析结果相一致，该分析结果说明，酵母中存在 D-木糖发酵所需的各个酶的紧密同源物(图4)。参见图3。和CEN. I3K衍生物在D-木糖上生长。在图3A中，将细胞重复接种到加有2% D-木糖的YP培养基上，30°C孵育4天。在图;3B中，将细胞重复接种到加有2% D-木糖/0. 1 % 2-脱氧葡萄糖的YP培养基上，30°C孵育10天。B图中的箭头指向在2-脱氧葡萄糖存在时生长的CEN. 1 自发突变体产生的菌落。酵母细胞在发酵D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖方面非常有效；而且，酵母发酵这些糖时排斥许多其它碳源，这种现象称为分解代谢物抑制(参见Gancedo 1998的综述)。 实际上，迄今为止研究的几乎所有酿酒酵母菌株都只依赖D-葡萄糖、D-果糖和/或D-甘露糖获取能源，直到完全或接近完全地耗尽环境中的这些糖。例如，如果仅痕量D-葡萄糖 (< 1 % )污染D-半乳糖，则酵母不发酵D-半乳糖，直到所有存在的D-葡萄糖被耗尽。文献中有关酿酒酵母利用D-木糖的矛盾报道可能是由于生长培养基被D-葡萄糖污染，其造成分解代谢物抑制。已证明，在基于麦芽糖、蔗糖和D-半乳糖的发酵中，若干基因中的突变能够缓解实验室菌株的分解代谢物抑制。被认为参与分解代谢物抑制的基因包括GRR1、REGl和 HXK2(综述见Gancedo，1998)。在某些实验室菌株内，缺少这些基因中的任何一个都可能使一些实验室菌株能够同时发酵D-葡萄糖和其它己醣如D-半乳糖或蔗糖(Bailey和 Woodward,1984)。对衍生自实验室酵母的酵母细胞在D-葡萄糖存在时利用一些次级碳源的能力的一种测试是检测细胞在次级碳源和少量2-脱氧-葡萄糖存在下的生长能力。2-脱氧-葡萄糖是D-葡萄糖的不可代谢衍生物，据报道它在某些实验室菌株中能针对己糖如D-半乳糖、麦芽糖和蔗糖产生葡萄糖抑制作用。利用D-半乳糖时也表现出这一现象(Bailey等， 1982 ；Bailey和Woodward，1984)。据信，既具有分解代谢物抑制活性又能够发酵D-半乳糖、 麦芽糖或蔗糖的暴露于2-脱氧-葡萄糖的酵母细胞在2-脱氧-葡萄糖存在时不能利用替代碳源，且这些菌株无法代谢2-脱氧-葡萄糖。据报道，这种状况导致细胞死亡；然而，暴露于2-脱氧-葡萄糖的酵母细胞的确切死亡原因尚不明确(Raiser等，2008)。葡萄糖抑制说明了酵母中的这样一种现象，即必须将培养基中的D-葡萄糖耗尽后，才能利用大部分其它碳源。一个经过详细研究的葡萄糖抑制的调节物是Migl转录因子，认为它可用作参与利用替代碳源的基因的转录阻抑物；然而，也有报道称缺失MIGl不会使细胞具有2-脱氧-葡萄糖抗性(khUlIer，200 。如上所述，缺少GRR1、REG1或HXK2 使细胞具有2-脱氧-葡萄糖抗性(Gancedo 1998)。虽然Regl是人们认为通过使PPl复合物接近Migl来调节Migl的PPl蛋白磷酸酶亚基，实现葡萄糖抑制所需的其它蛋白质的确切机制尚不明了。微阵列分析也表明，Migl只影响Grrl和Hxk2调控过程中的一小部分 (Westergaard等，2006)。本文进行和报告的蛋白质组学分析实验结果表明，尚未认识到分解代谢物抑制调控中的一个大转录后组件。从1所述筛选中分离的CEN. PK自发突变显示REGl基因座失活(图6)。而且，靶向破坏REGl或已知缺失时具有相似突变体表型的另外两个基因GRRl和HXK2也能获得在此培养基上生长的能力。可通过PCR介导的基因破坏方式靶向破坏REG1、GRRl或HXK2。 通过设计与特定基因座DNA的5'和3'区段相同的引物来进行这些实验。采用对氨基糖苷类抗生素诺尔丝菌素产生抗性的来自诺尔丝链霉菌(Sti^ptomyces nourseothricii)的 natl基因时，可以用乙酸锂转化法转化酵母来去除上述基因中任何一种。在单倍体菌株中， 破坏一条等位基因就足以使其在补充有L-谷胺酰胺、2% D-木糖和0. 1 % 2-脱氧-葡萄糖的YP培养基上生长。然而，不同酵母菌株对不同浓度的2-脱氧-葡萄糖的敏感性不同。大部分工业菌株是二倍体。因此，在这些菌株中进行转化只能保证去除一条等位基因。令人惊讶的是，我们发现可通过将杂合菌株接种在含有2-脱氧-葡萄糖和用作主要碳源的第二种糖的培养基上，可重复地除去二倍体或任何更多倍体酵母的同一基因座上的其它拷贝；所述第二种糖包括但不限于糖如麦芽糖、D-半乳糖、蔗糖、D-木糖或D-木酮糖。下面参见图3和5。在D-木糖的情况下也表现出这一现象。如图3所示，将S288c grrl Δ菌株、野生型CEN. PK菌株和CEN. PK grrl Δ菌株接种到含有2% D-木糖的培养基上时，可检测到所有三种菌株的生长。然而，只有CEN. 1 grrl Δ菌株在含有2% D-木糖和 0.1% 2-脱氧-葡萄糖的培养基上生长(图3)。在CEN. PK菌株的细胞区域内随着时间推移，10-15天后开始出现分离的菌落。大约21天后，这些菌落长得大到足以进行物理操作。这些分离的菌落是获得存在2-脱氧-葡萄糖时在D-木糖上生长的能力的CEN. PK亲本菌株的自发突变体(见下)。 采用S288c grrl Δ衍生物时没有观察到这一现象。这些结果表明，与CEN. PK细胞相反，即使在缺失GRRl基因后，S^Sc细胞也不能在2-脱氧-葡萄糖存在时在D-木糖上生长。在 S288c中无法开发出2-脱氧-葡萄糖抗性/D-木糖利用突变体提示，S288c出现的少量生长可能是由于利用了 D-木糖内污染量的葡萄糖。在本文所述的筛选中分离且在2-脱氧-葡萄糖存在时在D-木糖上生长的两种代表性的酿酒酵母单倍体菌株⑶XR2和JH015于2009年2月25日保藏于美国典型培养物保藏中心，登录号分别为ΡΤΑ-9849和ΡΤΑ-9850。