专利名称：源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法 和应用。
背景技术：
植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进 化的遗传基因型所控制，又受系统发育中生理生态因素所制约。逆境会诱导植物表达大量 的特异蛋白，不同的逆境诱导表达的蛋白不完全相同，既有交叉又有差别，而同一种逆境 在同一种植物的不同部位所诱导表达的蛋白也不完全相同，在不同的植物物种中这些蛋 白的合成差别就更大Kasuga et al.，NatureBiotechnol.，1999，17 :287-291 。因此有 很多的蛋白参与了植物对非生物逆境的反应，它们协同作用来调整植物生理代谢的变化， 从而提高植物对非生物逆境的适应性，可见植物对非生物逆境的抵抗是体内的系统反应， 并不是由一个两个功能基因就能完成的Urrutia et al.，Biochem. Biophy. Acta. , 1992, 1121 199-206]0逆境胁迫导致植物体内产生多方面的变化如抗逆基因的表达，新蛋白质 的合成，代谢的转变，抗逆境物质的积累，气孔的关闭，光合作用的降低等Smirnoff，Curr. Opin.Biotech. ，1998,9 :214_219。人们就逆境对植物影响的认识和研究，首先是从表观生理指标一般性描述开始， 其次研究植物在各种逆境下产生的生理生化、生态变化和生理调节机制，最后发展到分子 水平，进一步探讨植物对不同逆境的感应、信号传导、基因表达与调控、蛋白质组装和细胞 膜功能获得。为更深入了解植物对不同逆境响应的分子机理和研究人工调控的生物技术等 方面展示出良好前景。温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布、生长和产量Viswanathanet al.，Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol Sci. ,2002,357(1423) :877_886。在研究中人们发 现植物在长期的进化中发展了许多对温度逆境的适应能力。但目前对植物这种冷适应的机 理还不是十分清楚，因此探索植物抗寒性的遗传机理不仅在基础理论上具有重要意义，在 解决生产实际问题上也具有广泛的应用价值。抗冻蛋白(Antifreeze protein，AFP)在鱼类、昆虫及植物中均有发现，鱼类AFP 包括含糖基的AFPs (Antifreeze glycoproteins, AFGPs)和不含糖基的AFP I-IV0就目前 的研究结果看来，其抗冻活性没有昆虫的高费云标等，昆虫学报，2000，43(1) :98-102。对 于AFPs的研究可以追溯到本世纪60年代，Ramsay (1964)在黄粉甲(Tenebrio moIitor) 幼虫中发现一种导致冰点低于熔点的物质Ramsay，Phil. Trans. R. Soc. London B.，1964， 248:279-314，Grimstone 等(1968)证明这种物质是蛋白质Grimstone，Phil. Trans. R. Soc. London B.，1968,253 :343-382。由它导致的熔点与冰点之差称为热滞温度或热滞 活(Therm hysteresisactivity, THA)，这种蛋白质就被称为热滞蛋白(Therm hysteresis proteins，THPs)。在鱼类和一些植物研究中习惯地称其为抗冻蛋白即AFPs。它的研究对象 扩展到极区鱼、无脊椎动物、脊椎动物、最后又扩展到非维管植物和维管植物Barrett，IntJ. Biochem. Cell Biol. ,2001,33(2) :105_117，甚至细菌、真菌、微生物。科学家发现，原来 AFP在生物界广泛存在，是生物抵抗低温、抵御冻害的一种机制。鱼类的抗冻蛋白根据其抗冻蛋白含糖与否，人们将其分为抗冻糖蛋白 (Antifreeze glycoprotein, AFGP)和抗冻蛋白；在抗冻蛋白中又由结构的不同而分为I 型、II型、III型和IV型抗冻蛋白李树峰等，东北农业大学学报，2003，34，(1) :90_94。 有关鱼类抗冻蛋白抗冻机制已经提出多种假说，就目前研究来看，吸附抑制机制比较合理， 得到大多数学者赞同Kaye等，Plant Physiol.，1998，116 :1367_1377。其机制的模型为 一般晶体生长垂直于晶体表面，假如杂质分子吸附于冰晶生长通途的表面，那么需要外加 推动力促使冰在杂质间生长。抗冻蛋白的吸附使曲率增大，促使边缘的表面积也增加。由 于表面张力的影响，增加表面积将使体系的平衡状态发生改变，从而冰点下降。有关植物 AFPs的研究90年代初才开始报道。植物中许多冷诱导蛋白中有一小部分也类似于鱼类和 昆虫中的抗冻蛋白。人们从冷驯化的冬黑麦等叶片细胞间隙中抽提出一类蛋白，它们与植 物抗冻性有关，统称为抗冻蛋白(AFPs)唐艳梅等，山东林业科技，2005,4:76-78。昆虫抗冻蛋白(AFPs)的分子量为14 20kD，无糖基，与鱼类I型AFPs相似，含 有较多的亲水性氨基酸(例如iThr，Ser, Asx, Glx, Lys, Arg)，有40% 59%的氨基酸残基 能形成氢键，其中长椿(OncopeltusMFPs含Ser达30% ；有些昆虫AFPs类似于鱼类II型 AFPs，含有一定数量的半胱氨酸。一种甲虫(DendroidesCanadensis)AFPs Hl组分含有较 多的半胱氨酸(15. 9% )，几乎有1/2的半胱氨酸残基涉及到二硫键的生成，用DTT处理，降 低了这些二硫键，或使游离巯基烷基化，AFI^s随之失去活性。T.molitor幼虫既有含半胱氨 酸的AFPs (T3)，又有无半胱氨酸的AFPs (T4)费云标等，昆虫学报，2000，43 (1) :98-102。 