专利名称：一种致病微生物快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种致病微生物快速检测试剂品。
背景技术：
近年来，重大食品安全事件频发，引起人们的高度重视。要从根本上解决食品安全问题，就必须对食品的生产、加工、流通和销售等各环节实施全程管理和监控，这就需要大量能够满足这一要求的快速、方便、准确、灵敏的食品安全分析检测技术。随着科学技术的发展，食品安全快速分析检测方法在食品卫生检验方面的作用越来越重要。从长远发展来看，免疫学、分子生物学、计算机技术与自动化等学科的发展极大地推动了食品安全分析检测方法向更灵敏更便捷的方向发展，建立高效的食品安全快速分析检测方法，对食品生产、运输、销售过程中的质量控制具有十分重要的意义；同时一旦发生食源性致病微生物中毒事件，也需要在最短时间内完成检测以制定科学合理的治疗方案，赢得治疗时间。这些快速分析检测技术的推广应用，不仅是对传统的食品安全分析检测技术的一个改进和提高，也使食品质量安全有了进一步的保证，从而推动食品工业更加健康、快速地向前发展，不断满足人民提高健康水平的需要。目前现有的一些食源性致病菌快速检测技术大多是利用免疫学方法，该方法仪器操作简单、检测速度快、灵敏度较高、特异性较好且样品所需量少，但也存在着如致病菌单克隆抗体难以制备、使用多抗易产生交叉反应出现假阳性以及一次只能检测一种或几种致病菌等缺点和不足。因此，目前还需要开发可快速地、高效地检测致病菌的新技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种致病微生物快速检测方法以及试剂盒。在本发明的第一方面，提供一种微生物快速检测方法，所述的方法包括(1)针对待检测的1-50种(较佳地2-30种，如10种、15种、20种)微生物，分别确定特异性靶基因；(2)根据步骤(1)确定的每一靶基因，分别确定其特异性的一对内侧引物(正向内侧引物(Fi)与反向内侧引物(Ri))和一对外侧引物(正向外侧引物(Fo)与反向外侧引物 (Ro))，所述内侧引物的序列既能与相应的靶基因部分互补，又能与相应的超级引物部分互补(即正向内侧引物与正向超级引物部分互补，反向内侧引物与反向超级引物部分互补)； 所述的超级引物为一引物对，正向超级引物序列如SEQ ID NO :1所示，反向超级引物序列如 SEQ ID NO :2所示；混合上述引物，得到引物混合物；(3)以待测样品为PCR模板，以步骤⑵的引物混合物为引物进行PCR反应，得到 PCR扩增体系；(4)在步骤⑶的PCR扩增体系中加入带有可检测信号的探针，所述的探针能特异性地与对应的靶基因互补，并且针对不同的靶基因可检测信号不同；
(5)鉴定可检测信号，从而确定微生物的种类。在一个优选例中，所述的微生物是致病菌(不包括病毒)。在另一优选例中，所述的反向超级引物的5’端带有一可识别信号；较佳地为生物素标记。在另一优选例中，步骤(3)中，正向超级引物的量(条数)是每一靶基因对应的引物的3-10倍；较佳地为4-6倍；更佳地为5倍，反向超级引物的量(条数)是每一靶基因对应的引物的10-50倍；较佳地为10-30倍；更佳地为20倍。在另一优选例中，反向超级引物的量是正向超级引物的4倍。在另一优选例中，所述的微生物靶基因及其对应的引物和探针如下单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)诱导肌动蛋白组装前体蛋白基因，引物如SEQ ID NO 8-11所示，探针如SEQ ID NO 12所示；志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒H抗原基因，引物如SEQ ID NO :13_16所示，探针如SEQ ID NO :17所示；沙门氏菌(Salmonella)侵袭蛋白A基因，引物如SEQ ID NO :18-21所示，探针如 SEQ ID NO 22 所示；变形杆菌(Bacillusproleus)F 型 ATP 酶 β 亚基基因，引物如 SEQ ID NO :23-26 所示，探针如SEQ ID NO 27所示；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)肠毒素T基因，引物如SEQ ID N0:33_36所示， 探针如SEQ ID NO :37所示；大肠杆菌ETEC(Escherichia coll ETEC)不耐热肠毒素AB亚单位基因，引物如 SEQ ID NO 43-46 所示，探针如 SEQ ID NO 47 所示；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)热稳定性核酸酶基因，引物如SEQ ID NO 53-56所示，探针如SEQ ID NO 57所示；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)促旋酶A亚基基因，引物如SEQ IDNO :63-66 所示，探针如SEQ ID NO 67所示；大肠杆菌0157 (Escherichia coll 0157) 0_抗原特异性基因，引物如SEQ IDNO 73-76所示，探针如SEQ ID NO 77所示；结肠弯曲杆菌(Campylobacter. Coli)含铁细胞转运相关蛋白基因，引物如SEQ ID NO 83-86所示，探针如SEQ ID NO 87所示；小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)黏附侵袭蛋白基因，引物如SEQ ID NO 88-91 所示，探针如 SEQ ID NO 92 所示；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)溶血素蛋白A基因，引物如SEQ ID N0:93_96所示， 探针如SEQ ID NO 97所示；或副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticu)耐热溶血毒素基因，引物如SEQID NO 98-101所示，探针如SEQ ID NO :102所示。在另一优选例中，同时检测多种微生物时，针对多种微生物的靶基因的引物混合后用于PCR反应。在另一优选例中，步骤(3)中，PCR反应过程如下(&)90-99°〇进行15士2111士11;
(b) 90-99°C 进行 30 士 3sec — 50-65 °C进行 2 士0. 5min — 72°C 进行 60 士 5sec ；共 10-30个循环(较佳地12-20个循环)；(c)90_99°C进行 30士3sec —65_72°C进行 90士5sec ；共 3-20 个循环(较佳地 5-8 个循环)；(d)90-"°C进行 2O 士 2sec — 50_65°C进行 2O 士 2sec — 72°C进行 3Osec ；共 25_4δ 个循环(较佳30-40个循环)；(e)72°C，3±0.5min。在另一优选例中，步骤中，所述的可检测信号是荧光微球；较佳地为纳米荧光微球。在本发明的另一方面，提供一种微生物快速检测试剂组合，所述的试剂组合包括超级引物，所述的超级引物为一引物对，正向超级引物序列如SEQ ID NO 1所示， 反向超级引物序列如SEQ ID NO 2所示；针对待检测的1-50种微生物靶基因的引物，对应于任一靶基因的引物包括一对内侧引物和一对外侧引物，所述内侧引物的序列既能与相应的靶基因部分互补，又能与相应的超级引物部分互补(即正向内侧引物与正向超级引物部分互补，即反向内侧引物与反向超级引物部分互补)；以及针对待检测的1-50种微生物靶基因的探针，所述的探针能特异性地与对应的靶基因互补且带有可检测信号，并且针对不同的靶基因可检测信号不同。在一个优选例中，针对待检测的微生物靶基因的引物和探针选自对应于单增李斯特菌诱导肌动蛋白组装前体蛋白基因的引物和探针，其中引物如 SEQ ID NO 8-11 所示，探针如 SEQ ID NO 12 所示；对应于志贺氏菌侵袭性质粒H抗原基因的引物和探针，其中引物如SEQ IDNO 13-16所示，探针如SEQ ID NO 17所示；对应于沙门氏菌侵袭蛋白A基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID N0:18_21所示，探针如SEQ ID NO 22所示；对应于变形杆菌F型ATP酶β亚基基因的引物和探针，其中引物如SEQ IDNO 23-26所示，探针如SEQ ID NO 27所示；对应于蜡样芽孢杆菌肠毒素T基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO :33-36 所示，探针如SEQ ID NO 37所示；对应于大肠杆菌ETEC不耐热肠毒素AB亚单位基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO 43-46 所示，探针如 SEQ ID NO 47 所示；对应于金黄色葡萄球菌热稳定性核酸酶基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO 53-56所示，探针如SEQ ID NO 57所示；对应于空肠弯曲杆菌促旋酶A亚基基因的引物和探针，其中引物如SEQ IDNO 63-66所示，探针如SEQ ID NO 67所示；对应于大肠杆菌01570-抗原特异性基因的引物和探针，其中引物如SEQID NO 73-76所示，探针如SEQ ID NO 77所示；对应于结肠弯曲杆菌含铁细胞转运相关蛋白基因的引物和探针，其中引物如SEQ
7ID NO 83-86 所示，探针如 SEQ ID NO 87 所示；对应于小肠结肠炎耶尔森菌黏附侵袭蛋白基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO 88-91所示，探针如SEQ ID NO 92所示；对应于霍乱弧菌溶血素蛋白A基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO :93-96 所示，探针如SEQ ID NO 97所示；或对应于副溶血性弧菌耐热溶血毒素基因的引物和探针，其中引物如SEQ IDNO 98-101所示，探针如SEQ ID NO :102所示。在本发明的另一方面，提供所述的试剂组合的用途，用于制备检测微生物的试剂
