专利名称：提高翻译效率的dna片段和包含该dna片段的重组载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于提高翻译效率的DNA片段和一种包含该DNA片段的重组载体，从而使得能从植物批量生产异源蛋白。
背景技术：
一般而言，植物具有用于生产生物药物蛋白和肽的高潜能，因为它们易于转化且作为蛋白原材料使用是经济的。迄今为止，大多数生物药物是通过转化哺乳动物细胞、细菌和真菌来生产(Ganz PR等，1996 ；Ma JK等，1999 ；Pen J，1996)。使用植物代替哺乳动物细胞、细菌或真菌生产治疗蛋白在经济和质量方面有几个优势其减小通过致病菌污染的风险、增加产率、能在种子或其它贮藏器官中生产。另外，植物具有用于商业生物药物生产的巨大潜能，因为植物是用于生产重组产物的经济来源，转基因作物的栽培、收获、贮藏和处理能利用目前的基础设施，且在投入上需要相对低的成本。因此，通过转化植物细胞以高效地生产有用的重组异源蛋白来开发植物表达系统是非常令人期待的。植物表达系统是吸引人的，因为能通过使用用于将宿主蛋白靶向到细胞器中的固有分选和靶向机制提高重组异源蛋白的表达水平，且植物表达系统也具有大规模生产植物来源的生物药物的优势。当使用植物系统生产有用的重组异源蛋白时，物种、组织、表达和回收策略的选择，及翻译后加工是决定基于植物生产的可能性的重要因素。近年来，已有很多通过细胞核的转化从植物生产有用蛋白的研究。然而，当大规模生产有用的蛋白时存在局限性，因为只有一种或少数基因转入细胞核。另外，存在一些问题当转基因插入异染色质区域时，尽管转入，但转基因不表达，或转导水平可根据插入位点变化。已进行不同的方法将基因转入线粒体、叶绿体或色素细胞以诱导大规模表达。在真核生物中，蛋白表达主要是通过在信使RNA水平转录起始、从DNA到信使RNA转录的遗传信息稳定性、转录加工和修饰调节，和次要通过在蛋白水平翻译起始和蛋白稳定性调节来调节。研究者已关注通过转化编码异源蛋白的基因进入细胞后异源蛋白的表达调节来提高有用的异源蛋白的产量。已发展强启动子以在早期加工中增加蛋白合成，尤其是在转录步骤期间。为了在转基因植物中有效表达靶基因，必须考虑几种因素，例如启动子的选择、和内含子和密码子使用。当基因转录物的量增加太多时对转基因植物系统可能是有害的。在能增加的转录量上存在局限性问题。而且，有报导指出大部分通过转录产生的mRNA不翻译为蛋白。与转录步骤的调节相比，翻译步骤的调节已知对从基因合成的蛋白的最终量有更多影响。为了大规模生产有用的异源蛋白，需要在翻译步骤而非转录步骤调节蛋白表达，且需要新的蛋白表达调节技术将异源蛋白靶向特定细胞器。本发明人进行了广泛的研究以开发通过在翻译水平增加蛋白合成来从植物大规模生产有用的异源蛋白的方法。结果，从拟南芥基因组DNA中发现一种有高翻译效率的DNA片段。当用包含该DNA片段的重组载体或用包含与该DNA片段有效连接的用于将多肽靶向ER或叶绿体的前导多核苷酸的重组载体转化植物时，增加异源蛋白的翻译效率。而且，已证实通过使用重组载体分选和稳定积累异源蛋白至ER或叶绿体来批量生产异源蛋白是可能的，从而本发明人完成本发明。发明公开内容抟术问是页因此，本发明的一个目的在于提供一种用于提高蛋白翻译效率的DNA片段。 本发明的另一个目的在于提供一种包含所述DNA片段的重组载体。本发明的又一个目的在于提供一种用重组载体转化的细胞或植物。本发明另一个目的在于提供一种用于从植物批量生产异源蛋白的方法，所述方法包括将重组载体引入植物的步骤。技术方案为达成上述目的，本发明提供一种用于提高位于下游的异源蛋白翻译效率的DNA片段，所述 DNA 片段包含具有选自 SEQ ID NO: 1-6、SEQ ID NO :8_10、SEQ ID NO :13-14 和SEQ ID NO 16的任一种核苷酸序列的多核苷酸。并且，本发明提供包含所述DNA的重组载体，所述DNA包含具有选自SEQ ID NO 1-6、SEQ ID N0:8-10、SEQ ID NO :13和14的任一种核苷酸序列的多核苷酸。在本发明重组载体的一个方面，所述DNA片段可与启动子和编码异源蛋白的多核苷酸有效(operably)连接。在本发明重组载体的另一个方面，所述DNA片段可与另外的将异源蛋白靶向和保留于植物细胞ER的多核苷酸序列有效连接。在本发明重组载体的又一个方面，将异源蛋白靶向ER的多核苷酸序列可以是编码BiP (伴侣分子结合蛋白)的多核苷酸。