专利名称：通过小核糖核酸病毒直接介导的溶瘤作用治疗受试者恶性肿瘤的方法
技术领域：
本发明涉及使用病毒杀死异常细胞。也描述了筛选细胞的方法，以明确它们是否对病毒，以及药物组合物的处理敏感。本发明发现了一些在兽医方面以及在人类医学领域中的广泛应用。
背景技术：
卵巢癌是女性死亡的一个主要原因。几种恶性肿瘤均源自卵巢。卵巢上皮癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在因癌症死亡的女性中发生率居第五位，在超过65岁的女性患者的所有死亡原因中占半数。大约5%至10%的卵巢癌是家族性的，已经鉴定了 3种明显的遗传模式单纯卵巢癌，卵巢和乳腺癌，或卵巢和结肠癌。卵巢癌的最重要危险因素是一级亲属(母亲、女儿或姐妹)有患病的家族史。在女性中最高危的情况是两个或多个的一级亲属患有卵巢癌。对于1个一级亲属和一个二级亲属(外祖母、姑母)患有卵巢癌的女性危险稍微小一些。在大多数患有乳腺癌和卵巢癌综合征，或位点特异性卵巢癌的家族中，遗传基因连锁已经发现在染色体17q21上的BRCAl基因座上。BRCA2对于一些遗传性卵巢癌和乳腺癌也是起作用的，它通过遗传基因连锁被定位在染色体13ql2上。在BRCAl上携带生殖系突变的患者中，发生卵巢癌对生命的威胁大大超过了普通人群。对BRCAl上有生殖系突变的患者进行的两个回顾性研究表明，与BRCAl阴性的女性相比这些女性的生存率是提高的。在解释这些数据时，必须考虑到大多数具有BRCAl突变的女性的可能拥有卵巢癌和/或乳腺癌史的家族成员。因此，这些女性可能要警惕一些，并最好参与可早期发现癌症的癌症筛选计划中。对于高危患者，如果35岁以后已完成分娩， 可考虑采用预防性卵巢切除术。但，预防性卵巢切除术的优势尚未明确。在预防性卵巢切除术后，一小部分女性可发生原发性腹膜癌，其表现类似于卵巢癌(Xiao，C等人，2001)。上皮癌是卵巢癌最常见的类型。基质和胚细胞肿瘤相对少见，有不超过10%的病例。卵巢癌的播散通常通过局部脱落进腹腔内，然后种植在腹膜上，以及通过局部侵袭肠和膀胱进行。这种肿瘤的高度致死性是由于患病女性早期缺乏征兆。据报道在首次手术中阳性淋巴结的发生率在I期患者中高达，II期患者为50%，III期患者为74%。 肿瘤细胞也可能阻塞横隔膜淋巴管。引起的腹膜淋巴引流障碍被认为是卵巢癌腹水发生的原因之一。穿过横隔膜播散至胸膜也是很常见的。卵巢癌的预后受几个因素的影响，但多变量分析表明最重要的有利因素包括较小的年纪、良好的表现状态、细胞类型不是粘质类和透明细胞、较低的分期、分化良好的肿瘤、在任何外科减积术之前较小的病灶体积、没有腹水和在首次细胞减积手术后残余较少的肿瘤。对于I期患者，最重要的预后因素是分级，然后是致密斑的附着和大量的腹水。DNA流式细胞仪分析I期和IIA期患者可鉴定出一组高危患者。组织学上有透明细胞的患者似乎具有较差的预后。明显具有移行细胞癌成分的患者似乎有较好的预后。尽管当在诊断时测定的卵巢癌相关抗原CA 125与预后没有显著性，但当III期或IV期患者在第三个周期化疗后1个月测定时，它与生存率有很高的相关性(Rossmarm， M.G.等人，2000)。对于化疗使CA125升高的正常患者，以后CA125升高一次以上就是活动期疾病的高度预测指标，但这还不能马上进行治疗。大多数患者在就诊时疾病已经播散，因为卵巢癌一般在早期是无症状的。部分是由于这种原因，每年卵巢癌的死亡率大约是发生率的65%。即使使用以钼类为基础的组合治疗，非最佳减积的III期和IV期患者长期随访显示了不超过10%的5年生存率。然而， 该疾病的早期患者仍有很高比例可治愈。目前晚期卵巢癌的治疗包括全腹子宫切除术，仔细探查浆膜表面，并尝试除去所有病灶，通常紧接着进行包含钼类似物的化疗组合。存活率在6至40个月之间，长期存活率不超过10%。已经进行的研究，目标是鉴定在良性和恶性肿瘤中表达不同的分子。已经发现卵巢癌可表达整合蛋白ajjMoser，T.L.等人，1996 Karmistra， S. Α.等人，1995 ；Bartolazzi，Α.等人，1993)。通过与1型胶原特异结合相互作用，α 2 β工可促进人卵巢上皮癌的转移性播散(Schiro,J. Α.等人，1991 ；Cardarelli,P. Μ.等人，1992)。 以前在人胃癌上也观察到整合蛋白Ci2^表面表达的上调。Ci^1与1型胶原的相互作用可能在腹膜播种和转移中具有重要地位，Cij1的过度表达已经显示可诱发非转移性细胞出现转移性(Chan，B. M，等人，1991)。阻断α 2 β 1 已经显示出可极大的抑制1型胶原与卵巢癌的粘附。已知能够通过其复制过程诱发恶性细胞裂解的病毒是溶瘤病毒。大多数溶瘤病毒需要在相同的种属或细胞系中增殖。病毒对细胞的感染包括与细胞的附着和并可引起摄取进细胞内，这或与病毒衣壳的脱壳同时发生，随后在细胞内复制。估计具有杀死癌细胞能力的溶瘤病毒包括腺病毒亚型Egypt 101病毒，其在Hela 子宫/宫颈癌细胞系中显示有溶瘤活性，治疗胃癌、子宫癌和皮肤癌的腮腺炎病毒，新城鸡瘟病毒(NDV)，治疗卵巢癌的流感病毒，和治疗宫颈癌的腺病毒(Nemimaitis J;1999)。其他报道表明腺病毒和减毒脊髓灰质炎病毒重组体可用于治疗恶性神经胶质瘤 (例如，Andreansky S. S.，1996)，呼肠孤病毒具有活化的Ras信号通路，在人U87成胶质细胞瘤细胞和NIH-3T3细胞中显示有裂解能力(例如，Strong J. E等人，1998)。牛痘溶瘤物也已经被用于治疗黑色素瘤(II期)患者的临床实验中(Nemimaitis J.，1999)。已经报道改良的无神经毒性的单纯疱疹病毒(HSV)有希望治疗包括颅内黑素瘤和皮下人黑色素瘤的脑肿瘤(Randazzo B. R.，1997)，同时也有报道腺病毒感染可增强植物有丝分裂毒素(mitotoxin)肥皂草素对黑色素瘤细胞的杀伤力(Mtyamoorthy K.， 1997)。腺病毒识别的靶细胞受体对于不同的腺病毒类型是不同的。也就是说，例如腺病毒亚群A、C、D、E和F可识别CAR受体，而腺病毒5型(亚组C)，腺病毒2型(亚组C)和腺病毒9型(亚组D)可分别识别主要组织相容性II类分子、α ωβ2和αν整合蛋白。已知该 CAR受体可在黑色素瘤细胞系中表达。类肝素硫酸盐可被单纯疱疹1型和2型、人疱疹病毒7、腺相关病毒2型识别。人疱疹病毒7的受体是⑶4，而Epstein-Barr病毒可识别补体受体Cr2 (⑶21)。1型和2型脊髓灰质炎病毒可识别脊髓灰质炎病毒受体(Pvr)以发生细胞粘附，而呼肠孤病毒可识别唾液酸。流感A和B病毒可识别唾液酸N-乙酰神经氨酸发生细胞粘附。相反，C型流感病毒可识别唾液酸9-0-乙酰神经氨酸。牛痘病毒可识别表皮细胞生长因子受体和类肝素硫酸盐，柯萨奇病毒A13，A15，A18和A21可识别ICAM-I和补体调控蛋白DAF(⑶5 (例如， 见Shafren D. R.等人，1997)。