专利名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 及其检测方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus,乙型肝炎病毒)属嗜肝DNA病毒科 (hepadnaviridae)，基因组长约3. 2kb,为部分双链环状DNA。乙型肝炎病毒复制的特点是 肝细胞核内有稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA)存在；有一个逆转录步骤。乙型肝炎病毒 基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜( 蛋白，病毒复制酶 (聚合酶)及一种似乎与病毒基因表达有关的蛋白质X。乙型肝炎病毒是目前发现最小的 DNA病毒。乙型肝炎病毒是急慢性病毒性肝炎的主要致病因素，感染后可导致不同程度的肝 脏损伤。由于乙肝病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、发病率 高、治疗困难等特点，多为无黄疸性且许多人为无症状的乙肝病毒携带者，不易被人重视， 人体感染后常可导致急、慢性乙型病毒性肝炎，长期的慢性感染可发展成肝硬化、甚至肝细 胞癌，是一种潜在的严重威协人类健康的传染病。因此要求对乙型肝炎病毒感染尽快针对 不同病情给以恰当的治疗。随着科技的进步，各种各样新的检测方法都应用到致病菌的检 测。现有技术中乙型肝炎病毒的快速检测方法如下1、电子显微镜技术电子显微镜技术有常规电镜法和免疫电镜法。可用电子显微镜直接观察到乙型肝 炎病毒颗粒或慢性肝炎患者的肝组织。免疫电镜还可观察到肝细胞胞浆和胞核中的HBcAg 和HBeAg，常规电镜法样品用量小、制样速度快、观察比较直观，但观察灵敏度较低，要求样 品的病毒量大[10]。而免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高，但样品制备过程较复杂，对操 作者的技能要求较高。2、免疫学技术免疫学检测方法主要是检测乙型肝炎病毒感染过程中产生的抗原抗体免疫标志 物。常规的乙型肝炎病毒免疫标志物的血清学检查为五项即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 和HBcAb。免疫学检测法主要有酶免疫法(EIA)、固相放射免疫法(SPRIA)及微粒子酶免法 (MEIA)。EIA最常用的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，是将特异性抗原或抗体吸附于 固相载体上，使其与待测样品中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加 底物显色，最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。ELISA特异性强。但ELISA检测 HBsiVg为阴性的样品也可能乙型肝炎病毒DNA为阳性。SraiA法是利用放射性同位素标记已 知的抗原或抗体。该方法灵敏度高，但由于同位素稳定性差、对环境造成污染等原因并不常 用。MEIA是近年来发展起来的一种新的抗原抗体检测技术，采用最新的荧光技术，通过测定荧光强度来检测被测物的浓度，但如果被测物抗体呈弱阳性时，则不能轻易诊断出待测物。3、基因芯片(又称DNA芯片)基因芯片技术(gene chips)又称DNA芯片(DNA chips)或生物芯片(biological chips)。其原理是将大量特定的寡核苷酸或基因片段作为探针，有规律地和高密度地排列， 固定在一块很小的支持物如硅片、玻片等，然后与待检的荧光标记样品核酸按碱基配对原 则杂交，经洗涤后通过激光共聚焦荧光系统检测杂交信号强度，再经计算机分析处理数据 从而获取样品的生物信息。将特异探针固定在载玻片上，在PCR扩增乙型肝炎病毒分型区 域时，应用荧光标记的dNRP使PCR产物带有荧光，通过将PCR产物与乙型肝炎病毒芯片杂 交后某型处的杂交点出现荧光而确定。可用于乙型肝炎病毒的基因变异、基因分型的检测。该技术具有自动化程度高、灵 敏度高、检测目的分子量少、效率高等优点，但也存在成本高、假阳性率偏高、重复性差等缺 陷。4、分子生物学方法错误！未找到引用源。核酸探针法带有标记物的DNA或RNA片段即核酸探针能与互补的核酸序列特异结合。核酸探 针的标记可用核素P32、S35、1131等，以及非放射性物质如生物素、地高辛等。乙型肝炎病 毒的核酸探针有DNA探针和RNA探针两种。核酸探针法的主要特点是敏感性、特异性都较 强。错误！未找到引用源。普通PCR法PCR法通过两段特异性寡核甘酸引物，在体外经DNA聚合酶催化，扩增与两引物互 补的DNA序列之间的区段，检测样品中是否有该序列。PCR较血清学方法更敏感，但特异性 和重复性较低，若结合斑点杂交、微孔板杂交、滤膜核酸探针杂交等核酸杂交方法和酶联免 疫等方法对PCR产物进行分析，灵敏度和特异性均可大大提高。随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的核酸扩增技术-PCR及相关技术， 由于其高敏感性和高特异性，在乙型肝炎病毒的临床检测中得到广泛应用，成为实验室诊 断的主要方法。这些以PCR为基础的检测方法，都需要花费时间对PCR扩增产物进行后处 理，PCR扩增产物中高浓度的目标DNA分子会以气溶胶的形式污染整个实验空间，由于PCR 的高度灵敏性，甚至可以检测出反应体系中10个拷贝的模板浓度，从而可能给今后的PCR 实验带来严重的假阳性；常规PCR方法是终点检测法，由于PCR反应具有平台期，无法依据 终产物对起始模板进行精确定量检测。
发明内容
本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种克服PCR扩增产物终 点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响，具有高度的特异性、灵敏度与准确性，且技 术操作简便、自动化程度高的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒。