专利名称：用于检测食品和饮料中胡萝卜成分的引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行植物源性成分快速检测的方法，具体是一 种胡萝卜成分实时荧光PCR检测用的引物和探针序列。
背景技术：
全球经济一体化和贸易国际化的的不断扩大，对于发展中的中国，是机遇也是挑 战。目前，我国已成为世界上第五大农产品出口国，农产品进出口贸易持续增长。美国、欧 盟、日本等发达国家和地区为了维护本国的经济利益，争夺国际市场，竭力通过名目繁多的 检验项目和严格甚至苛刻的技术标准，对进口农产品设置贸易障碍，导致我国农产品出口 增长遭受较大压力。就进出口的农产品而言，合格的产品，不仅要无毒无害，满足安全卫生 要求；而且要无搀杂搀假，满足品质要求。其中品质合格，又主要包含两方面的含义1.原 料来源与标签一致。2.组分含量与标签一致。欧盟自2006年1月1日起开始实施新的食 品卫生法规，新法规突出了食品生产过程中的可追溯管理与食品的可追溯性，强调食品的 身份鉴定标识与健康标识。我国国家标准GB 7718-94《食品标签通用标准》和国家出入境 检验检疫局发布的《进出口食品标签管理办法》，也明确提出食品标签标注内容应与食品相 符。为此，国家质检总局专门发文，要求严厉打击制假制劣的违法行为，对假冒伪劣产品要 依法没收并监督销毁，追查生产源头和去向，严防流入消费环节。在食品和饮料的生产与销售中，产品无标签或标签不规范，利用掺杂掺假、以次充 好等手段欺骗消费者谋取暴利的事件，国内、国外均屡屡发生。各种原料被加工成食品和饮 料成品后，已无法从外观对其组成进行鉴定。生产者受利益驱动，擅自改变产品组成，或掺 入价廉的替代品，或直接减少原料用量，导致产品的真实属性与标签不符。这种造假行为不 仅仅涉及经济、营养价值，更直接影响着消费者的健康，可能引发食源性过敏反应。胡萝卜是一种质脆味美的家常蔬菜，素有“小人参”之称，其富含糖类、脂肪、挥发 油、胡萝卜素、维生素A、维生素Bi、维生素B2、花青素、钙、铁等多种营养成分，常作为食品 配料用于制作各种糕点、面食和饮料。胡萝卜虽营养丰富，但同时也是一种常见的食物过敏 原。有文献报道，胡萝卜、苹果、大豆、榛子、猕猴桃、小麦是柏林人最常见的食物过敏原。瑞 士专家报道，大约25%的食物过敏者会对胡萝卜产生过敏反应。《亚运食品安全食品过敏原 标识标注》地方技术规范已于2009年颁布实施，规范列出可导致过敏反应的食品名单，要求 含有名单上过敏原的亚运食品必须如实标注，胡萝卜位列其中。鉴于此，尽快建立可靠有效 的胡萝卜成分检测方法，确保食物标签真实准确，对于减少食源性过敏反应发生，加强食品 过敏原标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。食品中植物源性成分检测，常采用DNA检测的方法。以DNA为测试对象的方法与以 蛋白为测试对象的方法相比，在食物成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受食物基 质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样受地理条件、季节变化和加工工 艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、 重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。
发明内容
本发明的目的是针对胡萝卜抗冻蛋白，设计一组特异性引物和探针，进而建立一 种快速检测胡萝卜DNA的方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些食品检测中的局限性， 为胡萝卜成分检测提供有效工具，确保食品标签的一致性和消费者的饮食安全。本发明的主要原理为针对保守序列设计一组引物(上游引物 5' -CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3‘和下游引物5' -CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3‘)和一 条 Taqman 探针(序列为5' -FAM-TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-TAMRA-3 ‘)。进行核 酸检测时，模板DNA经加热至94-95°C—定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模 板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时 候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq 酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3' -5'外切核酸酶活性就会将探针切 断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目 的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。本发明涉及的胡萝卜实时荧光PCR检测用的引物和探针，其序列如下(1)上游引物5' -CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3‘；(2)下游引物5' -CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3‘； (3) TaqMan 探针5 ‘ -TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-3 ‘，其 5 ‘端标记 FAM 报 告荧光集团，3'端标记TAMRA淬灭荧光集团；在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的体积比为1 1 1 ；使用上述引物和探针，检测食品中胡萝卜成分的方法，依次包括下列步骤 ⑴-⑶(1)待检样品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。