专利名称：一种果酒生物降酸新菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种干酪乳杆菌(Lacto^ciBm caseO,特别涉及一种果酒生物降 酸新菌株及其应用，命名为R35，该菌种已于2010年2月11日保藏在位于北京市朝阳区 北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.3635。
背景技术：
水果是一种营养丰富的食物、是人体膳食维生素、无机盐、纤维素、有机酸等的主 要来源，蛋白质和脂类含量低。由水果酿制的果酒，往往有机酸含量较高，尤其是有机酸组 分之一一苹果酸的酸感刺激，导致酒体酸涩、粗糙感较强，已成为果酒产业进一步拓宽市场 和规模化发展的瓶颈制约。因此，通过果酒的无伤害生物降酸来改善果酒品质是生产高质 量果酒的关键技术，也是果酒生产必须解决的重要难题。目前企业生产的果酒采用的降酸手法主要进行化学降酸，化学降酸虽有效果好、 速度快的特点，但降酸的同时引入过多的Na+和Ca2+，使酒体风味及质地明显下降，且在贮 放过程中产生不稳定的钙盐沉淀致使酒体稳定性下降。乳酸菌能利用苹果酸为底物进行苹 果酸乳酸发酵(malolactic fermentation, MLF)，在苹果酸乳酸酶的催化下，转变成酸感柔 和的乳酸。因此，应用乳酸菌的MLF生物降酸技术，可将苹果酸分解成单羧基乳酸，从而使 果酒口感柔和圆润，酸涩感降低，在果酒的酿造学中具有重要科学意义。此外，乳酸菌的代 谢活动改变了果酒中醛类、酯类、氨基酸、其它有机酸和维生素等微量成分的浓度及呈香物 质的含量，有利于酒体风味复杂性的形成，除达到生物降酸外，还可增加酒体生物稳定性， 并起到风味修饰作用，是提高果酒柔和度的重要工序，已在葡萄酒及苹果酒等酿造中广泛 应用。果酒MLF的降酸效果与乳酸菌性能、发酵条件、发酵基质中底物含量等因素有关。 降酸幅度取决于酒体中苹果酸的含量、菌株等环境条件。用于葡萄酒MLF的乳酸菌主要有 酒球菌属(Oenococcus)、明串珠菌属(.Leuconostoe)>ILff ^M (.Lactobacillus)禾口片球菌 属(Pediococcus)等。其中，葡萄酒明串株菌ileuconostoc oenos)能耐低pH值和高酒 精度，在葡萄酒的MLF中最为常见。但未见报道耐受二氧化硫的能力高于60mg/L的乳酸 菌株，更未见能在高酒精度(酒精度12士2%)、高酸度(pH值3. 0士0. 2或总酸(以苹果酸计) 1. 0士0. 2%)、高含硫(120士 10mg/L)、低生长温度(培养温度20士2°C )等不利因素同时存在 的环境下正常生长。现有乳酸菌比较适应在低含硫量(≤60mg/L)、低酒精度(≤10%)及较 低酸度(PH值≥3. 5或总酸(以苹果酸计)≤0. 8%)的条件下生长，在如此温和条件下进行 果酒的MLF降酸，往往引发酒体挥发酸含量增加、果酒色泽氧化褐变和杂菌繁殖等问题，因 此，二氧化硫等耐受能力较高的乳酸菌株是生产优质果酒的关键之一。
发明内容
针对上述果酒降酸中存在的问题和缺陷，本发明的目的是选育出一种能改善果酒 降酸效果、改善果酒口感柔和性的果酒生物降酸新菌株及其应用。
本发明的果酒生物降酸新菌株，是从自然发酵的枇杷酒中分离，并经一系列耐受 性选育得到的具有很强的耐受性能和较高的苹果酸乳酸发酵活力的一株乳酸菌株，可在含 120mg/L SOjP 13%酒精度且pH3. 5的酒体内正常生长，命名为Lacio^ciBw1S casei R35, 简称R35，已于2010年2月11日送交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 3635。另外，本发明提供的新菌株来自于自然发酵的枇杷酒中，经人工分离、筛选、驯化而得。另外，本发明提供的新菌株可在含120mg/L SO2和13%酒精度且pH值为3. 0 (或 总酸(以苹果酸计)1.0士0.2%)的酒体内正常生长，无需通过降低SO2 (≤60mg/L )或酒精 含量(≤10%)及酸度(pH ≥3. 5)来改变酒体环境，既能保证果酒的发酵品质，又能达到生 物降酸的效果。另外，本发明提供的新菌株可在含有苹果酸的果酒中通过苹果酸乳酸发酵，对酒 体进行生物降酸，达到改善口感、减少酸感刺激性、提高酒体柔和度的目的。本发明的干酪乳杆菌R35 (即果酒生物降酸新菌株)具有苹果酸乳酸发酵(MLF)功 能，能够很好的适应果酒体环境，能有效降低果酒中的苹果酸、增加挥发酯含量，从而使果 酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁；为提高果酒品质奠定基础。
本发明果酒生物降酸新菌株，命名为LacioHciBttS casei R35，简称R35，已于2010 年2月11日送交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号 为CGMCC No. 3635。图1是16SrDNA序列系统发育进化树。图2是纸层析监控苹果酸乳酸发酵(MLF)。图3液体培养显微。图4平板菌落形态。图5细胞形状图(扫描电镜)。图6细胞纵切面结构图(透射电镜)。