世界专利申请No. PCT/AU00/01461描述了将识别ICAM-I 以感染细胞的柯萨奇病毒用于受试者，来裂解表达ICAM-I的黑色素瘤细胞。DAF也可被肠道病毒70识别(例如，见Flint SJ等人，(2000)Principle of Virology (病毒学原理) molecular biology (分子生物学)，pathogenesis and control (发病机理和控制)。ASM Press, Washington)。已经报道了一个对卵巢细胞传代培养的适应性，以及它们用于检测病毒的可能性进行了评估的研究(Harris，RE和Pindak，FF，1975)。在该研究中，培养的正常卵巢细胞用多种病毒进行激发，包括细小核糖核酸病毒，如柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、脊髓灰质炎病毒、艾柯病毒和心病毒及其血清型；副粘病毒如新城鸡瘟病毒、麻疹病毒、瘟热病毒；腺病毒人亚群血清型3、4、7和21 ；单纯疱疹病毒，1型；外衣病毒如Sindbis和Mararo ；呼肠孤血清型1至3 ；牛痘病毒。研究证明来自人卵巢的细胞可长期生长在细胞培养物中，并可传代的次数无法确定，以便在体外繁殖多种病毒，推荐这种培养物用于研究病毒的发病机制和病毒感染的病理学。报道进一步说明一些病毒，如脊髓灰质炎病毒和牛痘，这些已经显示可穿透人类胎盘并感染胎儿，对病毒与培养中的正常卵巢细胞之间的相互作用的研究可能是促进畸形发生研究的一种方法。转移性肿瘤的播散是与一系列粘附/去粘附事件相关，并与可调控的组织降解相关联的病理过程。与细胞外基质的粘附和通过细胞外基质的迁移对于肿瘤的侵袭是很重要的。尽管在恶性肿瘤治疗中已经取得了一些进展，但对于包括卵巢恶性肿瘤的癌症的治疗仍是对研究的一个主要挑战，仍需要一些对现有治疗方法的可替代手段。
发明内容
本发明涉及到一些观察结果，即可使用能识别α 2 β工进行细胞感染的艾柯病毒来显著杀伤异常细胞，如表达整合蛋白Cij1的癌细胞。因此，在本发明的一个方面，提供了治疗哺乳动物异常细胞的方法，包括使用有效量的病毒治疗哺乳动物，该病毒选自艾柯病毒，其修饰形式及其组合，它们可识别α 2 β i进行细胞感染，这样至少有一些细胞被病毒杀死。识别α 2 β工的单个病毒血清型可用于哺乳动物或给予其识别α 2 β工的多个不同的艾柯病毒。术语“异常细胞”在本发明中的含义是取其广义，包括恶性细胞、任何异常生长的细胞和与表达正常表现型的相同类型的细胞相应正常细胞相比任何具有整合蛋白Q2^1 异常表达上调的细胞，不管细胞是否是癌细胞以及细胞是否以异常速率增殖。因此，该术语
8包含肿瘤前期细胞和肿瘤细胞，以及最终可以或不进展成为癌细胞的细胞。例如异常生长可以是一种良性或恶性肿瘤。异常的细胞通常是恶性细胞。与发现异常细胞的周围组织相比，一般异常细胞CiJ1的表达上调。因此，该病毒一般将优先感染异常细胞，因为接触这些细胞上的Cij1的可能性更高。同样，该病毒可用来有效地靶向异常细胞。本发明的一种方法特别适合治疗卵巢癌患者或原发卵巢肿瘤已经转移的癌症。但本发明并不限于治疗这些癌症，本文所述的方法发现可应用于治疗其他癌症包括黑色素瘤和前列腺肿瘤以及乳腺癌、结肠癌、结直肠癌以及已经播散至机体其他部位的继发癌症。例如，该病毒可用于哺乳动物皮肤之外的机体部位中的黑色素瘤癌细胞。因此，本发明的方法延伸至治疗一种恶性肿瘤，该恶性肿瘤已经转移至哺乳动物中通常与艾柯病毒的感染无关的的部位或组织。该病毒一般作为活的完整病毒用于哺乳动物。可选择地是，例如使用编码病毒基因组或足以产生病毒的核酸供细胞摄取，在细胞内产生活的完整病毒。该核酸包括单个RNA 或DNA分子，或分别编码不同的病毒蛋白的多个分子。该病毒也可用来筛选异常细胞以明确，例如病毒是否适合用于治疗该细胞取自的哺乳动物，或不包含该病毒的治疗方案是否更有效。相反，不同的艾柯病毒和/或其修饰形式或其组合可采用从哺乳动物获取的细胞样本来筛选，以便选择最合适治疗哺乳动物的病因此，在本发明的另一个方面，提供了从哺乳动物筛选对诱发细胞死亡的病毒易感的异常细胞样本的方法，以评价应用病毒于哺乳动物，治疗异常细胞的病毒，该方法包括以下步骤(a)提供哺乳动物异常细胞的样本；(b)用病毒治疗该细胞足够的时间，使病毒感染细胞；并(c)确定该病毒是否已经感染，并引起至少一些异常细胞死亡；其特征在于所述的病毒选自可识别α 2β 1以感染异常细胞的艾柯病毒，和其修饰形式及其组合。也可通过检测是否能够被指定的病毒感染和杀死样本中至少一些异常细胞，选择出可用于本发明的方法中的病毒。特别是该检测通过将每种病毒与异常细胞的样本分别孵育，并测定病毒感染是否引起这种细胞死亡，涉及筛选大量不同的病毒。因此，本发明的另一个方面，提供了筛选病毒感染和引起哺乳动物异常细胞死亡能力的方法，该方法用来评估应用病毒于哺乳动物对异常细胞的治疗作用，该方法包括以下步骤(a)选择病毒；(b)用该病毒处理哺乳动物异常细胞样本足够的时间，使病毒感染细胞；并(c)测定该病毒是否已经感染并引起至少一些异常细胞的死亡；其中所述可识别α J1以感染异常细胞的病毒，选自艾柯病毒，其修饰形式及其组合。该方法也包括以下的步骤，使用另一个细胞样本，进行步骤(b)和(C)比较所选择病毒和另一种可识别Qj1以感染细胞的艾柯病毒或其修饰形式感染并引起细胞死亡的能力。
细胞死亡一般是由病毒感染细胞引起的，其原因可能是因为病毒的细胞内复制造成的细胞裂解，或由感染引发的凋亡，这最有可能是由于细胞级联反应的活化。一旦被裂解，被感染细胞胞质内容物可能从被破坏的浆膜中漏出，释放一些抗原，包括能够诱发对异常细胞的免疫反应的细胞表面抗原。因此根据本发明的方法对哺乳动物异常细胞的治疗可提高哺乳动物对异常细胞的免疫力。因此，在本发明的另一个方面，提供了在哺乳动物中诱发对表达Cij1的异常细胞产生免疫反应的方法，该方法包括用病毒感染哺乳动物的异常细胞，该病毒选自可识别 α 2 β工以感染异常细胞并至少引起一些细胞裂解的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。一般该病毒以药物组合物的形式提供，用于本发明的方法中。同样，在一个更深入的方面，提供了治疗哺乳动物异常细胞的药物组合物，其包括产生治疗细胞的病毒的接种物，这样至少有一些细胞被病毒以及药学可接受载体一起杀死，其特征在于所述的病毒选自可识别Ci2^1以感染细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。在本发明的另一个方面，提供了在生产药物的过程中使用接种物来产生病毒，这种药物是用来和病毒一起治疗哺乳动物异常细胞的，这样至少一些异常细胞被杀死，其特征在于所述的病毒选自可识别α 以感染异常细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。在本发明的另一个方面，提供了在生产药物的过程中，使用接种物产生病毒，这种药物是用来诱发哺乳动物针对异常细胞的免疫反应，其中病毒选自可识别Ci2^以感染异常细胞并杀死细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。