专利名称：一种改造的鞭毛素蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种优化改造的鞭毛素蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
现在已知致病菌来源的鞭毛素蛋白具有免疫佐剂效果，它是通过鞭毛素蛋白与 Toll样受体(Toll-like rec印tors，TLRs) 5相结合，引发NF-κ B途径引发先天性免疫，进 而引发特异性免疫。通过鞭毛素蛋白与目的蛋白混合或融合后免疫，可以显著提高对目的 抗原的免疫应答，并且可达到抵抗带有目的抗原的病原微生物的效果。但是因其来源于致 病菌，可能具有潜在的危险性，并且它还可以引起炎症反应，产生大量针对鞭毛素自身的免 疫反应，导致可能的耐受性以及其它可能的免疫副反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种优化改造的鞭毛素蛋白，并将其作为佐剂，使得在保证 其佐剂活性的前提下降低它的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应。本发明的第一个目的是提供一种改造的鞭毛素蛋白，该改造的鞭毛素蛋白为缺失 高变区的蛋白，所述高变区为鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域。优化的，所述改造的鞭毛素蛋白包括FliCA 190-278、FliC Δ 220-320或 FliCA 180-400 ο本发明的目的之二在于提供一种改造鞭毛素蛋白的制备方法，将鞭毛素蛋白高变 区进行缺失，所述高变区为鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域。具体来说，其制备方法包括如下步骤(1)构建鞭毛素蛋白重组质粒；(2)以所述步骤(1)得到的鞭毛素蛋白重组质粒为模板，构建鞭毛素缺失克隆，并 表达纯化。优选的，上述步骤(1)构建鞭毛素蛋白重组质粒中的模板为人肠道沙门氏菌J341 基因组，引物为如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的序列，连接载体为ρΕΤ28。优选的，上述步骤(2)构建鞭毛素缺失克隆的引物为如SEQ ID NO :3至SEQ ID NO 6所示的序列，以得到改造鞭毛素蛋白FliCA 190-278 ；或所用引物如SEQ ID NO 7至 SEQ ID NO :10所示的序列，以得到改造鞭毛素蛋白FliCA 220-320 ；或所用引物如SEQ ID Ν0:11至SEQ ID NO :14所示的序列，以得到改造鞭毛素蛋白FliCA 180-400。具体见实施 例。本发明还提供了将上述改造的鞭毛素蛋白应用为佐剂。因为该佐剂是通过对鞭毛 素蛋白改造而得到的，因而，可以在保证其佐剂活性的前提下降低它的抗原性、免疫原性以 及由其引发的炎症反应。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
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通过改造鞭毛素蛋白，去除其主要的免疫原性区及抗原活性区，降低它的抗原性、 免疫原性以及由其引发的炎症反应。
图1是纯化的蛋白分别经过SDS-PAGE和Western Blot的验证结果图；图2是FliC刺激后诱导Caco-2细胞释放IL-8和MCP-I的水平检测图，其中，图A 是FliC刺激后诱导Caco-2细胞释放IL-8的水平检测图，图B是FliC刺激后诱导Caco-2 细胞释放MCP-I的水平检测图；图3是FliC的佐剂活性检测实验相关结果，其中，图A是血清中p24-特异性 IgG的滴度比较结果，图B是血清中p24-特异性IgA的滴度比较结果，图C是唾液样品中 P24-特异性IgA的滴度比较结果，图D是阴道样品中IgA滴度比较结果，图E是血清中IgG 的滴度比较结果；图4是鞭毛素高变区部分缺失蛋白的稳定性的相关实验的图片，其中，图A是 构建的三种缺失蛋白的结构示意图，图B是构建的三种缺失蛋白的三维结构，图C是 FliCA 190-278的电泳图片，图D是FliC Δ 220-320的电泳图片，图E是FliC Δ 180-400的 电泳图片；图5是ELISA检测血清中FliC-特异的和FliC-改造克隆-特异的IgG滴度的实 验结果图，其中，图A是ELISA检测血清中FliC特异的IgG滴度比较图。图B是ELISA检 测血清中FliC改造克隆特异的IgG滴度比较图；图 6 为将缺失改造克隆 FliCA 190-278、FliC Δ 220-320 及 FliCA 180-400 以不 同的浓度(0. l、l、10、100、1000、10000ng/ml)分别刺激 Caco-2 细胞后，ELISA 检测 IL-8 和 MCP-I的结果图其中，图A是ELISA检测IL-8的结果图，图B是ELISA检测MCP-I的结果 图；图 7 是以 p24 为抗原，分另丨」与 FliC、FliCA 190-278、FliC Δ 220-320 及 FliCA 180-400混合免疫BALB/c小鼠后，ELISA检测血、唾液样及阴道样p24_特异性和佐 剂_特异性的抗体滴度的结果图，其中，图A是ELISA检测血清中p24-特异性和佐剂_特 异性的IgG抗体滴度的结果图，图B是ELISA检测血清中p24-特异性和佐剂_特异性的 IgA抗体滴度的结果图，图C是ELISA检测唾液样p24-特异性和佐剂-特异性的IgA抗体 滴度的结果图，图D是ELISA检测阴道样p24-特异性和佐剂_特异性的IgA抗体滴度的结 果图；图8是毒性试验的预试，将小鼠经滴鼻途径免疫，免疫后常规饲养，连续观察7天， 记录小鼠体重的结果图；图9是FliCl滴鼻免疫C57BL/6小鼠，分别于免疫后6h、12h、24h、36h、48h及一周 杀小鼠，观察肝脏病变情况，其中，图A是解剖的PBS组小鼠肝组织HE染色结果图，图Bl是 处理组12h时肝组织HE染色结果图，图B2是处理组24h时肝组织HE染色结果图，图B3是 处理组1周时肝组织HE染色结果图；图10是FliCl处理组肝脏不同时间，观察肝脏病变情况，其中，图A是PBS组肝组 织HE染色结果图，图Bl是FliCl处理组肝脏12h时肝组织HE染色结果图，图B2是FliCl 处理组肝脏24h时肝组织HE染色结果图，图B3是FliCl处理组肝脏1周解剖后的小鼠肝组织HE染色结果图；图11是取FliCl处理组血清，对反应肝细胞损伤的生化指标进行生化分析的结果 图，其中，图 A、B、C、D、E、F、G 和 H 分别是对 ALT 和 AST、TP、ALB、TBiL、DBiL、BUN 和 CREA 的 生化分析的结果图；图12为FliC Δ 220-320的安全性的相关实验结果，其中，图A为FliC免疫组血清 中ALT和AST浓度的比较图，图B为FliC免疫组肝脏解剖学观察对比图，图C为FliC免疫 组肝脏组织病理学观察对比图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆实验手册中所述的条件。