具体实施例方式以下将结合附图，介绍本发明果酒生物降酸新菌株R35的微生物学特征，诸如形 态学、生理生化、16S rDNA序列测定与同源性分析。(1) R35的形态学与生理学特征
权利要求
一种果酒生物降酸新菌株，该菌为乳杆菌属的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，命名为R35，该菌种已保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.3635 。
2.根据权利要求1所述的一种果酒降酸新菌株，其特征在于在具有如下一个或多个 条件的酒体内能正常生长SO2 含量120 士 10mg/L酒精度(ν/ν)12 士 2%ρΗ 值3. 3 士 0.2总酸(以苹果酸计)1.0 士 0.2%培养温度20 士 2°C。
3.根据权利要求1或2所述的一种果酒生物降酸新菌株，其特征在于CGMCCNo. 3635， R35适宜的种子发酵培养基的组分为番茄汁IOOmL,酵母膏7. 4g，牛肉膏10g，葡萄糖30g， 硫酸镁0. 36g，苹果酸钠20g，吐温lg，胰蛋白胨15g，柠檬酸铵2g，加水补足1L，25 30°C培养。
4.根据权利要求1或2所述的一种果酒生物降酸新菌株，其特征在于其制备方法包括A =CGMCC No. 3635，R35 的分离(1)以新鲜的枇杷果实为原料，经挑选、清洗、去核去皮、破碎等工艺，制成枇杷果浆， 分别调节枇杷果浆SO2浓度范围在40 100mg/L，共分7个梯度，每个梯度SO2浓度相差 10mg/L，在20-25°C于发酵罐中进行自然发酵；采用纸上层析法，定性检测枇杷酒醪发酵过 程的苹果酸乳酸含量，选择已进行苹果酸乳酸发酵(MLF)且SO2浓度高于80mg/L的样品作 为生物降酸乳酸菌的分离源；(2)在无菌条件下，对已发生苹果酸乳酸发酵的枇杷酒样进行10倍梯度稀释，选取3个 适宜的稀释度10人10_2和10_3，使得平板菌落能够彼此分开，各吸取0. ImL,涂布于ATB分离 培养基，每个稀释度做2个平行，置于28°C培养箱中恒温培养5 6d，挑取圆形稍扁平的单 菌落，在MRS平板上进行4 5次划线传代，经显微镜镜检，获得纯菌株30株；通过糖发酵 试验、吲哚试验、革兰氏染色和接触酶试验等常规检测技术，对这些菌株进行初步鉴定；首 先对30株纯化菌进行糖发酵试验和吲哚试验，结果表明发酵管中培养液均变为黄色，且无 气泡产生；吲哚试验试验均呈阴性，排除了这些菌株为大肠杆菌的可能性；后经革兰氏染 色和接触酶试验，结果表明革兰氏染色均呈阳性，接触酶试验均呈阴性，因此可初步判定所 纯化菌株为乳酸菌；最后通过纸层析法进行乳酸定性检测，有12株乳酸菌的乳酸层析点较 大且清晰，其它18株乳酸菌的乳酸层析点较小且不清晰，即其苹果酸乳酸发酵能力较弱， 可排除；最后得到12株苹果酸乳酸发酵能力较强的乳酸菌，对其进行编号并分别转移至改 良TJA斜面培养基上，于4°C条件下保藏，备用；B、CGMCC No. 3635，R35 的选育将分离得到的乳酸菌R35分别以107CFU/mL菌量接种于含总S02120mg/L、酒精度 13%(v/v)、pH值3. 0的MRS液体培养基中，于25 30°C恒温培养24小时测定菌量，同时进 行耐受18°C培养温度的试验；将所得数据用DPS数据处理软件进行统计分析，考察各菌株 对二氧化硫、酒精、PH值、低温的耐受性，筛选出能耐受如表1所示条件的CGMCC No. 3635，R35，说明干酪乳杆菌R35具有耐受高酒精度、高硫和低温能力，是1株优良的果酒生物降酸 乳酸菌；表1干酪乳杆菌R35对环境因子的耐受性.
5.根据权利要求1所述的果酒生物降酸新菌株的应用，其特征在于CGMCC No. 3635, R35能够在含有苹果酸的果酒中进行生物降酸，所述的含有苹果酸的果酒是以含有苹果酸 的水果为原料进行酒精发酵制成的。
全文摘要
本发明涉及一种果酒生物降酸新菌株及其应用，命名为R35，该菌种已于2010年2月11日保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.3635。本发明还涉及该菌株在含苹果酸的果酒中进行生物降酸的应用。本发明的干酪乳杆菌R35具有苹果酸乳酸发酵(MLF)功能，能够很好的适应果酒体环境，能有效降低果酒中的苹果酸、增加挥发酯含量，从而使果酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁；为提高果酒品质奠定基础。
文档编号C12R1/245GK101988044SQ20101017409
公开日2011年3月23日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者任香芸, 何志刚, 官雪芳, 李维新, 杨菁, 林晓姿, 魏巍 申请人:福建省农业科学院农业工程技术研究所