专利名称：一种新型真菌单孢分离器具的制作方法
技术领域：
此实用新型技术属于生物领域。用于人类、动物、植物的微生物真菌研究领域。
二背景技术：
19世纪50年代国外已有许多经典的真菌单孢分离技术的报道，基本是挑取法和 印记法。如Hildebrand. E.M. 1950 Bot Ben. 16(4) :181_207 ；Holton. C. S. 1951, Phytopath, 41 :511_512 ；Haskins. St. Spencer. 1962 ；Kavanagh. Τ. 1963 ；J. Dept. Eive. 60 :66_67。我国近些年的真菌单孢分离经实践验证均存在一定污染率，有的分离不够精准，有的不便操作。此技术部分相关报道有(1)周德庆真菌单孢子分离简便方法，微生物通报 1979年2期。(2)卢春达真菌单孢子快速分离方法，微生物学涌报1982年5期。(3)王国 良介绍一种改进的单孢分离技术——小玻片注射法，植物保护1986年3期。(4)袁桂荣一种 有效的真菌分离方法河南职业技术师范学报1987年2期。(5)食用真菌的单孢分离法，微 生物通报1987年6期。(6)高微微介绍一种简便的真菌单孢分离方法，中国中药杂志1992 年3期。(7)李晓大型真菌单孢子分离的研究吉林农大学报2003年3期。(8)张中键介绍 一种简单的真菌单孢子分离方法云南农大学报2003年3期。(9)林代福单孢子分离的眉毛 挑针法西北农业生物学报2003年5期。
三
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种操作方便、不产生污染的新型真菌单孢分离器具。实现上述目的的技术方案如下一种新型真菌单孢分离器具，包括载玻片、盖玻片、微型盖玻片和半球形透明 罩，以及作为溶剂的低浓度琼脂溶液，所述半球形透明罩的半球直径为9mm，且其具有 12X 12mm正方形底边。进一步地，所述微型盖玻片长X宽X厚=5X5X0. 15mm。相对于现有技术，本实用新型的真菌单孢分离器具用于分离真菌单孢时不产生污 染，且具有分离精准，操作方便的特点。使用此分离器具可对微生物真菌进行单个孢子(或 菌丝)的一步直接分离而获得其纯系。
四
图1用笔标记微型盖玻片的位置图21. 2X1. 2cm盖玻片放于载玻片划线位置图30. 5X0. 5cm微型盖玻片放在1. 2X1. 2cm盖玻片中央图4塑料半球与小盖片、盖玻片在载玻片上的位置(4a为剖视图，4b为俯视图)图5打开透明罩，用4号针头将菌悬液滴在小盖片中央图6滴好菌悬液，盖好塑料半球形透明罩待镜检图7滴好菌悬液，盖好塑料半球形透明罩待镜检(正视图)五具体实施方式
本实用新型的一种新型真菌单孢分离器具，包括载玻片、盖玻片、微型盖玻片和半球形透明罩，以及作为溶剂的低浓度琼脂溶液，其中半球形透明罩的半球直径为9mm，且其 具有12X 12mm正方形底边，微型盖玻片长X宽X厚=5X5X0. 15mm。(一)真菌单孢子(菌丝)分离的器具制备1、载片(1)市售通用载片。在长χ宽χ厚=7.5X2.5X0. Icm普通载玻片上，用优质油性记号笔的尖细端 (直径约0. 8mm)距两长边Icm处画两虚线，距两横边1. 5cm、2cm、3. 5cm画线，将相交而成 每边长0. 5cm的小正方格画成实线(见说明书附图1)，在每个小方格下标明序号，如1. 1、