实施例1 克隆构建(I)FliC重组质粒构建以人肠道沙门氏菌J341基因组为模板，以primerl/primerf为引物(引物序列 见表1)进行PCR扩增，引物下划线部分分别为NcoI和XhoI酶切位点，为方便重组蛋白纯 化，在primer2引物设计时缺失掉flic基因的终止密码子TAA，使其与载体pET28酶切位点 XhoI后的6聚组氨酸标签形成融合表达。PCR产物经NcoI和XhoI双酶切后，与经同样双 酶切线性化的pET28a载体连接。连接产物转化BL21 (DE3) star ；挑取阳性克隆进行酶切及 测序鉴定，将正确的重组质粒命名为FliC，其表达产物C-端带有6聚组氨酸标签。(2)鞭毛素缺失克隆 FliC Δ 180-400、FliC Δ 190-278 及 FliC Δ 220-320 的构建FliCA 180-400 构建以重组质粒 FliCl 为模板，分别以 primer21/primer22、 primer23/primer24为引物(引物序列见表1，表1所示是寡核苷酸引物序列)，分别扩增片 段 FliC(l-180AA)和 FliC(400-560AA)，在 primer21 和 primer225，端分别设计酶切位点 NcoI和EcoRI，在primer23和primer24 5，端分别设计酶切位点EcoRI和XhoI，PCR产物分 别经NcoI/EcoRI 及EcoRI/XhoI 酶切后，在FliC(l-180AA)片段的 C-端及FliC(400_560AA) 片段的N-端产生相同的EcoRI粘性末端。将酶切后片段按1 1的比例置于4°C链接1小 时，连接产物跑胶纯化，将纯化的酶切产物与经NcoI和XhoI双酶切线性化的pET28a载体 连接。连接产物分别转化BL21(DE3) star，挑取阳性克隆进行酶切及测序鉴定，将正确的重 组质粒分别命名为FliCA 180-400。FliCA 190-278-320 及 FliCA220_320 构建，分别以 primerl3/primerl4 和 primerl5/primerl6 及 primerl7/primerl8 禾口 primerl9/primer20 为弓I物(弓I物序列见表 1)进行PCR扩增，构建过程同重组质粒FliC Δ 180-400的构建。表 1
权利要求
1.一种改造的鞭毛素蛋白，其特征在于，所述改造的鞭毛素蛋白为在高变区有缺失的 蛋白，所述高变区为鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域。
2.根据权利要求1所述的改造的鞭毛素蛋白，其特征在于，所述改造的鞭毛素蛋白包 括 FliC Δ 190-278、FliC Δ 220-320 或 FliC Δ 180-400。
3.一种改造鞭毛素蛋白的制备方法，其特征在于，将鞭毛素蛋白高变区进行缺失，所述 高变区为鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域。
4.根据权利要求3所述的改造鞭毛素蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)构建鞭毛素蛋白重组质粒；(2)以所述步骤(1)得到的鞭毛素蛋白重组质粒为模板，构建鞭毛素缺失克隆，并表达纯化。
5.根据权利要求4所述的改造鞭毛素蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)构建 鞭毛素蛋白重组质粒中所用模板为人肠道沙门氏菌J341基因组，所用引物为如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的序列连接载体为pET28。
6.根据权利要求4所述的改造鞭毛素蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)构建 鞭毛素缺失克隆所用引物为如SEQ ID NO :3至SEQ ID NO :6所示的序列，或如SEQ ID NO: 7至SEQ ID NO 10所示的序列，或如SEQID N0:11至SEQ ID N0:14所示的序列。
7.权利要求1或2所述的改造的鞭毛素蛋白作为佐剂的应用。
全文摘要
本发明提供了一种优化改造的鞭毛素蛋白及其制备方法和应用。该蛋白为缺失高变区的蛋白，高变区为鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域，该蛋白包括FliCΔ190-278、FliCΔ220-320或FliCΔ180-400。制备该蛋白，将鞭毛素蛋白高变区进行缺失，使鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域缺失。首先构建鞭毛素蛋白重组质粒；再以之为模板，构建鞭毛素缺失克隆，并表达纯化。本发明还提供了将上述改造的鞭毛素蛋白应用为佐剂。本发明的改造鞭毛素蛋白降低了其可能具有的潜在的危险性；并且通过去除其主要的免疫原性区及抗原活性区，降低它的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应。
文档编号C12N15/31GK102002098SQ20091019428
公开日2011年4月6日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者刘芳, 杨菁毅, 鄢慧民 申请人:中国科学院武汉病毒研究所