品.ο在本发明的另一方面，提供一种微生物快速检测试剂盒，含有容器；以及分装于容器中的所述的试剂组合。在一个优选例中，所述的试剂盒中还含有荧光微球，显色试剂，DNA聚合酶，稀释剂，使用说明书等。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、多重PCR嵌套引物扩增过程示意图。图2、食源性致病菌多重PCR检测流程示意图。
具体实施例方式为了克服当前食品安全分析检测技术和设备存在的缺陷，本发明人经过深入的研究，首次开发出一种新型的致病菌快速检测方法以及配套的试剂或试剂盒，所述方法和试剂能够在很短的时间内检测到多种致病菌，具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、成本低廉、样品所需量少、可高通量、适合现场筛查等特点。微生物及靶基因本发明所述的“微生物”可以是各种存在于食品中的微生物，较佳地是指对于人体或动物体有害的菌，即致病菌。较佳地，所述微生物不包括病毒。本发明所述的“靶基因(或称为目的基因)”是指特异地存在于对应的待测微生物的基因，也即所述的靶基因是其对应的微生物所特有的，某一靶基因的存在特定地指向该微生物的存在。当检测混合体系中存在的靶基因从而确定微生物的存在情况时，靶基因的选择是较为重要的，要考虑到不引起非特异性结合(会降低检测的准确率)。本发明人经过反复试验，针对需要检测的微生物，找到了具有代表性且不致于造成非特异性结合的靶基因。作为本发明的优选方式，所述的致病菌及其对应的靶基因如下所示致病菌靶基因单增李斯特菌(Listeria monocytogenes) 诱导朋动蛋白組Mf体蛋白基因(βΜ ；志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒H抗原基因(ipaH)；
沙门氏菌(Salmonella)侵袭蛋白A基因(invA)；变形杆菌(Bacillusproleus)F 型 ATP 酶 β 亚基基因(atpD)；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)肠毒素T基因(bceT)；大肠杆菌ETEC(Escherichia coli ETEC) 不耐热肠毒素AB亚单位基因Oile AB)；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus) 热稳定性核酸酶基因(nuc)；空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)促旋酶 A 亚基(gyrA)；大肠杆菌0157 (Escherichia coli 0157) 0-抗原特异性(rfl^)；结肠弯曲杆菌(Campylobacter. Coli)含铁细胞转运相关蛋白(⑶此)；小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia黏附侵袭蛋白(ail)；enterocolitica;霍乱弧菌(Vibriocholerae)溶血素蛋白 A(hlyA)；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticu) 耐热溶血毒素(tlh)。较佳地，所述的靶基因可选自以上的ー种或多种。具体根据所需检测出的微生物 的种类来进行选择。检测试剂和试剂盒针对所需检测出的微生物的靶基因，来设计合适的扩增引物以及探针。引物和探 针的设计方法可參照现有的技木。然而，由于需要同时检测多种微生物的靶基因，PCR反应 体系复杂，因此设计引物的时候，还需要考虑减少非特异性结合的发生机率以及良好的扩 增效果。在本发明中，在同一 PCR反应体系里加上两对以上引物，可同时扩增出多个核酸 片段，从而高效地測定多个靶基因。针对拟測定的食源性致病菌的靶基因，为每个靶点设 计两对巢式多重PCR特异性引物(即内侧引物Fi/Ri和外侧引物R)/Ro)，用于扩增特定细 菌的靶基因(目的基因)，參照图1。在PCR检测体系中，特异性引物的添加量极低，仅在 刚开始的几个循环中用来扩增靶点，该引物带有标签序列(可与超级引物部分互补)，可被 超级引物识别。所述的部分互补是指正向内侧引物与正向超级引物之间有20-100% (较 佳地30-80%，如40%、50%、60% )的序列是互补的，反向内侧引物与反向超级引物之间有 20-100% (较佳地30-80%，如40%、50%、60% )的序列是互补的。针对特异性引物携帯的标签序列设计超级引物(正向超级引物和反向超级引 物)。