为了实现上述目的本发明采取的技术方案是一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试 剂盒，该试剂盒含有(I)PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5，一3，外切活性的DNA聚合酶、 dNTPsUOXPCR Buffer、含有Mg2+离子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙型肝炎病毒探针；乙型肝炎病毒正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示5 ‘ -TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3‘；乙型肝炎病毒反向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示5 ‘ -TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3‘；乙型肝炎病毒探针序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示 5 ‘ -CTGCGGCGTTTTAT-3‘；所述探针5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记BHQ或Eclipse荧光淬灭基团；(2)溶液A，为聚乙二醇6000 ；(3)溶液B，其中包括EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris_HCl、 NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；(4)阴性质控品，为不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm_T载体质粒DNA片段；(5)阳性质控品，为1. OX 106COpy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；(6)临界阳性质控品，为1. OX 104COpy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；(7)工作标准品，为含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的71个碱基对 的核苷酸片段的PUCm-T重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5 α中增殖；具体包括a、工作标准品1，含有约1. OX 107COpy/mL的乙型肝炎病毒I^re-S基因的非传染性 DNA片段；b、工作标准品2，含有约1. OX 106COpy/mL的乙型肝炎病毒I^re-S基因的非传染性 DNA片段；C、工作标准品3，含有约1. OX 105COpy/mL的乙型肝炎病毒I^re-S基因的非传染性 DNA片段；d、工作标准品4，含有约1. OX 104COpy/mL的乙型肝炎病毒I^re-S基因的非传染性 DNA片段。所述具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。所述PCR反应液各组分含量的配比为DEPC处理水用量27. 5 μ L ；浓度为5U/ μ L 的热启动Taq酶用量0. 3 μ L ；浓度为10mmol/L的dNIPs用量1 μ L ;10XPCR Buffer用量 5μ L ；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L、浓度为lOymol/L的乙型肝炎病毒正向引 物用量1.6yL、浓度为10 μ mol/L的乙型肝炎病毒反向引物用量1.6yL、浓度为IOymol/ L的乙型肝炎病毒探针用量1 μ L0所述聚乙二醇6000的浓度为15% ；所述SDS浓度为0. 5% ；所述1Tris-HCl的ρΗ 值为8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的浓度为0. 1%。本发明实施例还提供利用所述的试剂盒检测乙型肝炎病毒核酸的检测方法，包括 下列步骤(1)采集样品采集人血浆样品，离心分离，上清即为血清样品；(2)样品处理取待测血清100 μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm离心 lOmin，去上清，加入50 μ L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加热lOmin，再次13000rpm离 心lOmin，取上清液待测；(3)加样向装有45 μ L PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品，阴性质控品，阳性质控品，临界阳性质控品，工作标准品5 μ L，盖好管盖，5，OOOrpm离心10秒；G)PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团 种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；94 "C 5 分钟；94 °C 30 秒、58 °C 45 秒，5 个循环；94°C 30秒、58°C 45秒，35个循环，收集荧光信号，在反应程序的第三步的终了读取 荧光值；(5)分析判断Ct值小于观的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于等于观 且小于等于32的为临界阳性。进一步地，当需要绘制标准曲线时，另取4个反应管，直接加入不同浓度梯度的工 作标准品5 μ L，5，OOOrpm离心10秒，放入荧光定量PCR仪器的反应槽内。本发明还提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测引物和探针，包括如下序列组包括下述正向引物，反向引物和荧光探针的一组序列正向引物如序列表中SEQ IDN0. 1 所示5' -TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3‘，反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 所示5' -TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3 ‘，荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 3 所示5' -CTGCGGCGTTTTAT-3 ‘；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列；或者与上述序列的同源性大于85%的一组序列；或者与上述序列的碱基互补的一组序列；上述的任意一组序列可单独使用，或以所有序列组之间的任意组合形式而使用；其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光染料修饰。其中荧光探针的，5，端修饰的荧光染料可选自FAM，HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3 或 Cy5 ；3’ 端修饰的荧光染料可选自TAMRA、Eclipse, BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是本发明试剂盒利用特异性的 TaqMan探针来检测乙型肝炎病毒，检测完成后无需开盖电泳，避免了产物污染及对实验室 人员的伤害。本发明可用LNA探针，MGB探针，AUGlo 探针来实现。本发明实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时检测克服了扩 增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响，它具有高度的特异性、灵敏度与 准确性，且技术操作简便、自动化程度高，由于采用闭管操作，不需要PCR产物后处理，有效 解决PCR污染问题等特点，结果可靠。