根据有关生物材料保藏的布达佩斯条约的条款，本发明授权后公众可以获得这些菌株。酵母细胞代谢从利用优选糖转变成非优选糖(如D-半乳糖和D-木糖)可能需要数小时。即使在经工程改造过度表达D-木糖降解必需酶的的酵母细胞中，也会出现这种时滞。在利用糖混合物的工业和实验室酵母菌株中，D-木糖的代谢效率似乎非常低，直到混合物中几乎完全不含D-葡萄糖。参见图9。用PCR分析在2-脱氧-葡萄糖存在时能够在木糖上生长的所选二倍体工业酵母菌株。如果GRRl完整，则三个Grrl Tf和Grrl TF引物对应产生3810bp的PCR产物；如果GRRl被破坏，该PCR产物应该是1400bp。如果GRRl完整，则Grrl Tf和pAG25TRl引物对应不产生PCR产物，如果GRRl被natl基因替代，则应产生 1200bp的PCR产物。 PCR分析证明，在弗门狄斯乙醇红的衍生物grrl-/-2A和grrl_/_2B菌株中，两种GRRl基因均被natl基因取代。应注意，RC4是具有grrl::NATl的单倍体S288C衍生物。在此PCR 反应中，两个先前的PCR反应(10/18/04和12/10/09)返回与grrl-/-菌株相同的产物。下面参见图10。对二倍体工业菌株进行类似分析，以寻找Regl基因中的改变。如果REGl完整，Regl测试A和Regl测试ID引物对应产生约3600bp的PCT产物；如果被破坏，则PCR产物应为约1800bp。如果REGl完整，那么Regl测试A和pAG25TRl引物对应不产生PCR产物，如果REGl被natl基因取代，则应产生约1500bp的PCR产物。上述PCR分析证明，在弗门狄斯乙醇红的衍生物regl-/-lA和reg 1-/-1B菌株中，两种REGl基因均被 natl基因取代。也证明，即使在携带Natl基因的菌株，如grrl_/_2A中，用REGl测试A和 PAG25T41引物也无法获得PCR产物。D-葡萄糖抑制作用的强度见表1，该表包括D-木糖(Jin等，2004)以及不同浓度 D-葡萄糖(Yin等，2003)调控的转录物选择组的水平。也包括与野生型细胞相比，GRRl和 HXK2的细胞突变体在2% D-葡萄糖中生长时，这些转录物的调控作用(Westergaard等， 2006)。如表1所示，即使是恒定水平的低D-葡萄糖(0. 01% )也会引起分解代谢物抑制。 例如，FBPl转录物的丰度在0. 01% -1% D-葡萄糖时保持相对恒定，而在2% D-木糖上或在缺少GRRl的细胞中的生长被高度诱导。消除分解代谢物抑制应该有用，即使可能通过加工混合的糖原料将D-葡萄糖混合的糖原料水平降低到小于诱导分解代谢物抑制的水平， 因为加工混合糖原料至基本耗尽它们中的D-葡萄糖是耗时和昂贵的。
权利要求
1.一种分离酵母的方法，包括以下步骤提供生长培养基，其中所述培养基包含2-脱氧-葡萄糖、木糖和谷胺酰胺；木糖是唯一的碳源；用至少一种酵母菌株接种所述培养基；从所述培养基中分离至少一种酵母细胞；其中所述酵母细胞能够在至少约0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖存在时，以D-木糖作为唯一碳源生长。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株在大约14天后在所述培养基上表现出可检测的生长。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株只有在大约21天后才在所述培养基上表现出可检测的生长。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包含约2.0重量％的木糖和约 0.5重量％的谷氨酰胺。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母是酵母属物种。
6.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酵母是酿酒酵母的菌株。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株是单倍体。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株是二倍体。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株是大于二倍体的多倍体。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分离自所述培养基的所述酵母菌株在至少 0. 03重量％的2-脱氧-葡萄糖存在时将代谢至少一种戊糖。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分离自所述培养基的所述酵母菌株在至少约0. 03重量％的2-脱氧-葡萄糖存在时将代谢至少一种除D-葡萄糖以外的己糖。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分离自所述培养基的所述酵母是自发突变体。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述酵母接触至少一种诱变剂的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述诱变剂选自电离辐射、紫外线和影响 DNA结构的试剂，例如嵌入剂、烷化剂、DNA加合物等。
15.一种酵母变异体，其包括在至少0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖存在时，以至少一种戊糖作为唯一碳源生长的酿酒酵母菌株。