在反应体系中，加入足够满足指数级扩增的超级引物，该引物能在特异性引物开始扩 增几个循环以后快速识别标签序列，进ー步批量扩增目的片段。对于每种致病菌使用的超 级引物在序列上均相同，从而大大减少检测结果的背景干扰，提高检测灵敏度。由于超级引 物就ー对序列，因此可知当检测多种靶基因吋，多个靶基因对应的各正向内侧引物有一段 序列是相同的。通过反复试验，本发明人找到了理想的超级引物，针对每ー靶基因的引物以及探 针，如表2中所列。所述的超级引物、靶基因引物和探针组成了检测微生物的试剂组合。较佳地，所述的反向超级引物还携带一可识别信号，用于相对定量地确定样本中 所含多种微生物之间的数量关系。更佳地，所述的可识别信号为生物素标记。更佳地，所述 的可识别信号位于反向超级引物的5’端。本发明还提供了检测微生物的试剂盒，含有容器；以及分装于容器中的所述的试剂组合。优选地，为了便于本领域技术人员使用，所述的试剂盒中还含有用于微生物培养、 DNA抽提、PCR扩增或信号检测等操作的试剂；例如荧光微球，显色试剂，DNA聚合酶，稀释剂，培养基等。此外，所述的试剂盒中还含有使用说明书等。检测方法本发明提供了针对同一样品体系快速高效地检测或鉴定多种微生物的方法。本发明中，除非另外说明，所述的“样品”是广义的，其可以是任何需要从中鉴定出是否存在微生物的物质或体系，如可以是但不限于各种液体或固态食品、药品、体液、组织， 该样品还可以是哺乳动物(包括人)的分泌物或排泄物，如呕吐物、粪便、唾液、尿液等。本发明的方法基于待检测的微生物中是否存在某一靶基因来鉴定。因此，待测样品需要进行适当的预处理以使细胞释放出靶基因，从而使得靶基因可被识别。使得细胞释放出靶基因的方法是本领域技术人员所熟知的，常规地可采用裂解细胞的方法。作为本发明的一种优选方式，可通过沸水浴处理样品，使得微生物释放出靶基因的核酸。通常而言， 针对革兰氏阴性菌，用煮沸的方法即可破解细胞；而对革兰氏阳性菌，则还需要添加玻璃珠，并剧烈振荡才可破解细胞。本发明的检测方法可以同时检测多种微生物，可以根据需求进行不同微生物的拆分和组合。一般是1-50种，较佳地2-30种，如10种、15种、20种。较佳地，检测选自大肠杆菌0157、结肠弯曲杆菌、大肠杆菌ETEC、沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎、耶尔森菌的一种或多种微生物；较佳地，同时检测上述微生物。针对每一种微生物确定至少一种特异性的靶基因，根据每一靶基因来分别设计引物，当用于扩增时将所有的靶基因引物合并，并与超级引物合并，用于进行PCR扩增。超级引物的量是足够多的，以大批量地扩增目的片段。作为本发明的优选方式，相对于每一靶基因，超级引物的量(条数)是每一靶基因对应的引物的3-10倍，较佳地为4-6 倍，更佳地为5倍。作为本发明的优选方式，反向超级引物的量是正向超级引物的4倍，这样可有效减少引物之间的竞争，从而提高检测的灵敏度，降低因背景干扰造成的影响。本发明的方法还提供了较佳的PCR反应条件，共分5个分步骤，包括(a) 90-990C 进行 15 士 2min ； (b) 90-99 "C 进行 30 士 3sec — 50-65 °C 进行 2 士0. 5min — 72 °C 进行 60士5sec ；共 10-30 个循环；(c) 90-99°C进行 30士3sec — 65_72°C进行 90士5sec ；共 3-20 个循环；(d)90-99°C进行 20士2sec — 50_65°C进行 20士2sec — 72°C进行 30sec ；共 25-45 个循环；(e)72°C，3 士0.5min。利用该反应条件进行PCR扩增，扩增效率高且非特异性结合少。在结束了 PCR扩增后，对获得的PCR扩增产物进行检测，以定性或定量地确定靶基因的存在情况。作为本发明的优选方式，在PCR扩增体系中加入带有可检测信号的探针，所述的探针能特异性地与对应的靶基因互补，并且针对不同的靶基因可检测信号不同；通过鉴定可检测信号，从而确定微生物的种类。作为本发明的优选方式，所述的可检测信号是荧光微球，较佳地为纳米荧光微球。 荧光微球可以是多种色彩编码的，针对于每一种探针设定一种具有独特色彩编码的荧光微球，从而通过显色区分出该探针所对应的靶基因。本发明的方法可应用于多方面的检测用途，包括但不限于检测食品药品中的微生物；检测哺乳动物(包括人)的分泌物，如呕吐物、粪便、唾液、尿液等中是否存在微生物。 较佳地，本发明的方法用于检测食品药品中的微生物和食源性中毒中的微生物，可应用于食品安全管理的各个流通环节的微生物检测。本发明的主要优点在于(1)高效性，可在同一 PCR反应管内同时检出多种病原微生物或对多个目的基因进行分型。并且，多种微生物在同一反应管内同时检出，操作步骤简单，消耗时间远远低于以前常用的检测技术，可大大节约检测成本。(2)系统性，本发明的方法适宜于成群病原体的检测，如肠道致病性细菌和无芽孢