编码BiP的多核苷酸可具有SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列，和用于将异源蛋白保留于ER的多核苷酸序列可以是编码核苷酸序列肽HDEL (His-Asp-Glu-Leu)或 KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)的多核苷酸。在本发明又一个方面，所述重组载体还可以有效方式包含编码纤维素结合结构域(CBD)的多核苷酸。编码CBD的多核苷酸可具有SEQ ID NO 21所示的核苷酸序列。本发明还提供一种用重组载体转化的细胞。本发明还提供一种用重组载体转化的转基因植物。本发明还提供一种批量生产异源蛋白的方法，该方法包括将重组载体引入植物的步骤。在本发明一个方面，将重组载体引入植物使用选自以下的任一种进行农杆菌(Agrobacterium sp.)介导的转化、粒子枪轰击、碳化娃晶须、超声处理、电穿孔和PEG(聚
乙二醇)沉淀。在本发明另一个方面，所述植物是双子叶植物或单子叶植物。在本发明又一个方面，所述双子叶植物选自拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、番茄、中国白菜、萝卜、甘蓝、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜。在本发明另一个方面，所述单子叶植物选自水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱。有利的效果如上所示，本发明的用于提高翻译效率的DNA片段和包含该DNA片段的重组载体能提高转基因植物中异源蛋白的翻译效率。另外，如果将靶向植物的特定细胞器的前导多核苷酸以有效方式进一步加入重组载体，那么异源蛋白靶向该细胞器且能在其中稳定积累，从而使能够从植物批量生产异源蛋白。附图
简沭图Ia是说明用于在拟南芥原生质体中表达GFP融合蛋白的重组载体35Sp-UTR(筛选的 SEQ ID NO :1-50) : :GFP 的图像。
图Ib是荧光显微镜图像，其显示通过PEG-介导的转化方法将质粒35Sp_UTR(筛选的UTR NO :1-50) : :GFP引入拟南芥原生质体后在拟南芥叶中GFP的表达。图Ic是蛋白质印迹图像，其使用GFP抗体显示来自用35Sp-UTR(SEQ ID NO:1-6) : :GFP转化的拟南芥叶的GFP的表达。泳道如下泳道1，对照RbcUTR ;泳道2，5’_UTRNO I (SEQ ID NO: I);泳道3，5’ -UTR NO 2(SEQ ID NO 2);泳道4，5’ -UTR NO 6(SEQ IDNO 3) j}dt5，5’-UTR NO 7(SEQ ID NO :4) j}dt6，5’-UTR NO 24 (SEQ ID :5);和泳道 7，5’ -UTR NO 35(SEQ ID NO :6)。图2a是蛋白质印迹图像，其使用GFP抗体显示来自用35Sp_UTR(SEQ ID NO:7-11) : :GFP转化的拟南芥叶的GFP的表达。泳道如下泳道1，对照RbcUTR ;泳道2，SEQ IDNO 1 ;泳道 3，SEQ ID NO 7 ;泳道 4，SEQ ID NO 8 ;泳道 5，SEQ ID NO 9 ;泳道 6，SEQ ID 10 ;和泳道 7，SEQ ID NO :11。图2b是蛋白质印迹图像，其使用GFP抗体显示来自用35Sp_UTR(SEQ ID NO:12-15) : :GFP转化的拟南芥叶的GFP的表达。泳道如下泳道1，对照RbcUTR ;泳道2，SEQID NO 1 ;泳道 3，SEQ ID NO 12 ;泳道 4，SEQ ID NO 13 ;泳道 5，SEQ ID NO 14 ;和泳道 6，SEQ ID 15o图2c是蛋白质印迹图像，其使用GFP抗体显示来自用35Sp_UTR(SEQ ID NO:16) : :GFP转化的拟南芥叶的GFP的表达。泳道如下泳道I表示对照RbcUTR和泳道2表示 UTR SEQ ID NO :16。图3是一系列免疫印迹图像，其使用GFP抗体分析在小麦胚芽提取物系统中GFP的表达，以研究用于提高翻译效率的DNA片段是否具有在单子叶植物中增加蛋白质翻译的效果。图4是一系列图像，其说明包含本发明DNA片段和以有效方式连接的用于靶向ER的信号序列(Bip)或者Bip序列和HDEL序列的重组载体(35Sp_UTR35: :BiP:GFP:HA)和重组载体(35Sp-UTR35: :BiP:GFP:HA:HDEL)。 图5是一系列荧光显微镜图像，其显示用重组载体35Sp-UTR35: : BiP: GFP: HA(上方图板)和重组载体35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL(下方图板)转化拟南芥后在ER中GFP的表达。图6是一系列图像，其说明重组载体35Sp-UTR35: :BiP:GFP:HA:TEV:CBD和重组载体35Sp-UTR35: : BiP: GFP: HA: TEV: CBD: HDEL包含以有效方式连接的CBD和TEV位点，以在将异源蛋白靶向ER后从植物中合宜地分离异源蛋白。