云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)AFPs与鱼类(如美洲绒杜文鱼Hemitripterus americanue)II 型 AFPs有免疫交叉反应Hew et al.，Can. J. Zool. , 1983,61 :2324-2328], 说明这些鱼类和昆虫的AFPs有共同的抗原决定簇。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和 应用。将该基因转化拟南芥，进而提高转基因拟南芥的抗冻能力，该类基因对于培育植物抗 低温的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。本发明的技术方案如下一种源于昆虫抗冻肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1，其编码的蛋白质的氨基 酸序列如SEQ ID NO 2。所述源于昆虫抗冻肽基因是CFAFP3I基因。所述源于昆虫抗冻肽基因是将昆虫抗冻肽中的CFAFP3I基因按照植物偏爱密码 进行改造，利用基因合成法Xiong et al. ,NuclAcids Res，2004，32 :e98制备而成。其引 物如下CFAFP3I-1Z GAA, GGA, TCC, ATG, AAA, TGC, CTG, ATG, CTC, ATC, ATG, GCT, CTT, GCT, ATC, ATT, AAC，ACC，GTC，AGCCFAFP3I-1F
CAG, ACA, GTT, GGC, TGT, TAG, TGT, TAG, TGC, AAG, TAC, CGT, CAC, TGC, TGA, CGG, TGT，TAA，TGA，TAGCFAFP3I-2Z CAC, TAA, CAG, CCA, ACT, GTC, TGC, CAA, CAG, TAA, GTG, TGA, CAA, GAG, TAC, TCT, GAC，TAA，CTG，TTACFAFP3I-2F ACC，AGT，GCA，GGT，GGT，GCC，ATA，GAC，TTC，AGA，CTT，GTC，AAC，ATA，ACA，GTT， AGT，CAG，AGT，ACTCFAFP3I-3Z ATG，GCA，CCA，CCT，GCA，CTG，GTT，CTC，GTT，TCG，ATG，GTG，TCA，CCA，TCA，CCA， GCA，GCA，CCA，GCACFAFP3I-3F CTG，CTG，ATC，TTA，CAG，CCT，GGA，CCA，AGG，ATA，CGA，CTG，CCA，GTG，CTG，GTG， CTG，CTG，GTG，ATGCFAFP3I-4Z CCA，GGC，TGT，AAG，ATC，AGC，AGC，TGT，ATC，ATC，ACT, GGT，GGT，GTT，CCA，GCT， CCT，AGT，GCT，GCCCFAFP3I-4F AAG，GAG，CTC，TTA，GTT，GGC，AGA，GAA，GGT，GCA，GCC，ACT, GAT，CTT，ACA，GGC， AGC，ACT, AGG，AGC，TGG，AA利用BamHI和McI进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将该基因与含有双35S启 动子的植物表达载体连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因CFAFP3I的重组质粒 AH84，该表达载体还带内含子卡那霉素抗性标记基因。利用电击法将上述重组质粒AH84导入根癌农杆菌LBA4404中，农杆菌粘花法转 化将 CFAFP3I 基因转化到拟南芥中Clough et al.，The plant journal, 1998,16 (6) 735-743，验证了该转基因植物对低温的抗性，即该源于昆虫抗冻肽基因可应用于提高植 物的抗冻性中。所述源于昆虫抗冻肽基因还可应用于培育提高植物抗逆性中。有益效果本发明采用基因合成法合成了来源于昆虫抗冻肽基因，即CFAFP3I基因。为了进 一步分析该基因在低温逆境中的作用与功能，比较了转CFAFP3I基因的拟南芥植株和野生 型拟南芥植株对低温胁迫的耐受性。结果表明野生型和转CFAFP3I基因拟南芥植株在存 活率上有很大的差异，转基因植株比野生型拟南芥有明显的抗冻能力。这也表明CFAFP3I 的转入提高了拟南芥植株的抗低温的能力。
图1为基因合成法合成本发明的源于昆虫抗冻肽CFAFP3I基因的策略图。图2为基因合成法合成本发明的源于昆虫抗冻肽CFAFP3I基因的琼脂糖凝胶电泳 图，其中 M 为 2000markero
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图3为拟南芥经过转化后约两个月的生长情况图。图4为转基因与野生型拟南芥的抗冻表型图，其中WT为野生型拟南芥，84-1为转 基因拟南芥AH84的一个株系。