根据本发明的方法应用的艾柯病毒一般是选自艾柯病毒EVl、艾柯病毒EV8和艾柯病毒EV22的艾柯病毒。虽然该病毒通常是一种很常见的动物艾柯病毒，但本发明不限于此，可使用改造的能够感染和杀死异常细胞的重组病毒，或例如已经被修饰以增强其感染和杀死细胞能力的病毒。相同的病毒可在不同的治疗周期中用于哺乳动物。但优选不同的病毒用于不同的治疗周期，以避免或减轻针对前面使用的病毒的任何免疫反应的潜在作用。例如病毒可局部、瘤内或全身应用于哺乳动物。该哺乳动物可以是根据本发明，需要治疗的任何哺乳动物。该哺乳动物典型地是人类。本发明的方法可用作其他治疗异常细胞的方法，如传统癌症治疗的辅助方法，或作为缺少其他治疗方法时的治疗手段。特别是本发明的方法可应用在传统治疗不适合或不实用的情况下，或是患者因为可能引起疤痕或畸形，特别是在患者的面部如鼻或唇，不接受异常细胞切除术的情况。该病毒可在异常细胞切除术之前和/或之后应用。切除术后的应用可杀死在周围组织中残余的异常细胞。因此，本发明的一个或多个实施方案提供了可替代的治疗方法，在早期和晚期恶性肿瘤的诊断之后均可应用，并进一步发现可用于杀死手术之前和之后残余的异常细胞。 使用本文所述的方案，普通技术人员能够很容易地选择一种合适的病毒用于本发明的方法中，并确定何种异常细胞对感染易感，并引起细胞的死亡。在本发明的另一个方面，提供了一种涂药器，其可将接种物应用于哺乳动物，以产生病毒治疗哺乳动物中的异常细胞，其特征在于所述的涂药器包含一个注入了接种物的区域，这样接种物可与哺乳动物接触，该病毒选自可识别Qj1以感染细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。在本说明书中，“comprise (包含)”或其变化形式如“comprises (包含)”或 “comprising(包含)”，将被理解为包含一个已述的要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤，但不排除任何其他要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤。在本说明书中提及的所有出版物在此合并为参考文献。已经包含在本说明书中的文档、法规、材料、装置、文章等的任何论述的目的仅是为了说明本发明。不能被认为任何或全部这些材料组成了以往本领域基础理论的一部分，或是与本发明相关的领域中的一般公共常识，因为在本申请的每个权利要求的优先权日之前它已经普遍存在。本发明的特征和优势将更清晰的表现在下面对本发明的优选实施方案的描述中。附图简要说明
图1显示了乳腺癌细胞表面上表面表达的ICAM-I、CAR、DAF和α 2β工水平的流式细胞仪分析。该乳腺癌细胞与交联R-藻红蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab)2片段孵育，这是在存在或缺少这些受体的相应特异单克隆抗体的情况下。从肠道病毒受体样本的几何平均数中减去交联样本的几何平均数，代表受体表达的相对水平。图2显示了肠道病毒CAV21、CVB3、EVU EV7和PVl对乳腺癌细胞的裂解性感染。 计算50%的终点滴定度，如果TCID5(l/ml终点为IO4或更高，则认为溶瘤作用很显著。图3显示了结直肠癌细胞表面上ICAM-I、CAR、DAF和α 2 β工表面表达水平的流式细胞仪分析。结肠癌细胞与交联R-藻红蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白的F(ab' )2片段孵育， 这是在存在或缺少这些受体的相应特异单克隆抗体的情况下。从肠道病毒受体样本的几何平均数中减去交联样本的几何平均数，代表受体表达的相对水平。图4显示了肠道病毒CAV21、CVB3、EV1、EV7和PVl对结直肠癌细胞的裂解性感染。 计算50%的终点滴定度，如果TCID5(l/ml终点为IO4或更高，则认为溶瘤作用很明显。图5显示了前列腺或胰腺癌细胞表面上ICAM-1、CAR、DAF和α 2 β工表面表达水平的流式细胞仪分析。前列腺或胰腺癌细胞与交联R-藻红蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白的 F(ab' )2片段孵育，这是在存在或缺少这些受体的相应特异单克隆抗体的情况下。从肠道病毒受体样本的几何平均数中减去交联样本的几何平均数，代表受体表达的相对水平。图6显示了肠道病毒CAV21、CVB3、EV1、EV7和PVl对前列腺或胰腺癌细胞的裂解性感染。计算50%的终点滴定度，如果TCID5ciAil终点为IO4或更高，则认为溶瘤作用很明显。图7显示了卵巢癌细胞表面上ICAM-I、CAR、DAF和α 2 β工表面表达水平的流式细胞仪分析。前列腺或胰腺癌细胞与交联R-藻红蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白的F(ab' )2片段孵育，这是在存在或缺少这些受体的相应特异单克隆抗体的情况下。从肠道病毒受体样本的几何平均数中减去交联样本的几何平均数，代表受体表达的相对水平。图8显示了肠道病毒CAV21、CVB3、EVU EV7和PVl对卵巢癌细胞的裂解性感染。 计算50%的终点滴定度，如果TCID5(l/ml终点为IO4或更高，则认为溶瘤作用很明显。图9A显示了用KT1稀释度的EVl感染单层卵巢癌细胞72小时的显微照相图片。 在重复进行该病毒输入的情况下，除了细胞系A2780以外的所有细胞系显示EVl (右侧)有显著的溶瘤作用水平。图9B显示了用KT1稀释度的EVl感染单层卵巢癌细胞72小时的显微照相图片。
11在重复使用多种病毒的情况下，除了细胞系SK0V-3以外的所有细胞系显示EVl (右侧)有显著的溶瘤作用水平。图10显示了 EVl对卵巢癌细胞的裂解性感染。10个细胞系中的7个被认为对EVl 的溶瘤作用易感。如果病毒滴定度(TCID5cZml)计算为IO4或更高，溶瘤作用被认为是显著的。图11显示了存在抗Cij1时EVl结合作用被抑制。存在和缺少抗Cij1或抗 DAF MAb时，[35S]-蛋氨酸标记的EVl与卵巢癌细胞系的结合作用。通过1450MicrObeta TRILUX(ffallac, Finland)液体闪烁计数测定结合的[35S]-蛋氨酸标记病毒的水平。图12显示了 EVl在存在或缺少抗α 2β iMAb时，EVl对卵巢癌细胞系0WA-42和 IGR0V-1的裂解性感染。感染后72小时，用抗α 2β iMAb预孵育的细胞仍然是完全被保护的。通过用结晶紫甲醇溶液染色来测定细胞存活率。图13显示了在存在或缺少抗α 2 β iMAb时，EVl对单层0WA-42卵巢癌细胞的裂解性感染。在感染后M、48和72小时拍摄的显微照相图片，证明由于单克隆抗体阻断Ci2^1 受体，细胞完全不受EVl感染。