16.如权利要求15所述的酵母变异体，其特征在于，所述酿酒酵母菌株是单倍体。
17.如权利要求15所述的酵母变异体，其特征在于，所述酿酒酵母菌株是二倍体。
18.如权利要求15所述的酵母变异体，其特征在于，所述酿酒酵母菌株选自JH015、 CDXR2和弗门狄斯乙醇红regl Δ和弗门狄斯乙醇红grrl-/-(GXl)。
19.一种发酵糖源的方法，所述方法包括以下步骤提供至少一种酿酒酵母菌株，其中在至少0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖存在时，所述至少一种酿酒酵母菌株将在至少一种戊糖上生长；提供包含至少一种糖的原料；和在所述原料上培养所述酵母菌株。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述原料包含D-葡萄糖，其含量足以支持所述酵母菌株在不存在任何其它糖源的情况下生长。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述原料包含可被所述酵母菌株发酵的戊糖。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述原料包含可被所述酵母菌株发酵的戊糖和至少0. 的2-脱氧-葡萄糖。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述原料包含除D-葡萄糖以外的可发酵己糖。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述原料还包含D-葡萄糖。
25.—种产生酵母突变菌株的方法，包括以下步骤提供选自Grrl和Regl的至少一个基因有活性的酵母菌株；去除Grrl和Regl的活性以产生突变菌株；和测试所述菌株以确定在至少约0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖存在时该菌株能否在戊糖上生长。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述突变菌株是单倍体。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述突变菌株是二倍体。
28.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述突变菌株是大于二倍体的多倍体。
29.—种选择或鉴定酵母菌株的方法，包括以下步骤提供在选自下组的至少一个开放阅读框中含有突变的酿酒酵母的菌株ALR063W、 YMR167w、YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、YHR154w、 YCL048w、YLR133w、Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、YOLlOlc、YML124C、YMR116C、 YDR028c,YDR074c,YDL088c和YGR271，其中所述开放阅读框编码功能性基因且所述开放阅读框中的突变会破坏该开放阅读框编码的基因的活性；在包含作为唯一碳源的木糖和至少约0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖的培养基中培养所述酿酒酵母菌株；和分离在所述培养基中生长的酿酒酵母菌株。
30.一种分离酵母菌株的方法，其包括以下步骤提供一种菌株，其包含选自下组的开放阅读框编码的至少一种基因的功能性拷贝 YLR063w、YMR167w、YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、 YHR154w、YCL048w、YLR133w、Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、Y0L101C、YML124C、 YMR116C、YDR028c、YDR074c、YDL088c 和 YGR271w ；将突变引入选自下组的至少一个开放阅读框中ALR063WJMR167WJPL176CJPL123C、 YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、YHR154w、YCL048w、YLR133w、Y0R138c、 Y0R177c、YDR269c、YIL064w、YOLlOlc、YML124C、YMRl 16C、YDR028c、YDR074c、YDL088c 禾口 YGR271w,以产生酿酒酵母突变体；在选择培养基上培养所述酿酒酵母的突变体，其中所述选择培养基包含作为唯一碳源的木糖和至少约0. 03重量％ 2-脱氧-葡萄糖；和分离在所述培养基上生长的突变体。
全文摘要
本文公开了产生和/或分离酿酒酵母变异体的材料和方法，特别是可以在含量足以抑制大部分酵母菌株在除D-葡萄糖以外的糖上生长的2-脱氧-葡萄糖和/或D-葡萄糖存在时，在除D-葡萄糖以外的糖上生长的酿酒酵母变异体。可用于分离这类变异体的选择培养基包含戊糖如D-木糖、L-谷胺酰胺和2-脱氧-葡萄糖。某些菌株中Grr1和Red基因的突变也产生可以在2-脱氧-葡萄糖存在时，在包括戊糖D-木糖的糖上生长的变异体。
文档编号C12N1/00GK102498202SQ201080018127
公开日2012年6月13日 申请日期2010年2月25日 优先权日2009年2月25日
发明者C·伍兹, J·黑恩, M·戈保, R·科克林 申请人:印第安纳大学研究和科技公司