具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是，所述实施例仅用以说 明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明 技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试验材料及其来源包括野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型拟南芥Columbia，23°C人工气候 室培养，I^i光照培养。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a由上海市农业科学院生物技 术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq 聚合酶、连接酶、dNTP、10 XPCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所 有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989J0本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。实施例1基因合成法合成源于昆虫抗冻肽CFAFP3I基因(一 )试验方法按照植物偏爱密码重新合成昆虫抗冻肽CFAFP3I基因。CFAFP3I基因的合成引物如下CFAFP3I-1Z GAA，GGA，TCC，ATG，AAA, TGC，CTG，ATG，CTC，ATC，ATG，GCT，CTT，GCT，ATC，ATT， AAC，ACC，GTC，AGCCFAFP3I-1F CAG, ACA, GTT, GGC, TGT, TAG, TGT, TAG, TGC, AAG, TAC, CGT, CAC, TGC, TGA, CGG, TGT，TAA，TGA，TAGCFAFP3I-2Z CAC，TAA，CAG，CCA，ACT, GTC，TGC，CAA，CAG，TAA，GTG，TGA，CAA，GAG，TAC，TCT， GAC，TAA，CTG，TTACFAFP3I-2F ACC，AGT，GCA，GGT，GGT，GCC，ATA，GAC，TTC，AGA，CTT，GTC，AAC，ATA，ACA，GTT， AGT，CAG，AGT，ACTCFAFP3I-3Z ATG，GCA，CCA，CCT，GCA，CTG，GTT，CTC，GTT，TCG，ATG，GTG，TCA，CCA，TCA，CCA， GCA，GCA，CCA，GCA
CFAFP3I-3F CTG，CTG，ATC，TTA，CAG，CCT，GGA，CCA，AGG，ATA，CGA，CTG，CCA，GTG，CTG，GTG， CTG，CTG，GTG，ATGCFAFP3I-4Z CCA，GGC，TGT，AAG，ATC，AGC，AGC，TGT，ATC，ATC，ACT, GGT，GGT，GTT，CCA，GCT， CCT，AGT，GCT，GCCCFAFP3I-4F AAG，GAG，CTC，TTA，GTT，GGC，AGA，GAA，GGT，GCA，GCC，ACT, GAT，CTT，ACA，GGC， AGC，ACT, AGG，AGC，TGG，AA以 CFAFP3I-1Z-CFAFP3I-4F 为引物，利用 PCR 进行扩增 CFAFP3I 片段，在 50 μ 1 反 应体系中，内侧的六个引物浓度为1. 5pmol，外侧的两个引物浓度为30pmol。基因合成设计原则包括按植物偏爱密码子，避免基因中出现ATTTA等PolyA加 尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40 60%，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins，避免2、3位用CG和TA双 寡核苷酸(CG在植物中易造成甲基化)。PCR反应得到了一个327bp左右的片段，产物经回 收，克隆和测序。序列经BLAST比对分析表明PCR法合成的CFAFP3I基因与昆虫的抗冻肽 基因的氨基酸序列完全一致，其核苷酸序列如下ATGAAATGCC TGATGCTCAT CATGGCTCTTACACCGTCAG CAGTGACGGT ACTTGCACTACCAACTGTCT GCCAACAGTA AGTGTGACAAACTAACTGTT ATGTTGACAA GTCTGAAGTCCCTGCACTGG TTCTCGTTTC GATGGTGTCACAGCACCAGC ACTGGCAGTC GTATCCTTGGAAGATCAGCA GCTGTATCAT CACTGGTGGTCTAGTGCTGC CTGTAAGATC AGTGGCTGCACAACTAA上述CFAFP3I基因编码的氨基酸序列，以单字母表示如下MKCLMLIMAL AIINTVSSDG TCTNTNSQLS ANSKCDKSTLTNCYVDKSEV YGTTCTGSRFDGVTITSSTS TGSRILGPGC KISSCIITGGVPAPSAACKI SGCTFSAN*( 二)试验结果采用基因合成法合成的本发明的源于昆虫抗冻肽CFAFP3I基因的策略参看图1， 采用琼脂糖凝胶电泳鉴定该合成基因的产物，其结果参考图2。实施例2拟南芥转化(一)试验方法1.电击法转化农杆菌1)制备农杆菌GV3101感受态，方法参照MicroPulserTM ElectroporationApparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD 公司)[Raineri et al.，Bio. Tech.，1990，8 :33_38。
GCTATCATTA ACACTAACAG GAGTACTCTG TATGGCACCA CCATCACCAG TCCAGGCTGT GTTCCAGCTC CCTTCTCTGC