图7是免疫印迹图像，其使用GPF抗体显示用重组载体35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD 和 35Sp_UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL 分别转化拟南芥原生质体后在每个时间点的GFP表达水平。图8是来自用35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD载体转化的拟南芥原生质体并使用CBD和TEV蛋白酶处理分离 的纯化GFP的免疫印迹图像。图9是一组用CBD分离和纯化GFP蛋白后的考马斯染色凝胶的图像，CBD在用35SP-UTR35: : BiP: GFP: HA: TEV: CBD: HDEL载体转化的拟南芥中表达。图IOa显示RT-PCR结果，其使用从转基因拟南芥原生质体分离的RNA和GFP引物以研究本发明的用于提高翻译效率的DNA片段是否能在转录水平调节基因表达。图IOb是免疫印迹图像，其显示来自转基因拟南芥的原生质体的GFP的表达水平以研究本发明的用于提高翻译效率的DNA片段是否能在翻译水平调节基因表达。实施发明的最佳方式作为一种用于最大化生产异源蛋白的方法，本发明人使用5’-非翻译区(5’_UTR)的核苷酸序列在翻译水平控制蛋白表达。一般而言，已知mRNA的5’ -UTR在转录后调节、mRNA转运穿过细胞核的调节以及蛋白翻译效率和mRNA稳定性的调节中具有重要作用。5’ -UTR也被称为前导序列，包含在细菌中称为Shine-Dalgarno序列(AGGAGGU)的核糖体结合位点(RBS)。5’-UTR的长度为100或更多个核苷酸长度，而3’ -UTR长得多，其长度为数千碱基。在真核生物中，有报导称核糖体结合序列是5’ -UTR的一部分。然而，它们不像Shine-DAlgarno序列具有固定位置，Shine-DAlgarno序列在原核细胞中被称为5’ -UTR的核糖体结合位点(Kozak Μ, 1987,Hamilton 等，1987, Yamauchi 等，1991, Joshi 等，1997)。蛋白生产的量取决于mRNA的翻译效率，因此在基因调节中是重要的。5’ -UTR的一般功能是使用起始密码子的邻近序列的环境控制mRNA翻译。这是用于控制翻译效率的5，-UTR 的一部分(Xiong W 等，2001 ；Rogozin IB 等，2001 ；Gallie DR 等，1989 ;Mignone F等，2002 ;Kawaguchi R等，2002，2005)。5’-UTR基因的实例是核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶(RUBISC0)的小亚基(RbcS)。为了找到一种用于提高翻译效率的方法以增加异源蛋白的生产，对拟南芥全基因组中编码的5’-UTR序列检索与核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶(RUBISC0)小亚基(RbcS)的5’-UTR基因的序列同源性。筛选出具有最高序列相似性的50个序列。为检测筛选序列的翻译效率，构建5’ -UTR: :GFP结构。通过每个5’ -UTR测量GFP的翻译效率。结果表明，筛选的50个序列中，6个5’ -UTR序列显示出最高的翻译效率。这些序列由SEQ ID NO 1-6表不。为了研究5’ -UTR核苷酸序列在蛋白翻译效率中的重要作用，对SEQ ID N0:1的5’ -UTR进行碱基置换诱变。详细地，SEQ ID NO 1的5’ -UTR的3’ -端的三个核苷酸被胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的连续碱基置换。