图14显示了 D0V13卵巢癌细胞培养在环形插入物内，HeLa细胞(人成纤维细胞) 培养在外环。用EVl感染后，活细胞用结晶紫甲醇溶液染色。EVl特异性感染卵巢癌细胞， 而HeLa细胞仍然是健康的。图15显示了黑色素瘤细胞系SkMeUS上表面表达的α 2β i水平的流式细胞仪分析。在存在或缺少抗Cij1的情况下，SkMeUS细胞与R-藻红蛋白交联的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab' )2片段孵育。从样本的几何平均数中减去交联样本的几何平均数，确定差值，由此确定受体的表达。由于几何平均数有差值，证明有显著的表达。图16显示了在存在和缺少抗α 2 β工或抗DAF MAb的情况下[35S]-蛋氨酸标记的 EVl 与 SkMeU8 黑色素瘤细胞的结合作用。在 1450Microbeta TRILUX(ffallac,Finland)上通过液体闪烁计数测定已经结合的[35S]-蛋氨酸标记病毒的水平。α 2β工的阻断可引起显著的EVl结合抑制。结果表示为三个样本的均数士标准误。图17显示了 EVl对SkMeUS黑色素瘤细胞的裂解性感染。通过结晶紫甲醇溶液测定细胞存活率。观察到有显著的裂解作用。图18是显示用EVl处理卵巢癌多细胞球状体的显微照相图片。图19A显示通过在腹膜内(i. p.)途径用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、UV-灭活艾柯病毒EVl或感染性EVl (IO5TCID50)腹膜内注射前3周给予1. OxIO6OVHS-I细胞的SCID小鼠体重变化的直方图。图19B显示了与用0VHS-1细胞注射和用PBS，UV-灭活EVl或EVl处理的小鼠相比，正常对照SCID小鼠注射后5周时拍摄的照片。注意在给予PBS或UV-灭活EVl的荷瘤小鼠中腹水的发生。优选实施方案为了确定一种病毒是否能够感染并引起肿瘤细胞的死亡，从肿瘤取活检，使用常规的技术制备细胞制剂，然后(i)证实病毒受体细胞的表面表达和(ii)用病毒激发细胞， 监测在预先确定的孵育时间内的细胞感染和细胞死亡，虽然根据使用的病毒，这个孵育时间可发生变化，但一般大约为2天。CIj1的表达很容易通过流式细胞分析来证实。大量病毒可以此方式筛选，同时，使用不同的等体积已制备的恶性细胞，选择显示有较高程度感染性和细胞死亡的病毒给予取活检的受试者。同样，从不同来源获取的活检中获得的不同的恶性细胞制剂可用于使用具体病毒的测定中。该活检可从单个个体或大量个体的不同部位获取。期望在本文所述的方法中使用的病毒仅引起接受者很少或轻微的临床症状。这种病毒很容易从普通技术人员所熟知的商业渠道获得，可用上面所述的方式，用该方法筛选其有效性。通常期望病毒是选自艾柯病毒EV1、艾柯病毒EV7、艾柯病毒EV8和艾柯病毒 EV22的艾柯病毒。这些病毒的每一种都识别α J1以感染细胞。例如EVl与轻度上呼吸道疾病和胸膜痛有关(Fields B.N.等人，2000 ；McCracken A. W.等人，1969)。相信Cij1的表达在卵巢癌上是上调的，其原因是在间皮中遇到的基质主要是I 型胶原。大量的恶性黑色素瘤也已经显示CIj1的表达水平是上调的(Kramer R. H.和 Marks N, 1989 ；Ramos D. Μ.等人，1990)。使用α 2 β i亚单位结构区I中的不同残基，EVl 和胶原附着于O2^1 (Bergelson J. H.，1993)。整合蛋白Q2^1不能同时接纳EVl和胶原。 但该病毒与α 2 β工的结合与I型胶原相比亲和性增加10倍(Xing L，2002)。为了筛选指定的病毒以明确它是否能够感染和引起恶性细胞的死亡，可使用恶性细胞系而不是从活检中分离的原代恶性细胞。已选择的病毒将优选直接注射至恶性肿瘤的多个部位上，以便将该病毒可能感染肿瘤的区域最大化。除了完整的病毒，掺入了核酸可产生病毒的病毒，或其他质粒，或表达载体可被注射进肿瘤中，以被肿瘤细胞摄取，在细胞内产生完整的病毒，使治疗发挥作用。 合适的表达载体包括能够表达编码产生病毒所需的病毒蛋白的DNA(例如，基因组DNA或 cDNA)插入物的质粒。表达载体通常包括与被插入的核酸可操作连接的转录调控序列。“可操作连接”的含义是核酸插入物与转录调控序列连接，使被插入序列转录，而不需要进入插入物的可读框内。这种转录调控序列包括促进RNA聚合酶的结合以起始转录的启动作用， 以及使核糖体与已转录的mRNA结合的表达控制元件。更特别的是，在本文使用的术语“调控序列”包含参与驱动转录和控制(即，调节) 指定DNA序列转录水平的任何DNA。例如，5'调控序列是位于编码序列上游的DNA序列， 其包含启动子和5’未翻译的引导序列。3'调控序列是位于编码序列下游的DNA序列，包含合适的转录终止(和/或)调节信号，包括一个或多个聚腺苷酸化信号。如本文所使用， 术语“启动子”包括在转录起始过程中被DNA依赖性ENA聚合酶识别并结合(直接或间接) 的任何DNA序列。启动子包括转录起始位点，和转录起始因子和RNA聚合酶的结合位点，并能够包含其他的多种位点或序列(例如，增强子)，基因表达调控蛋白可与其结合。适合转染哺乳细胞的大量表达载体在本领域中是已知的。适合转染哺乳动物细胞的表达载体包括pSV2ne0、pEF-PGkpuro、pTk2和非复制性腺病毒穿梭载体，其掺入了聚腺苷酸化位点和延伸因子1-x启动子和PAdEasy为基础的表达载体大多数优选掺入了巨细胞病毒(CMV)启动子(例如，见He等人，1998)。也可应用将多肽延伸因子-α 2作为启动子的质粒pEFBOS。通过逆转录病毒RNA基因组或其片段制备编码产生病毒所必需的病毒蛋白的 cDNA，使用本领域中熟知的重组技术掺入进合适的载体中，例如在Sambrook等人(1989)， 分子克隆实验室手册，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York,^PAueubel等人，(1994)，现代分子生物学方法，USA，第1和2卷中所述的技术。除了 cDNA，可用从纯化的病毒体中提取的病毒RNA转染细胞，或例如在体外使用噬菌体T7RNA聚合酶从xDNA模板中产生RNA转录物，后者如Ansardi，D. C.等人，2001中所述。同样，单个质粒或RNA分子可用来表达病毒蛋白和产生病毒，或多个质粒或编码不同病毒蛋白的RNA分子被用来转染细胞和产生病毒。在缺少促进细胞转染的载体运载体的情况下，或与这种运载体联合应用，质粒或 RNA可直接用于肿瘤或其局部，或通过注射被肿瘤细胞摄取。合适的载体运载体包括脂质体，其一般是以本领域中通常已知的水包油乳剂形式提供。脂质体通常包含脂类的组合，特别是磷脂，如高相变温度的磷脂，其通常具有一个或多个类固醇或类固醇前体如胆固醇，可为脂质体提供膜稳定性。可用于提供脂质体的脂类例子包括磷脂酰化合物如磷脂酰甘油、 磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、磷脂酰乙醇胺、脑苷脂和神经节苷脂。