2)取50 μ L GV3101感受态细胞，加入1 μ L DNA,转入0. 2cm电击杯转化000 Ω， 2. 5KV, 25 μ f) ο加入ImL含有Iwt %甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28°C, 250rpm) 分别取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL,庆大霉素50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL) ο2.植物材料野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型拟南芥Columbia。3.拟南芥的培养1)拟南芥种子在4°C进行2-3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花 期的提前。2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9 3 0.5的比例拌勻，经高温灭菌后装于IOcm的塑 料小盆，以营养液PNS浸湿待用。3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22°C暗培养 2-3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22°C培养室中进行16小时光照培养。4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视 情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2-lOcm(少数 已经开花)可用于转化何玉科，巩振辉，细跑生物学杂志，1991，13(3) :97-101。4.拟南芥蘸花法转化1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约5 10秒后取出，全部转化完毕后， 托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室低光强度 下生长M小时，即可正常培养。2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花 发育的不同时期进行转化，提高转化效率。3)生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。5.拟南芥转化植株种子的筛选1)称25_30mg种子放入1. 5mL离心管。2) ImL 75wt%乙醇消毒Imin (不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒，去上清。3)加入ImL过滤后的漂白粉消毒15min (不停摇晃振荡，充分消毒)，SOOOrpm离心
5秒，去上清。4)无菌水洗涤3-4次。5)将种子均勻的播撒到1/2MS平板(Hyg 50 μ g/mL)上，ParafiIm膜封口，4°C冰 箱放置两天，220C，16小时光照培养6天。6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(Tl) 继续培养，并收集种子进行T2代和T3代筛选。(二)试验结果拟南芥经过蘸花法转化后生长约两个月后，可以正常开花结子，参见图3。实施例3本发明的昆虫抗冻肽CFAFP3I基因转化植物后的抗冻分析(一)试验方法将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22°C生长两个星期。然后将野生型和转基因培养皿小苗用于低温抗性实验。将野生型和转基因培养皿小苗在4°C冰 箱下培养48小时，然后放到_20°C冷冻30min，然后再放回4°C冰箱放置过夜恢复，第二天再放回 培养室恢复培养。结果表明野生型和转基因拟南芥培养皿小苗的存活率有很大的差异。
0109](二)试验结果
0110]经过抗冻处理的转基因与野生型拟南芥的表型差异如图4所示。
0111]附本发明所涉及的核苷酸/氨基酸序列表
0112]<110>上海市农业科学院
0113]<120>源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用
0114]<160>1
0115]<210>SEQ ID NO 1
0116]<211>327
0117]<212>DNA
0118]<213> 昆虫(Choristoneura fumiferana)
权利要求
1.一种源于昆虫抗冻肽基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根据权利要求1所述的源于昆虫抗冻肽基因，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基 酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.根据权利要求1所述的源于昆虫抗冻肽基因，其特征在于，所述基因是CFAFP3I基因。
4.权利要求1至3任一项所述的源于昆虫抗冻肽基因的制备方法，其特征在于，是将昆 虫抗冻肽中的CFAFP3I基因按照植物偏爱密码进行改造，利用基因合成方法制备而成。
5.权利要求1至3任一项所述的源于昆虫抗冻肽基因在培育提高植物抗逆性中的应用。
6.权利要求1至3任一项所述的源于昆虫抗冻肽基因在提高植物的抗冻性中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种来源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2；所述基因为CFAFP3I基因，它是将昆虫抗冻肽中的CFAFP3I基因按照植物偏爱密码进行改造，利用基因合成方法制备而成。将该基因转化拟南芥，进而提高了转基因拟南芥的抗冻能力。本发明的基因对于培育植物抗低温的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。
文档编号C12N15/84GK102108357SQ20091020067
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊爱生, 田永生, 薛永, 赵伟, 金晓芬, 高峰 申请人:上海市农业科学院