(2)胡萝卜的实时荧光PCR扩增A.在PCR反应管中加入2. 5μ L 10XPCR反应缓冲液(内含100mmol/L ρΗ8. 8 的三羟基甲基氨基甲烷一盐酸、500mmol/L氯化钾和1 %曲拉通Χ-100)、2 μ L 2. 5mmol/ L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物，其质量比为dUTP dATP dGTP dCTP = 2 1 1 l)、2yL 25讓ol/L硫酸镁、1 μ L 10 μ mol/L 上游引物、1 μ LlO μ mol/L 下游引 物、IyL 10 μ mol/L Taqman 探针、0. 2 μ L UNG 酶、0. 3yL Taq 酶、14 μ L ddH20(灭菌双蒸 水)，混勻。B.在PCR反应管中加入1 μ L待检样品DNA，混勻。C.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增50"C 2min, 1 个循环，激活 UNG 酶；94-950C 4min, 1个循环，灭活UNG酶，预变性；94-95"C 10_20sec ;60°C 20_40sec，45 个循环，PCR 扩增。扩增时，应设立三个对照阳性对照(取新鲜胡萝卜提取的基因组DNA)、阴性对照 (非胡萝卜基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
如待测样品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于41，阴性对照、阳性对照和空白对 照结果都成立(即阳性样品出现典型阳性扩增曲线，阴性样品和空白对照无扩增)，则可判 定该样品检出胡萝卜成分。如待测样品Ct值大于或等于45，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则 可判定该样品未检出胡萝卜成分。如待测样品Ct值在41-45之间，应重作实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct 值仍小于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品检出胡萝卜成 分；再次扩增后的结果Ct值大于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判 定该样品未检出胡萝卜成分。抗冻蛋白是具有热滞效应和冰晶重结晶抑制效应的蛋白质，在生物受到冻害胁迫 时产生，具有防止细胞受冰冻伤害的功能。1998-1999年，Dawn Worral和Knut Meyer等 先后独立在胡萝卜中发现了具有冷诱导特性的抗冻蛋白。随后，国内外学者对胡萝卜抗冻 蛋白进行了一系列研究，对不同品系胡萝卜的抗冻蛋白基因进行了克隆和转化。研究发现， 胡萝卜抗冻蛋白同其他植物的抗冻蛋白没有相似的氨基酸序列，但处于不同生存环境的胡 萝卜其抗冻蛋白基因保持了很高的种内同源性(98.5% )。本发明根据胡萝卜抗冻蛋白基 因的保守序列，设计了 一组特异性引物和一条特异性Taqman探针。该保守基因序列通过对 Genebank登录的各物种的抗冻蛋白的核酸序列的比对获得，可保证胡萝卜的检出。本发明 采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂 的加工食品和饮料中胡萝卜的检测。
图1用实时荧光PCR技术检测某待测胡萝卜面条样品DNA，样品的扩增曲线。图2用实时荧光PCR技术检测某待测番茄米粉样品DNA，样品的扩增曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1按照以下程序进行检测(1)待测胡萝卜面条样品DNA的提取A.称取0. Ig胡萝卜面条，剪碎，转至1. 5mL离心管中。加入600 μ L预热的裂解缓 冲液，轻轻混勻后，65°C水浴保温IOmin ；B.在管中加入等体积酚/氯仿600 μ L，上下颠倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液， 混勻，常温放置IOmin后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混勻，于37°C 溶解沉淀，5min后加入300 μ L缓冲液，上下颠倒混勻10次；Ε.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2min ；F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200 μ L洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；G.在离心柱中加入200yL70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一 次；H. 12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；I.将离心柱放置在一个新的1. 5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50 μ L洗脱 缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。(2)待测胡萝卜面条DNA的实时荧光PCR扩增A.在PCR反应管中加入2.5yL 10XPCR反应缓冲液(内含10(kimol/L pH8. 8 的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1 %曲拉通Χ-100)、2 μ L 2. 