图1是本发明实施例ι中提供的实S金结果图2是本发明实施例2中提供的实S金结果图3是本发明实施例3中提供的实S金结果图4是本发明实施例4中提供的实S金结果图5是本发明实施例5中提供的实S金结果图6是本发明实施例5中提供的标准曲线。
图中图1、图2、图3、图4和图5的横坐标表示表示循环数(Cycle number)，纵 坐标表示荧光值(Delta Rn)；图6的横坐标表示LogC(乙肝病毒起始浓度的对数值)，纵坐标表示Ct值。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方 式作进一步地详细描述。本发明提供了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，该试剂盒含有PCR反应 液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、dNTPsUOXPCR Buffer、含有Mg2+离子的溶液、乙型肝 炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙型肝炎病毒探针；溶液A，为聚乙二醇6000 ； 溶液B，其中包括EDTA、SDS、Tris-HCl、NP-40 ；阴性质控品，为不含乙型肝炎病毒I^re-S基 因的质粒DNA片段；阳性质控品，为高浓度乙型肝炎病毒基因组DNA片段；临界阳性质控 品，为低浓度乙型肝炎病毒基因DNA片段；工作标准品，为含有乙型肝炎病毒的高度保守基 因-Pre-S基因的71个碱基对的核苷酸片段的pUCm-T重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5 α 中增殖；试剂盒的制造1.试剂本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。2. PCR反应液制备(1)引物及探针设计与合成选择乙型肝炎病毒特异性保守基因Pre-S基因作为目标检测基因，通过美国国家 生物技术信息中心(NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，获得乙型肝炎病毒目前已有 的8个基因型的乙型肝炎病毒Pre-S基因序列，并在www. ebi. ac. uk/在线分别对8个基因 型的Pre-S基因序列进行序列比对，在基因区选择一段保守序列，序列如序列表中SEQ ID NO. 4 所示TTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGC CTCA，利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件BeaconDesigner 7. 0设计引物、探 针序列，引物、探针序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保乙型肝炎病毒引物、探针 序列能检测全部8个基因型序列。在本发明中，乙型肝炎病毒探针的5’端修饰的荧光染 料可选自FAM，HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ；3，端修饰的荧光染料可选自TAMRA、 Eclipse, BHQ1,BHQ2, BHQ3或DABCYL。本实施例中荧光报告基团设计为FAM，FAM的激发波 长为485nm，接收波长为527nm，淬灭集团设计为Eclipse。设计结果如下表所示
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有(I)PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、 lOXPCRBuffer、含有Mg2+离子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙 型肝炎病毒探针；乙型肝炎病毒正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示 5 ‘ -TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3‘，乙型肝炎病毒反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示 5' -TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3‘，乙型肝炎病毒探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示5' -CTGCGGCGTTTTAT-3‘； 其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y = (C/T)；O) DNA提取液；(3)阴性质控品，为不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm-T载体质粒DNA片段；(4)阳性质控品，为1.0X106COpy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；(5)临界阳性质控品，为1.0X104COpy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；(6)工作标准品，为含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的71个碱基对的核 苷酸片段的PUCm-T重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5 α中增殖。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，其中荧光 探针的5，端修饰的荧光染料选自:FAM, HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ；3，端修饰的荧 光染料选自TAMRA、Eclipse，BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提 取液由溶液A和溶液B组成；所述溶液A，为聚乙二醇6000;所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。
