专利名称：预测肝癌术后生存的实时定量pcr微阵列芯片试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，属于诊断试剂技术领域。
背景技术：
原发性肝癌(以下简称肝癌)是全球最常见的恶性肿瘤之一，在中国肝癌的发病率为肿瘤发病率的第三位，其死亡率为第二位。手术切除仍是其最主要的治疗方法，但术后长期生存尚不能令人满意。术后预后的准确评估，可以使一部分病人得到及时的辅助治疗， 从而延长术后生存。目前研究认为肿瘤发生及进展是一个多因素，多步骤参与并相互作用的复杂过程，涉及癌细胞本身及其与癌周微环境和宿主免疫状态间的相互作用，但其确切机制尚不清楚，近年来癌周微环境在肿瘤发生及进展中的作用成为肿瘤研究的热点。目前常用的预后预测标记包括肿瘤分期和组织病理学指标。其中组织病理学指标往往不能提供足够的预后信息，而肿瘤分期，如TNM分期，虽是目前最常用的肿瘤预后标记，但对肿瘤术后复发的预测尚显不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒， 用于对术后肝癌患者生存预后风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，改善患者预后。为了达到上述目的，本发明提供了一种预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，包括IL6基因扩增引物及荧光标记探针、HLA_DRA基因扩增引物及荧光标记探针、CSFl基因扩增引物及荧光标记探针、SPPl基因扩增引物及荧光标记探针以及TNF基因扩增引物及荧光标记探针。所述的IL6基因扩增引物序列正义链为GCGGCTACATCTTTGGAATCT、扩增引物序列反义链为TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC、荧光标记探针序列为CCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTC 所述的HLA_DRA基因扩增引物序列正义链为CATTTCGAAGCCACGTGACA、 扩增引物序列反义链为CACAAACAGCCCTGTGGAAC、荧光标记探针序列为 TGAGAGAGCCCAACGTCCTCATCTG。所述的CSFl基因扩增引物序列正义链为CGAGGAGGTGTCGGAGTACTGT、扩增引物序列反义链为TTGGCACGAGGTCTCCATCT、荧光标记探针序列为CCACATGATTGGGAGTGGACACCT。所述的SPPl基因扩增引物序列正义链为TCGCAGACCTGACATCCAGT、扩增引物序列反义链为GGCCTTGTATGCACCATTCA、荧光标记探针序列为TGCTACAGACGAGGACATCACCTCAC。
所述的TNF基因扩增弓丨物序列正义链为GCTCCGTGTCTCAAGGAAGTCT、扩增弓丨物序列反义链为GCCAGAATGCTGCAGGACT、荧光标记探针序列为CAGAATGCTGCAGGACTTGA。
优选地，所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒中还包括反转录系统、扩增系统和384微孔板组成。所述的反转录系统由5X反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机的6核苷酸引物组成。所述的扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成。本发明的优点为
1、本发明发现了 IL6基因、HLA_DRA基因、CSFl基因、SPPl基因以及TNF基因可以作为标志物来预测肝癌术后生存率，并提供了一个预测模型，经过大样本量独立验证，证明该预测模型可对肝癌患者转移潜能进行准确的预测和评估，从而可对患者术后生存进行准确的预测，将有助于早期识别或预测高危患者，对其进行重点检测和有效干预，为临床个体化干预治疗提供有效的依据。2、本发明提供了相应的试剂盒及荧光标记探针和引物，通过实时定量PCR微阵列芯片技术对原发性肝癌病人术后的组织mRNA水平的检测，具有高通量、高敏感性和高均一性等特征。相对于芯片技术或者分子杂交(Northern Blot)，该方法简便、快速且经济实用。
图1为肝癌转移预测模型对380例行根治性切除术的肝癌患者无瘤生存预测分析结果图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图来具体说明本发明。 实施例1、一种预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，由以下试剂组成
(1)反转录系统由5X反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机的6核苷酸引物组成。所用试剂组分来源于I^rimeScript RT reagent kit perfect Real time反转录试剂盒(Takara公司生产，型号DDR037A)；
(2)扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸(mRNA)表达定量检测混合液(Applied Biosystems 公司生产，型号TaqMan Gene expression Master mix 4369016)组成；
(3)384微孔板；
(4 ) IL6基因、HLA_DRA基因、CSF1基因、SPP1基因以及TNF基因的扩增引物和Taqman 荧光标记探针混合液，溶剂为DEPC (焦碳酸二乙酯)处理过的水，引物和探针的具体序列如下
权利要求
1.一种预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，包括IL6基因扩增引物及荧光标记探针、HLA_DRA基因扩增引物及荧光标记探针、CSFl基因扩增引物及荧光标记探针、SPPl基因扩增引物及荧光标记探针以及TNF基因扩增引物及荧光标记探针。
2.如权利要求1所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，所述的IL6基因扩增引物序列正义链为GCGGCTACATCTTTGGAATCT、扩增引物序列反义链为TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC、荧光标记探针序列为CCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTC
3.如权利要求1所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，所述的HLA_DRA基因扩增引物序列正义链为CATTTCGAAGCCACGTGACA、扩增引物序列反义链为CACAAACAGCCCTGTGGAAC、荧光标记探针序列为TGAGAGAGCCCAACGTCCTCATCTG。
4.如权利要求1所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，所述的CSFl基因扩增引物序列正义链为CGAGGAGGTGTCGGAGTACTGT、扩增引物序列反义链为TTGGCACGAGGTCTCCATCT、荧光标记探针序列为CCACATGATTGGGAGTGGACACCT。
5.如权利要求1所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，所述的SPPl基因扩增引物序列正义链为TCGCAGACCTGACATCCAGT、扩增引物序列反义链为GGCCTTGTATGCACCATTCA、荧光标记探针序列为TGCTACAGACGAGGACATCACCTCAC。
6.如权利要求1所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，所述的TNF基因扩增引物序列正义链为GCTCCGTGTCTCAAGGAAGTCT、扩增引物序列反义链为GCCAGAATGCTGCAGGACT、荧光标记探针序列为CAGAATGCTGCAGGACTTGA。
7.如权利要求1所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，还包括反转录系统、扩增系统和384微孔板组成。
8.如权利要求7所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，所述的反转录系统由5X反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机的6核苷酸引物组成。
9.如权利要求7所述的预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，所述的扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成。
全文摘要
本发明涉及一种预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒，其特征在于，包括IL6基因扩增引物及荧光标记探针、HLA_DRA基因扩增引物及荧光标记探针、CSF1基因扩增引物及荧光标记探针、SPP1基因扩增引物及荧光标记探针以及TNF基因扩增引物及荧光标记探针。本发明发现了IL6基因、HLA_DRA基因、CSF1基因、SPP1基因以及TNF基因可以作为标志物来预测肝癌术后生存率，并提供了相应的试剂盒，通过实时定量PCR微阵列芯片技术对原发性肝癌病人术后的组织mRNA水平的检测，具有高通量、高敏感性和高均一性等优点。
文档编号C12Q1/68GK102191323SQ20111009107
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者叶青海, 周海君, 周闯, 张晓飞, 王冠, 董琼珠, 贾户亮, 郑燕, 钦伦秀 申请人:复旦大学附属中山医院