厌氧菌。(3)准确性，本发明优化了各种反应条件，避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，大大提高了检测的准确性和灵敏度。(4)本发明的检测方法对设备要求低，特别符合临床实际需要。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。材料与方法菌种实施例中所检测的13种食源性致病菌菌株名称及菌号的详细情况如表1。表权利要求
1.一种微生物快速检测方法，其特征在于，所述的方法包括(1)针对待检测的1-50种微生物，分别确定特异性靶基因；(2)根据步骤(1)确定的每一靶基因，分别确定其特异性的一对内侧引物和一对外侧引物，所述内侧引物的序列既能与相应的靶基因部分互补，又能与相应的超级引物部分互补；所述的超级引物为一引物对，正向超级引物序列如SEQ ID NO :1所示，反向超级引物序列如SEQ ID NO 2所示；混合上述引物，得到引物混合物；(3)以待测样品为PCR模板，以步骤⑵的引物混合物为引物进行PCR反应，得到PCR 扩增体系；(4)在步骤(3)的PCR扩增体系中加入带有可检测信号的探针，所述的探针能特异性地与对应的靶基因互补，并且针对不同的靶基因可检测信号不同；和(5)鉴定可检测信号，从而确定微生物的种类。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反向超级引物的5’端带有一可识别信号。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，正向超级引物的量是每一靶基因对应的引物的3-10倍，而反向超级引物的量是每一靶基因对应的引物的10-50倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物靶基因及其对应的引物和探针如下单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)诱导肌动蛋白组装前体蛋白基因，引物如 SEQ ID NO 8-11 所示，探针如 SEQ ID NO 12 所示；志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒H抗原基因，引物如SEQ ID NO 13-16所示，探针如 SEQ ID NO 17 所示；沙门氏菌(Salmonella)侵袭蛋白A基因，引物如SEQ ID NO :18-21所示，探针如SEQ ID NO 22 所示；变形杆菌(Bacillus proleus)F型ATP酶β亚基基因，引物如SEQ ID NO :23- 所示，探针如SEQ ID NO 27所示；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)肠毒素T基因，引物如SEQ ID NO :33-36所示，探针如 SEQ ID NO 37 所示；大肠杆菌ETEC (Escherichia coli ETEC)不耐热肠毒素AB亚单位基因，引物如SEQ ID NO 43-46所示，探针如SEQ ID NO 47所示；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)热稳定性核酸酶基因，引物如SEQ ID N0: 53-56所示，探针如SEQ ID NO 57所示；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)促旋酶A亚基基因，引物如SEQ IDNO :63-66所示，探针如SEQ ID NO 67所示；大肠杆菌0157 (Escherichia coli 0157) 0-抗原特异性基因，引物如SEQ IDNO :73-76 所示，探针如SEQ ID NO 77所示；结肠弯曲杆菌(Campylobacter. Coli)含铁细胞转运相关蛋白基因，引物如SEQ ID NO 83-86所示，探针如SEQ ID NO 87所示；小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)黏附侵袭蛋白基因，引物如SEQ ID NO 88-91所示，探针如SEQ ID NO 92所示；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)溶血素蛋白A基因，引物如SEQ ID NO :93-96所示，探针如SEQ ID NO :97所示；或副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticu)耐热溶血毒素基因，引物如SEQID NO: 98-101所示，探针如SEQ ID NO :102所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应过程如下(a)90-99 °C 进行 15 士 2min ；(b)90-99°C进行 30 士 3sec — 50-65°C进行 2 士0. 