二酰基磷脂酰甘油酯特别合适，其脂类部分含有14至18个碳原子，更优选16至18个碳原子，并是饱和的。脂质体与靶细胞的相互作用是被动或主动的。主动的靶向作用涉及脂质体的修饰作用，其通过将该配体可结合的特异的配体掺入进脂质体膜，或与靶细胞表达的相应配体相互作用。这种配体包括，例如单克隆抗体或其结合片段(例如，Fab或F(ab' )2)，糖或糖脂部分，或病毒蛋白。病毒蛋白或Cij1的特异单克隆抗体是特别优选的。正常情况下，只要组织中有恶性细胞存在的可能性，肿瘤周围的组织就也可被注射或用该病毒处理。如果该肿瘤直至相对晚期才被发现，在手术切除肿瘤后，周围组织可用该病毒注射。除了被直接注射进恶性肿瘤中，该接种物可被全身给药，在肿瘤部位邻近的位置通过静脉注射至接受者的血流中以输送至肿瘤。同样，该接种物可被皮下或腹膜内给药，或例如，如果认为合适可肌肉内给药。但一般当使用完整的病毒时，只要有存在病毒特异抗体的可能，就优选直接将病毒注射进肿瘤中，该抗体有可能降低各种可交替使用的病毒输送方式的效率。接种物也可单独或与将接种物直接注射入肿瘤联合使用局部应用于肿瘤。局部治疗可通过逐滴应用药物组合物来完成，该组合物含有接种物和合适的药学可接受载体， 以保持接种物的完整性以便感染恶性细胞，或使用一种充满了这种组合物的涂药器涂抹肿瘤。该涂药器可含有一团或一块浸过组合物的合适材料的填充物。在治疗皮肤上的黑色素瘤时，使用充满接种物的涂药器来应用接种物，该涂药器置于被治疗的恶性肿瘤部位，这样接种物能与皮肤接触。在这种情况下，涂药器含有一种贴片或一团填充物等，其中充满了接种物，可进一步提供粘合表面或多种表面，如附着于黑色素瘤周围的皮肤上的粘的膏药，这样可使接种物保持与黑色素瘤的接触。一般可给予哺乳动物完整的病毒以发挥治疗效应。通常可在恶性肿瘤上和/或周围组织上作一个或多个小的切口，为病毒进入其中提供入口。对于卵巢癌，或卵巢附近的癌症，艾柯病毒可使用导管或其他合适的给药装置，通过将导管或选择的装置沿输卵管插入，直接输送至卵巢或受累部位。在靶细胞内使用病毒和/或核酸或含有能产生病毒的病毒核酸的质粒来接种受者所使用的药学可接受载体可以是液体，如生理盐水，或被认为适合的任何其他传统已知的生理可接受的介质，如市售的适合作为药物应用，并可将接种物施于治疗部位的各种凝
14胶。该载体一般可被缓冲至生理PH，并可含有合适的防腐剂和/或抗生素。该接种物一般含有大约IxlO2至大约IxIOki空斑形成单位/ml接种物。优选，该接种物含有大约超过IxlO5空斑形成单位/ml接种物。主治医生或外科医生可根据公认的医学实践经验，结合患者的一般情况，分期和恶性肿瘤的位置以及用病毒治疗区域的全部大小和分布，很容易地确定给于患者的接种物的量。一般患者用初始剂量的病毒治疗，随后在决定进一步给予病毒之前，监测适当的时间周期，确定一些不明确的因素如患者初始病毒给药时的反应，以及初始治疗产生的病毒感染的程度和恶性细胞死亡的程度。期望个体用该病毒以预先确定的间隔治疗一定的时间。如为适合每种情况所确定的那样，间隔时间可以是每天，或从M小时至72小时或更大的范围。每次可使用不同的病毒以避免或尽量减小对前面应用的病毒的任何免疫反应，治疗周期可延伸至一至两周或更多，可由主治医生来确定。更优选，可应用哺乳动物以前未接触过的或可通过标准的技术确定的哺乳动物可产生相对小的免疫反应的病毒。虽然很容易获得的已知艾柯病毒适合用于本发明的方法中，但也可应用修饰的病毒或使用常规技术改造的病毒。例如，该病毒可被修饰为使用其他的细胞粘附分子作为细胞受体。作为例子，病毒可使用位点定向诱变来修饰，这样在该病毒衣壳表面上表达肽基序"RGD"。RGD基序可被Civ整合蛋白杂二聚体识别，这种衣壳修饰例如可使病毒与整合蛋白α 结合，后者是一种已经显示在黑色素瘤病灶上表达上调的细胞粘附分子 (Natalia P. G ； 1997)因为具有α 2 β工，可能引起靶细胞对病毒的摄取增强。为了更清楚的了解本发明的特征，其优选的形式是以下列非限制性例子作为参考来描述。实施例1 材料和方法1. 1.细胞系IGROV-U Α2780、DU145、PC3、AsPC-U PANC-U T47-D、MDA-MB361、MDA-MB453、 MDA-MB231和MCF-7癌细胞系从澳大利亚，新南威尔士，悉尼，Garvan Institute获得。 BT-20、MDA-MB157、SK-BR-3、ZR-75-1、HCT116、LIM2537、SW480、SW620、2008、JAM、0VCA-429、 0VCAR-3、0VHS-1、0WA-42、SK0V-3和D0V13癌细胞系从澳大利亚，维多利亚，墨尔本，Peter MacCullum Cancer hstitute获得。SkMeU8细胞从澳大利亚，维多利亚，Monash大学， 生物化学和分子生物学系，Ralph博士处获得。HeLa细胞从澳大利亚，维多利亚，墨尔本， Fairfield 医院，Margery Kennett,Entero_respiratory Laboratory 获得。除了 BT-20 细胞在α-MEM培养基中培养以外，所有的细胞可在标准条件下(371，5%0)2大气条件)在含有2-5%胎牛血清(FCS)和抗生素的RPMI中培养。所有使用的细胞通过ELISA常规检查衣原体的存在(Roche Molecular Systems, CA, USA)。1. 2.病毒柯萨奇病毒A21(CAV21)原型菌株Kuykendall ；柯萨奇病毒B3 (CVB3)原型菌株Nancy;艾柯病毒(EVl)原型菌株Farouk ；艾柯病毒(EV7)原型菌株Wallace ；和脊髓灰质炎病毒I(PVl)原型菌株Mahoney从澳大利亚，维多利亚，墨尔本，Fairfield医院， Enterorespiratory Laboratory 的 Margery Kennett.博士处获得。所有病毒在 HeLa 细胞中繁殖并进行滴定。1. 3单克隆抗体(MAb)