5mmol/ L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物，其质量比为dUTP dATP dGTP dCTP = 2 1 1 l)、2yL 25讓ol/L硫酸镁、1 μ L 10 μ mol/L 上游引物、1 μ LlO μ mol/L 下游引 物、IyL 10 μ mol/L Taqman 探针、0. 2 μ L UNG 酶、0. 3yL Taq 酶、14 μ L ddH20(灭菌双蒸 水)，混勻。B.在PCR反应管中加入1 μ L待检样品DNA，混勻。C.将PCR反应管中放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增50"C 2min, 1 个循环，激活 UNG 酶；940C 4min，l个循环，灭活UNG酶，预变性；94"C 30sec ；60°C 30sec，45 个循环，PCR 扩增。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果样品出现阳性扩增曲线，Ct值为29. 5，见图1。阴性对照(芹菜DNA)和空白对照 (水)无扩增，阳性对照(胡萝卜汁DNA)产生典型阳性扩增曲线，据此可判定该样品检出胡 萝卜成分。实施例2按照以下程序进行检测(1)待测番茄米粉样品DNA的提取A.称取0. Ig番茄米粉，转至1.5mL离心管中。加入600 μ L预热的裂解缓冲液，轻 轻混勻后，65°C水浴保温IOmin ；B.在管中加入等体积酚/氯仿600 μ L，上下颠倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液， 混勻，常温放置IOmin后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混勻，于37°C 溶解沉淀，5min后加入300 μ L缓冲液，上下颠倒混勻10次；Ε.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2min ；F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加 入200 μ L洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；G.在离心柱中加入200 μ L 70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一 次；H. 12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
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I.将离心柱放置在一个新的1. 5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50 μ L洗脱 缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。(2)待测番茄米粉DNA的实时荧光PCR扩增A.在PCR反应管中加入2· 5μ L 10XPCR反应缓冲液(内含10(kimol/LpH8. 8 的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1 %曲拉通Χ-100)、2 μ L 2. 5mmol/ L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物，其质量比为dUTP dATP dGTP dCTP = 2:1:1: l)、2yL 25 讓 ol/L 硫酸镁、1 μ L 10 μ mol/L 上游引物、1 μ LlO μ mol/L 下游引 物、IyL 10 μ mol/L Taqman 探针、0. 2 μ L UNG 酶、0. 3yL Taq 酶、14 μ L ddH20(灭菌双蒸 水)，混勻。B.在PCR反应管中加入1 μ L待检样品DNA，混勻。C.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增50"C 2min, 1 个循环，激活 UNG 酶；940C 4min，l个循环，灭活UNG酶，预变性；94"C 20sec ；60°C 30sec，45 个循环，PCR 扩增。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。样品未出现阳性扩增曲线，见图2。阴性对照(猪肉DNA)和空白对照(水)无扩 增，阳性对照(胡萝卜汁DNA)产生典型阳性扩增曲线，据此可判定该样品未检出胡萝卜成 分。
权利要求
一种胡萝卜成分快速检测用的上游引物和下游引物，其特征在于上游引物序列为5′ CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA 3′，下游引物序列为5′ CGTCTGACACCCATGAGTCTGT 3′。
2.一种胡萝卜成分快速检测用的Taqman探针，其特征在于探针序列为5' -TCAAAA CAGCCTTGAAAAACCCCACCA-3 ‘，其5 ‘端标记FAM报告荧光集团，3 ‘端标记TAMRA淬灭荧光集团。
全文摘要
本发明属于食品和饮料中植物源性成分的定性检测技术，具体地说是用于检测食品和饮料中胡萝卜成分的引物/探针组。本发明针对胡萝卜抗冻蛋白，根据其基因的保守序列，设计一组特异性引物和探针。使用该引物和探针，采用实时荧光PCR技术，可快速、灵敏、特异地检测食品和饮料中胡萝卜成分。该引物和探针也可以试剂盒的形式和其他试剂一起提供，用于核酸扩增反应。该法操作简便、重复性好。
文档编号C12Q1/68GK101921837SQ20101019511
公开日2010年12月22日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者刘彩霞, 孙敏, 徐彪, 林超, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心