5min — 72°C进行 60 士 5sec ；共 10-30 个循环；(c)90-99°C进行30士3sec — 65_72°C进行 90士5sec ；共 3-20 个循环；(d)90-99 °C进行 20 士 2sec — 50-65°C进行 20 士 2sec — 72°C进行 30sec ；共 25-45 个循环；(e)72°C，3±0.5min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的可检测信号是荧光微球。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物是致病菌。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的致病菌是食源性致病菌。
9.一种微生物快速检测试剂组合，其特征在于，所述的试剂组合包括超级引物，所述的超级引物为一引物对，正向超级引物序列如SEQ ID NO :1所示，反向超级引物序列如SEQ ID NO 2所示；针对待检测的1-50种微生物靶基因的引物，对应于任一靶基因的引物包括一对内侧引物和一对外侧引物，所述内侧引物的序列既能与相应的靶基因部分互补，又能与相应的超级引物部分互补；以及针对待检测的1-50种微生物靶基因的探针，所述的探针能特异性地与对应的靶基因互补且带有可检测信号，并且针对不同的靶基因可检测信号不同。
10.如权利要求9所述的试剂组合，其特征在于，针对待检测的微生物靶基因的引物和探针选自对应于单增李斯特菌诱导肌动蛋白组装前体蛋白基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO 8-11所示，探针如SEQ ID NO 12所示；对应于志贺氏菌侵袭性质粒H抗原基因的引物和探针，其中引物如SEQ IDNO :13-16所示，探针如SEQ ID N0:17所示;对应于沙门氏菌侵袭蛋白A基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO :18-21所示，探针如SEQ ID NO :22所示；对应于变形杆菌F型ATP酶β亚基基因的引物和探针，其中引物如SEQ IDNO 23-26 所示，探针如SEQ ID NO 27所示；对应于蜡样芽孢杆菌肠毒素T基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO :33-36所示， 探针如SEQ ID NO :37所示；对应于大肠杆菌ETEC不耐热肠毒素AB亚单位基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO 43-46所示，探针如SEQ ID NO 47所示；对应于金黄色葡萄球菌热稳定性核酸酶基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID N0 53-56所示，探针如SEQ ID NO 57所示；对应于空肠弯曲杆菌促旋酶A亚基基因的引物和探针，其中引物如SEQ IDNO :63-66所示，探针如SEQ ID NO 67所示；对应于大肠杆菌01570-抗原特异性基因的引物和探针，其中引物如SEQID NO :73-76 所示，探针如SEQ ID NO 77所示；对应于结肠弯曲杆菌含铁细胞转运相关蛋白基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO 83-86所示，探针如SEQ ID NO 87所示；对应于小肠结肠炎耶尔森菌黏附侵袭蛋白基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO 88-91所示，探针如SEQ ID NO 92所示；对应于霍乱弧菌溶血素蛋白A基因的引物和探针，其中引物如SEQ ID NO :93-96所示， 探针如SEQ ID NO 97所示；或对应于副溶血性弧菌耐热溶血毒素基因的引物和探针，其中引物如SEQ IDNO =98-101 所示，探针如SEQ ID NO :102所示。
11.权利要求9或10所述的试剂组合的用途，用于制备检测微生物的试剂盒。
12.—种微生物快速检测试剂盒，其特征在于，含有容器；以及分装于容器中的权利要求9或10所述的试剂组合。
全文摘要
本发明公开了一种微生物快速检测方法以及微生物快速检测试剂盒。本发明所述的方法和试剂能够在很短的时间内检测到多种致病菌，具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、成本低廉、样品所需量少、可高通量、适合现场筛查等特点，可用于食源性中毒及食品安全快速检测，克服了当前微生物快速检测技术和设备存在的缺陷。
文档编号C12Q1/04GK102286612SQ201010202838
公开日2011年12月21日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者吴松洁, 李井泉, 王子良, 王慧, 相丽 申请人:中国科学院上海生命科学研究院