抗-DAF MAb VIIIA7，可识别DAF的第三个SCR，从日本，大阪，大阪大学， T. Kinoshita博士处获得，抗DAF mAb IH4由澳大利亚，维多利亚，海德尔堡，Austin研究协会，Bruce Loveland博士惠赠。抗-CAR MAb RmcB从马萨诸塞州，波士顿，Dana Farber癌症协会的J. M. Bergelson博士处获得。抗-β 2_微球蛋白MAb 918从英格兰，赫特福德郡， NIBSC，P. Minor博士处获得。抗-α 2 β iMAb AK7可识别α 2亚单位，对照抗-GPIV (血小板膜糖蛋白)抗体MAb PTA-I从澳大利亚，NSW，纽卡斯尔大学，医学生物化学和癌症研究系的 Gordon Burns教授处获得。抗-ICAM-IMAb IH4从澳大利亚，昆士兰，昆士兰医学研究协会的Andrew Boyd教授处获得。1.4.流式细胞仪分析癌细胞上肠道病毒受体的表面表达通过流式细胞仪分析。被分散的细胞(IxlO6) 在冰上用合适的MAb (5 μ g/ml，用PBS稀释)孵育20分钟。用PBS洗涤细胞，离心沉淀，然后重新悬浮在ΙΟΟμΙ 1 50稀释的R-藻红蛋白交联的羊抗鼠免疫球蛋白的F(ab' )2片段 (Dako,A/S,Denmark)中。在进行流式细胞仪分析之前细胞再次在冰上孵育20分钟，洗涤， 沉淀，重新悬浮在 PBS 中。使用 FAC^tar 分析仪(Becton Dickenson, Sydney,Australia) 分析细胞表面受体的表达。1.5.病毒感染性测定癌细胞系的汇合单层用10倍系列稀释(ΙΟΟμ 1/孔，三份或四份)的CAV21、CVB3、 EVl、EV7或PVl接种在含有胎牛血清(FCS)的DMEM中，并在37°C，5% CO2环境中孵育 72小时。为了测定细胞的生存率，培养板用ΙΟΟμ 1/孔的结晶紫甲醇溶液(0.1%结晶紫， 20%甲醇，20%甲醛，磷酸盐缓冲盐水(PBS))孵育M小时，并在蒸馏水中洗涤。有限稀释测定的终点是影响50%检测单位的病毒稀释度。使用Reed和Muench法 (参考文献)来应用统计学步骤计算终点。终点表示每毫升50%组织培养物的感染剂量 (TCID50/ml)。当需要用抗受体的单克隆抗体预处理细胞单层时，细胞用ΙΟΟμΙ 抗-α 2 β iAK7MAb (20 μ g/ml，在PBS稀释)37°C孵育1小时。然后细胞单层接种在合适病毒稀释度的两份样品中，并在上述染色前在37°C 5% CO2环境中孵育72小时。使用倒置显微镜(Olympus IX-FLA)以IOOX放大倍数在对、48或72小时拍摄显微照相图片。1.6病毒纯化含有D0V13细胞汇合单层的6孔组织培养板接种500 μ 1 EVl (感染复数[moi]= IO5TCID 5。/ml)37°C，l 小时。用无蛋氨酸 / 半胱氨酸 DMEM(ICN Biomedical, Ohio, USA)洗涤三次去除未结合的病毒，在加入300 μ Ci [35S]-蛋氨酸反向标记(ICN Biomedical, Ohio, USA)之前，细胞单层继续在1. 3ml这种培养基中37°C孵育2小时。被感染的单层在37°C， 5% CO2的环境中孵育过夜。三次冷冻/复温循环后，病毒裂解产物在5-30%蔗糖梯度中纯化，在Beckman XL-90超速离心机(SW41ti Rotor)速度离心36，OOOrpm,离心95分钟。 从每个试管的底部收集组分，通过液体闪烁计数监测(Wallac 1450 Microbeta TRILUX， Finland)，对在病毒结合测定定位使用的160S病毒峰。未放射性标记的EVl病毒体用集中的峰值感染组分以类似的梯度进行纯化，用磷酸盐缓冲盐水(PBQ透析。紫外线(UV)灭活EVl的产生是通过在6孔板中将1.0ml PBS液中纯化的EVl/孔(5x105TCID5(1)在15瓦UV光下照射30秒。通过微滴定板裂解性感染性细胞测定计算病毒的灭活。1.7.放射性标记病毒结合测定重新悬浮在800 μ 1含有牛血清白蛋白(BSA)的RPMI中的大约1x106细胞在 20 μ g/ml MAb(抗-α 2β 1或抗-DAF，在PBS中稀释)存在下，4°C孵育1小时，然后加入 300 μ KlxlO6) [35S]-蛋氨酸标记的160SEV1。4°C孵育2小时后，细胞用无血清培养基洗涤 4次，在三个样品通过液体闪烁计数测定结合的[35S]蛋氨酸标记病毒的水平之前，细胞团裂解在 200 μ 1 0.2Μ NaOH-l%SDS 中。(Wallac 1450Microbeta TRILUX Finland)。结果表示为均数士 SE。1. 10十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[35S]-蛋氨酸标记的病毒组分通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析(PAGE)，并通过放射自显影来显影。[35S]-蛋氨酸标记的160S EVl组分用样品还原缓冲液Q50mM TRIS， 0. 2g w/v SDS，20% ν/ν 甘油，10% v/v2-巯基乙醇和 0. 01% w/v 溴酚蓝，pH 6. 8)95°C 孵育10分钟，使病毒体变性。然后变性的160S病毒峰组分在15 % TriS-HCl预制胶 (BIORADReady-Gel, CA, USA)结合Benchmark预先染色的中等蛋白梯度(GIBCO，USA)上以 180V 45 中。_角虫 96/]、Β Hyperfilm MP(Amersham International, England) 上通过放射自显影显示主要结构蛋白和分析病毒纯度。1. 11细胞的细胞毒性测定人外周血淋巴细胞0VHS-1和D0V-13细胞的细胞悬液用EVl(moi = LOTCID5tl/细胞)激发，37°C孵育M小时。细胞裂解产物的水平可计算为LDH(—种在细胞裂解过程中释放的稳定的胞浆酶)释放的函数，使用Cyto-Tox 96试剂盒(Promega Corp. Maddison, WI. USA)按照生产厂商的说明书进行评价。1. 12球状体的培养和球状体感染性的测定DOV-13细胞以每孔500或5000个细胞植入M孔板，Iml含有5% FCS的RPMI1640 中接种至半固体的0.5%琼脂糖层上。在加入EVl (IO5TCID5ci)之前细胞在5% CO2气体中在 37°C孵育48小时，使球状体形成。1. 13SCID小鼠腹膜内肿瘤异种移植模型6至8周龄的雄性BALB/c SCID小鼠根据纽卡斯尔大学实验动物管理和伦理委员会所批准的方案在无菌条件下圏养。0VHS-1细胞用0. 05%胰蛋白酶收获，重新悬浮在含有 10% FCS的RPMI中，离心沉淀。在小鼠用200 μ L含有IxlO6细胞的溶液腹腔内注射(i. p.) 之前，洗涤细胞，并重新悬浮在PBS中。14天后，小鼠分为三组(11 = ，用磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，或IO5TCID5tl的UV灭活EVl或感染性EVl处理。以每周为基准对动物进行称重，当肿瘤超过其体重20%时处死。处理小鼠的体重与未荷瘤的健康BALB/c SCID小鼠的体重进行比较。1. 14通过实时PCR测定病毒血症来自感染小鼠的血清采用实时定量RT-PCR分析病毒血症。简言之，使用QIAamp 病毒RNA mini试剂盒Oliagen，Clifton Hill，维多利亚，澳大利亚)从10 μ 1血清中提取病毒RNA，并根据生产厂商的说明书洗脱为40μ1终体积。使用ft~imer Express 1· 5 软件(Applied Biosyatems, Foster City, CA, USA)并基于以前公布的 EVl 序