1.2 、 1 . 3，2. 1 、2.2 、 2.3，3.1、3.2 、等。(2)微型载片。将通用盖玻片划切而成长X宽X厚=5X5X0. 15 (mm)的矩形。2、半球形透明罩用市售降压药“倍他乐克”(无锡生产)直径9mm半球形透明塑料包装，撕去锡纸 并剪成具每边长12mm正方形的半球形透明罩。3、其他仪器及备品超净工作台、倒置显微镜、烘箱、温箱、湿热灭菌器、一次性Iml针管、4号试敏针 头、眼科镊子、直径9cm玻璃培养皿、培养基及待分离真菌菌种、0.2%琼脂液、100万单位医 用链霉素(每瓶加5ml无菌水摇勻)、70%乙醇、0. 升汞、无菌水、5ml —次性针管配6号 针头、灭菌IOml青霉素瓶、酒精灯、记号笔等。将通用载片和微型载片分别装入培养皿，将待制平板的空培养皿放灭菌筒内用烘 箱170°C灭菌1小时，将0. 2%琼脂液、培养基、眼科镊子用121°C湿热灭菌20min。将灭菌 后降温至60°C左右的培养基每IOOml滴加5-6滴稀释链霉素液摇勻，每皿倒入上述培养基 约12ml制成培养基平板。将半球形透明罩放70%乙醇中消毒5min再转入0. 升汞液中 杀菌1 Omin后，将其用无菌水泡洗后晾干，放灭菌培养皿中备用。4、配菌悬液按常规无菌操作在超净工作台上，用5ml —次性针管配6号针头吸取灭菌的0. 2% 琼脂液5ml加入待分离真菌的试管斜面上，轻轻振动后转吸到灭菌的20ml青霉素的瓶 中.以此5ml针管反复吸、放，将真菌孢子均勻分布琼脂液中。用增减0.2%琼脂液的方法 调节直到显微镜目镜15倍、物镜10倍下每视野仅含0-3个孢子时为宜。无菌操作在超净工作台上用灭菌眼科镊子依次夹取一微型载片放到通用载片的 每个小方格上(见说明书附图2、3)，并分别以镊子盖上灭菌的半球形透明罩(见说明书附 图 4-4a，4b)。(二)操作流程用一次性Iml无菌针管配4号无菌试敏针头，吸取0. 5ml制备好的待分离0. 2%琼 脂菌悬液，一手轻微推动针管使针头孔部形成一针口大的微小液滴，一手持眼科镊子夹开 透明罩，将此小悬液滴放在微型载片中央，盖上透明罩(见说明书附图5)。用此方法依次进行，滴加多块载片(见说明书附图6、7)。 将透明罩下具悬液的各载片小心放在倒置显微镜下，分别用低倍和高倍(目镜和物镜)搜索镜检，将仅含一个待分离孢子(或菌丝)的液滴记好序号。在超净工作台上的 酒精灯旁，用灭菌眼科镊子将载有仅含一个孢子(或菌丝)小琼脂液滴的微型载片翻转放 到培养基平板上，每平板均放三片，将分离的平板置于25°C恒温箱培养。三天后将长出的菌 丝进一步镜检及鉴定，确认之后即可将目的菌转移到试管斜面培养基成为单孢分离的纯系 菌种。
权利要求一种新型真菌单孢分离器具，包括载玻片、盖玻片、微型盖玻片和半球形透明罩，以及作为溶剂的低浓度琼脂溶液，其特征是所述半球形透明罩的半球直径为9mm，且其具有12×12mm正方形底边。
2.根据权利要求1所述的新型真菌单孢分离器具，其特征是所述微型盖玻片长X 宽 X 厚=5X5X0. 15mm。
专利摘要本实用新型公开了一种真菌单孢分离器具，属于生物、医药领域，包括载玻片、盖玻片、微型盖玻片和半球形透明罩，以及作为溶剂的低浓度琼脂溶液，所述半球形透明罩的半球直径为9mm，且其具有12×12mm正方形底边。本实用新型的真菌单孢分离器具，采用半球形透明罩解决了在分离、镜检、转移等环节中待分离物易被污染的关键问题，同时还具有操作简便的特点。
文档编号C12N3/00GK201553727SQ2009200998
公开日2010年8月18日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者奚迪 申请人:奚迪