另外，产生SEQ ID NOI的5’ -UTR的3’ -端的最后一个碱基被胸腺嘧啶置换的突变序列。而且，通过用两个胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的连续序列置换从异源蛋白起始密码子开始4位或5位的碱基(其也是SEQ ID NO 1的5’ -UTR的3’ -端区)来产生突变序列。而且，通过用胸腺嘧啶置换从SEQ ID NO : I的5’ -UTR的3’ -端开始3位的碱基产生突变序列。对以上突变UTR序列测量翻译效率。除以下突变序列外，全部蛋白显示翻译效率比Rbc的5’ -UTR的翻译效率更高用连续的胸腺嘧啶(T)核苷酸置换SEQ ID NO :1的5’-UTR的3’-端的三个碱基的突变序列，3’ -端一个碱基被胸腺嘧啶置换的突变序列，从3’ -端开始3位的碱基被胸腺嘧啶置换的突变序列和从起始密码子开始4位和5位的碱基被胸腺嘧啶置换的突变序列。此外，根据以上结果，研究具有高的蛋白翻译效率的序列之间的同源性。结果，检测到AAG或与AAG类似的序列有高的出现率。因此，本发明人产生了一种具有AAG重复的人工序列，其是在SEQ ID NO :1的5’ -UTR的3’ -端的3个核苷酸。蛋白翻译效率比5’ -UTRRbc对照组高。因此，在筛选的50个5’-UTR序列中，上述显示高翻译效率的6个序列和具有高翻、译效率的突变的5’ -UTR序列各由表4所示的下列SEQ ID NO表示。[表 4]
权利要求
1.一种用于提高位于下游的异源蛋白的翻译效率的DNA片段，所述DNA片段包含选自SEQ ID NO :1-6, SEQ ID NO :8_10、SEQ ID NO :13-14 和 SEQ ID NO 16 的任一种核苷酸序列。
2.一种重组载体，其包含用于提高翻译效率的DNA片段，所述DNA片段包含选自SEQ IDNO :1-6, SEQ ID NO :8_10、SEQ ID NO :13-14 和 SEQ ID NO 16 的任一种核苷酸序列。
3.权利要求2的重组载体，其中所述DNA片段与启动子和编码异源蛋白的多核苷酸有效连接。
4.权利要求3的重组载体，其中所述DNA片段与另外的用于将异源蛋白靶向或保留于植物细胞ER的多核苷酸有效连接。
5.权利要求4的重组载体，其中用于将异源蛋白靶向植物细胞ER的多核苷酸是SEQIDNO :18所示的编码Bip (伴侣分子结合蛋白)的多核苷酸，和用于保留异源蛋白的多核苷酸是编码妝 HDEL (His-Asp-Glu-Leu)或 KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)的多核苷酸。
6.权利要求4的重组载体，其中所述DNA片段还以有效方式与SEQID NO 21所示的编码纤维素结合结构域(CBD)的多核苷酸连接。
7.一种用于从植物批量生产异源蛋白的方法，所述方法包括将权利要求2-6中任一项的重组载体引入植物的步骤。
8.权利要求7的方法，其中将重组载体引入植物使用选自以下的任一种进行农杆菌介导的转化、粒子枪轰击、碳化硅晶须、超声处理、电穿孔和PEG(聚乙二醇)沉淀。
9.权利要求7的方法，其中所述植物是双子叶植物，选自拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、番茄、中国白菜、萝卜、甘蓝、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜；或是单子叶植物，选自水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘鹿、燕麦和洋葱。
全文摘要
本发明涉及一种用于提高翻译效率的DNA片段和一种包含该DNA片段的重组载体，更具体地说，涉及一种包含选自序列号1-6、序列号8-10、序列号13-14和序列号16的任一种碱基序列并提高位于下游的靶蛋白的翻译效率的DNA片段和一种包含该DNA片段的重组载体。本发明用于提高翻译效率的DNA片段和包含该DNA片段的重组载体能提高转基因植物中靶蛋白的翻译。另外，如果还将诱导靶向植物的特定细胞器的标记基因以有效方式加入重组载体中，那么靶蛋白靶向特定细胞器且能稳定积累，从而使能够从植物批量生产靶蛋白。
文档编号C12N15/11GK102762729SQ201080049654
公开日2012年10月31日 申请日期2010年8月25日 优先权日2009年8月31日
发明者全恩贤, 孙恩珠, 权恩惠, 罗允贞, 金容禹, 黄仁焕 申请人:螺线有限公司