17列(Genbank登记号AF029859)设计测定EVl病毒RNA水平的引物和探针，；正向引物 (5 ‘ -CAAGACAGGGACCAAAGAGGAT-3 ‘)，反向引物(5 ‘ -CCACTCGCCTGGTTGTAATCA-3 ‘)， 以及 6-FAM 标记的 MGB-探针(5 ‘ -CCAATAGCTTCAACAATT-3 ‘)。使用 Platinum 定量 RT-PCRThermoScript 一步系统在ABI7000序列检测仪上进行一步RT-PCR。为了产生标准曲线，EVl病毒储存液(lX106TCID5(l/ml)的10倍稀释液用最佳浓度的引物和探针进行扩增。在25 μ 1的体积中，反应混合物包括1 X ThermoScript 反应混合物，500nM正向引物， 900nM 反向引物，250nM 探针，500nM R0X, 0. 5 μ 1 ThermoScript Plus/Platinum Tag Mix 和5 μ 1提取的RNA。热循环条件为60°C 30分钟，然后95°C 5分钟，然后在95°C 15秒和 60 0C 1分钟进行40个循环。实施例2 病毒介导的对癌细胞系的溶瘤作用2. 1乳腺癌细胞表面上肠道病毒受体的表达为了确定肠道病毒所使用的被选肠道病毒细胞表面受体的相对表达水平，进行流式细胞分析。被选的受体包括CAV21使用的ICAM-I ；被EV7，CAV21，CVB3使用的DAF ；CVB3 使用的CAR;以及EVl使用的整合蛋白CIj115由于没有针对PVR受体的Mab，因此没有检测到PVR的表达水平。分析9 个乳腺癌细胞系，包括 BT-29、MCF-7、MDA-MB157, MDA-MB231、MDA-MB361、 MDA-MB453、SK-BR-3、T47-D 和 ZR-75-1。这些细胞系与抗-ICAM-I (IH4)、抗-CAR(RmcB)、 抗-DAF (VIIIA7)或抗-α 2 β工(ΑΚ7)共同孵育。这9个细胞系中的6个，ICAM-I的表达是显著的，而在所有细胞系中DAF似乎表达的水平相对较低。这9个细胞系中的7个，很明显存在中等水平的CAR表达，而在8个乳腺癌细胞的表面上Q2^的表达最低(图1)。2.2.被选肠道病毒对乳腺癌细胞的溶瘤作用对所有9个乳腺癌细胞系进行裂解性感染测定，以确定它们对被选的肠道病毒 CAV21、CAB3、EV1、EV7和PVl的易感性(图2)。如果在50%终点/ml (TCID50/ml)组织培养的感染剂量计算为104或更高，则认为细胞系高度易感。在9个乳腺癌细胞系中的6个中 CAV21和CVB3可诱发显著的裂解作用。除了 1个细胞系T47-D以外，通常乳腺癌细胞对艾柯病毒EVl和EV7的裂解性感染不敏感，证明T47-D对EVl具有相当大的易感性。PVl实质上可使9个乳腺癌细胞系中的8个产生溶瘤作用(图2)。2.3.肠道病毒受体在结直肠癌细胞上的表达通过流式细胞仪分析4个结直肠癌细胞系(HCT116、LIM2537、SW480和SW620) ICAM-I、CAR、α 2 β工和DAF的表达。在这两个细胞系上观察到了显著的ICAM-I和DAF表达水平。在所有这4个细胞系中有CAR的中等表达水平，而没有观察到Ci2^1的显著表达水平(图3)。2.4.被选肠道病毒对结直肠癌细胞的溶瘤作用在所有4个结直肠癌细胞系中滴定CAV21、CVB3、EV1、EV7和PV1。在所有细胞系中观察到CVB3和PVl具有显著水平的溶瘤作用(图4)。但CAV21诱发的显著细胞裂解仅发生在4个细胞系中的一个中(LIM2573)。这个细胞系显示具有最高水平的ICAM-I表达。 尽管Cij1的表达水平非常低，但EVl可裂解性地感染其中的3个细胞系，而所有细胞对 EV7的感染是可耐受的。
2.5.肠道病毒受体在前列腺和胰腺癌细胞表面上的表达分析包括DU145和PC3的前列腺癌细胞系，以及包括AsPC-I和PANC-1的胰腺癌细胞系中ICAM-1、DAF、CAR和α 2β工的表达。在两种前列腺细胞系和一个胰腺细胞系上 ICAM-I有显著水平的表达。在所有4个细胞系上发现有中等的CAR和DAF表达，而α 2 β工的表达似乎是最小的(图5)。2.6.前列腺和胰腺癌细胞的溶瘤作用在微量滴定板裂解性感染中检测两个前列腺癌细胞系和两个胰腺癌细胞系对肠道病毒CAV21、CVB3、EVU EV7和PVl的易感性。该前列腺癌细胞系对所有的病毒易感，除了 DU145对EV7不敏感。PANC-I仅可被CAV21和PVl感染，而其他的胰腺癌细胞系AsPC-I 显示可被除EV7之外的所有病毒裂解(图6)。2.7.肠道病毒受体在卵巢癌细胞表面上的表达检测卵巢癌细胞系肠道病毒受体ICAM-I、CAR、DAF和α 2 β工的表达。在本研究中包括 9 个细胞系A2780、D0V13、IGR0V-1、JAM、0VCA-429、0VHS-1、0WA-42、SK0V-3 和 2008。 这9个细胞系中的两个有显著水平的ICAM-I表达，而这9个中的6个上有中等水平的CAR 表达。在除一个以外的所有卵巢癌细胞系上DAF为中等至较高水平的表达。这9个卵巢癌细胞系中的8个显示中等至较高水平的α 2 β工表达(图7)，还有另外一个卵巢癌细胞系 (0VCAR-3)有显著水平的α 2 β工表达(数据未显示)。2. 8卵巢癌细胞系的溶瘤作用在这9个卵巢癌细胞系中的每一个细胞系中评价CAV21，CVB3, EV1，EV7和PVl的溶瘤能力(图8)。在这9个细胞系中的两个上发现了 CAV21的易感性，而CVB3在这9个细胞系中的7个中可引起明显的裂解作用。卵巢癌似乎特别对艾柯病毒EV7易感，其可引起这9个癌细胞系中的4个死亡，EVl可引起10个细胞系中7个在感染过程中发生明显地裂解(图9A，9B和10)。在所有9个卵巢癌细胞系中均显示对PVl的易感性。对用EVl感染的所有10个细胞系拍摄显微照相图片(图9A和9B)，也观察EVl对10个卵巢癌细胞系的微滴定板裂解性感染作用(图10)。2. 9. EVl与卵巢癌细胞系的结合因为卵巢癌细胞系对EVl的溶瘤作用高度易感，因此进行进一步研究以评价EVl 细胞粘附的特征。在加入放射性标记的EVl以确定这些受体参与EVl宿主细胞的结合之前， 细胞与抗-Ci2^(AKT)或抗-DAF(VIIIA7)单克隆抗体预先孵育。在被测的所有10个细胞系中EVl的结合是很明显的。通过用抗受体抗体对α 整合蛋白的阻断，EVl的细胞粘附被显著抑制。用单克隆抗体VIIIA7阻断细胞表面受体DAF，没有引起EVl结合的显著抑制(图11)。2.10.抗体对Ci2^整合蛋白的阻断可抑制EVl对卵巢癌细胞系的感染为了评价在EVl感染中Ci2^1的功能，进行裂解性测定实验，其中细胞单层与抗 O2^1 (ΑΚ7)单克隆抗体预先孵育。分析0WA-42和IGR0V-1卵巢癌细胞系。病毒感染后72 小时，缺少MAb阻断的细胞单层对EVl的裂解性感染高度易感。即使是在EVl的最低稀释度时，在MAb阻断α 2 β工整合蛋白后，在细胞系中没有溶瘤作用的表现，(图12)。在0WA-42 细胞系感染后对，48和72小时拍摄显微照相图片(图13)。2. 11非癌的人类细胞对EVl感染不易感