4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述工作 标准品包括a、工作标准品1，含有1. OX 107COpy/mL的乙型肝炎病；b、工作标准品2，含有1. OX 106COpy/mL的乙型肝炎病; C、工作标准品3，含有1. OX 105COpy/mL的乙型肝炎病; d、工作标准品4，含有1. OX 104COpy/mL的乙型肝炎病;Pre-S基因的非传染性DNA片 Pre-S基因的非传染性DNA片 Pre-S基因的非传染性DNA片 Pre-S基因的非传染性DNA片段 段 段 段。
5.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述具有 5，一 3，外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
6.根据权利要求5所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分含量的配比为DEPC处理水用量27. 5 μ L ；浓度为5U/ μ L的热 启动 Taq 酶用量 0. 3 μ L ；浓度为 IOmmol/L 的 dNTPs 用量 1 μ L ； 10 XPCR Buffer 用量 5 μ L ；浓度为25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L、浓度为ΙΟμπιοΙ/L的乙型肝炎病毒正向引物用量 1.6μ L、浓度为10 μ mol/L的乙型肝炎病毒反向引物用量1. 6 μ L、浓度为10 μ mol/L的乙型 肝炎病毒探针用量1 μ L。
7.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述聚乙二醇6000的浓度为15% ；所述SDS浓度为0. 5% ；所述Tris-HCl的ρΗ值为 8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的浓度为0. 1%。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测乙型肝炎病毒核酸的检测方法，其 特征在于，包括下列步骤(1)采集样品采集人血浆样品，离心分离，上清即为血清样品；(2)样品处理取待测血清100μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm离心IOmin, 去上清，加入50 μ L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加热lOmin，13000rpm再离心IOmin, 取上清液待测；(3)加样向装有45μ L PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品，阴性质控 品，阳性质控品，临界阳性质控品，工作标准品各5 μ L，盖好管盖，5，OOOrpm离心10秒；(4)PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、 样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；94 0C 5分钟；94 0C 30 秒、58°C 45 秒，5 个循环；94°C 30秒、58°C 45秒，35个循环，收集荧光信号，在反应程序的第三步的终了读取荧光值；(5)分析判断Ct值小于观的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于或等于观且 小于或等于32的为临界阳性。
9.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测引物和探针，包括如下的序列组 包括下述正向引物，反向引物和荧光探针的一组序列正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 所示5' -TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3‘， 反向引物如序列表中 SEQ ID N0. 2 所示5' -TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3‘， 荧光探针如序列表中SEQ ID N0. 3所示5' -CTGCGGCGTTTTAT-3‘； 或者在上述序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列； 或者与上述序列的同源性大于85%的一组序列； 或者与上述序列的碱基互补的一组序列；上述的任意一组序列可单独使用，或以所有序列组之间的任意组合形式而使用； 其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中Y = (C/T)。
10.根据权利要求9所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测引物和探针，其特征在于，其中 荧光探针的5，端修饰的荧光染料选自FAM，HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ；3，端修饰 的荧光染料选自TAMRA、Eclipse，BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。
全文摘要
本发明公开了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针，属于生物技术领域。该方法涉及一种引起人类各种急慢性及重型肝炎的病毒基因检测技术，适用于乙型肝炎病毒定性定量检测。本试剂盒包括PCR反应液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、dNTPs、10×PCR Buffer、含有Mg2+离子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物5′-TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3′、乙型肝炎病毒反向引物5′-TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3′、乙型肝炎病毒探针5′-CTGCGGCGTTTTAT-3′；试剂盒中还包括DNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒核酸，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。
文档编号C12N15/11GK102146487SQ20111009116
公开日2011年8月10日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者严晓峰, 唐景峰, 柳小英, 王业富, 白旭 申请人:武汉百泰基因工程有限公司