进行一个试验以验证EVl对非癌的人类细胞的作用，其测定是通过用EVl感染人成纤维细胞。简言之，用组织培养环形插入物制备6孔组织培养板，D0V13细胞位于环内， HeLa细胞，人成纤维细胞(从CSL，澳大利亚获得)在外环，37°C孵育直至形成汇合单层。 去掉环，细胞用EVl感染，37°C过夜。活细胞用结晶紫甲醇溶液染色。在用EVl感染的过程中，D0V13卵巢癌细胞被裂解，而HeLa细胞仍然是健康的(图14)，证明卵巢癌细胞对EVl 的特异易感性。2. 12 0力1在黑色素细胞系51^61观上的表达黑色素瘤，一种皮肤癌，已知其α 2β工的表达是上调的。使用流式细胞仪检查黑色素瘤细胞系SkMel^的表达。观察到很高水平的α 2 β 1表达。但，用对照MAb显示很低的本底结合水平(图15)。2. 13EV1 与 SkMeU8 的结合为了进一步研究EVl与SkMel^细胞表面表达的α 2 β工相附着的性质，采取放射性标记病毒结合实验。放射性标记的EVl可显著的与恶性黑色素瘤细胞系结合，MAb阻断 Q2^1可极大地减少EVl结合的量(图16)。2. 14EV1 对 SkMeU8 的灭活实验裂解性感染试验用来确定SkMeUS对EVl感染的易感性。恶性黑色素瘤细胞系在用EVl感染的过程中显示中等程度的溶瘤作用。结晶紫染色被没有经历裂解性感染的细胞吸收，而没有染色的细胞表示细胞单层已完全被裂解(图17)。2. 15 讨论发现卵巢癌细胞系对EVl的裂解性感染高度易感，被检测的10个细胞系中有7个显示有明显的溶瘤作用。进一步对EVl和卵巢癌细胞系结合的研究证实Cij1是EVl所使用的基本受体。放射性标记结合研究进一步表明α 2β工是病毒结合所需要的，MAb的阻断实验显示通过使用Ci2^单克隆抗体(Mab)预处理易感的卵巢癌细胞，EVl的感染被完全抑制。DAF MAb VIIIA7作为一种阴性对照处理也用于结合实验中，以确定DAF是否在EVl 结合中具有重要作用，因为它在肠道病毒CAV21和CVB3中是有作用的。使用抗DAF MAb预处理没有出现对EVl结合的明显阻断。卵巢癌细胞与人成纤维细胞共培养，然后EVl进行感染，显示即使处在病毒可特异性裂解卵巢癌细胞的环境中，人成纤维细胞对EVl的感染不易感。也研究了 EVl介导的溶瘤作用对黑色素瘤细胞系的作用。数据显示在SkMeUS黑色素瘤细胞系表面上Qj1是上调的，这些细胞对EVl的裂解性感染是易感的。放射性标记结合实验显示EVl与卵巢癌细胞的结合显示是经与Cij1的相互作用。剩余可被EVl 感染的癌细胞系是结肠癌细胞系，这4个细胞系中的三个以及前列腺癌细胞系是高度易感的。这两个类型的癌症可遇到与卵巢癌细胞相同的细胞外基质，因此在腹膜表面发现的富含1型胶原的细胞外基质转移的过程中上调了其α 2 β工表达。应当理解的是本领域普通技术人员对于以具体实施例所显示的本发明可进行大量的修动和/或变动，这从广义上来说是不背离本发明的精神和范围的。因此这些实施例从所有方面应均可被认为是说明性的，而不是限制性的。实施例3 艾柯病毒(EW)裂解性感染的特异性3. IEVl的相对致病性
研究了与肿瘤细胞相比EVl对体外培养的非恶性卵巢细胞的相对致病性。使用人乳头状瘤病毒16E6-E7开放可读框永生化的正常人卵巢表面上皮(HOSE)细胞(Teao，S. W 等人，1995)，以及一种透明细胞卵巢癌细胞系(0VHS-1)和未分化卵巢癌细胞(D0V13)给予多重度的EVl进行激发，moi的范围从5. 0至0. 05TCID50/细胞。在感染后48小时，显微镜检查显示全部细胞被破坏，以及两个卵巢癌细胞系单层的细胞裂解，即使病毒激发的量很低，达到0. 05TCID50EV1/细胞。相反，即使在最高的病毒激发剂量下仍未观察到HOSE细胞的细胞形态学发生可检查到的变化。为进一步确定EVl感染的特异性，正常的外周血淋巴细胞(PBL)以及0VHS-1和 D0V13细胞用EVl (moi = 1. 0)激发。流式细胞仪分析显示PBL细胞制品上表面α 2 β工的表达很少以至没有，而两个卵巢癌细胞系表达很高水平的EVl-介导的PBL和卵巢癌细胞悬液的细胞裂解作用可使用标准的测量LDH释放的细胞毒性测定来评价。EVl的激发可引起EVl感染的培养卵巢细胞的几乎完全裂解，而在PBL与相同施加剂量的EVl接触后仅观察到本底水平的细胞裂解作用。为了确定在缺少可检测到的细胞裂解的情况下，在PBL中EVl是否启动了可繁殖性的感染，以证实本底水平的细胞裂解是非特异性的，不是由EVl感染介导的，PBL和两个卵巢癌细胞系的悬液用EVl接种(moi = 1.0)，并监测子代病毒的产生。在两个卵巢癌细胞系(0VHS-1和D0V-13)中，在开始的细胞结合接种过程中，EVl的滴定度增加了大约IO4倍。 相反，PBL在48小时的孵育过程中没有产生子代病毒，观察到的感染性主要是给予的接种残余物的非特异性结合。实施例4 艾柯病毒(EVl)裂解卵巢癌细胞4. IEVl体外裂解培养的卵巢癌细胞球状体许多体外卵巢癌细胞培养物可作为多维球状体进行繁殖(Casey，R.C等人， 2001)。多细胞球状体类似通常在晚期卵巢癌患者腹水中发现的多细胞集合体。已经明确培养的卵巢单层细胞对EVl的裂解性感染高度易感，卵巢癌细胞的多细胞球状体可用EVl 进行激发。流式细胞仪分析确定无论0VHS-1细胞以单层生长或形成球状体，EVl细胞受体 Q2^1的表面表达水平是可比较的。EVl (IO5TCID50)加在围绕球状体周围的半固体琼脂糖培养基上，获得在病毒激发后不同的间隔时间球状体形态学的显微照相影像。图18显示了对照未感染的球状体具有增殖活性的，经过9天的孵育周期其量是稳定增加的。相反，EVl感染的球状体显示在接种后的头7天其量稍微降低，在接下来的48小时发生明显的结构崩解和细胞破坏。数据显示EVl可在癌性球状体中使增殖的细胞成为被裂解性感染的细胞，不管初始接种球状体的量是多少(即5X IO2或5X IO3细胞)可有效地阻止球状体的生长。4. 2艾柯病毒1对人卵巢癌腹水模型的作用在转移性卵巢癌的晚期，肿瘤细胞迁移遍布腹腔和/或定植在远隔的组织部位。 为了确定EVl介导的溶瘤作用是否是晚期腹膜卵巢癌的一种有效治疗手段，使用携带人卵巢癌异种移植物的SCID小鼠腹水模型。在给予活EVl之前14天，通过腹膜内途径给SCID小鼠注射2 X IO6OVHS-I细胞。试验性治疗方案包括通过腹膜内途径注射单剂量的PBS，UV-灭活的EVl或活的EVl (IO5TCID50)。接受多种治疗处理的小鼠体重相对未携带卵巢癌异种移植物小鼠的变化被用作腹水负担发生的标志物。在治疗后3周，给予PBS或UV灭活EVl的小鼠表现出体重明显增加，但在正常和EVl治疗小鼠之间没有观察到差异。PBS或UV灭活EVl组的体重持续增加，注射后4周时由于腹水液体积聚除了剩余的治疗组以外，所有的小鼠腹胀都很明显(图19A)。在注射后 5周，因为腹水过多所有PBS和UV灭活EVl处理的小鼠死亡，而在EVl治疗的小鼠和没有接受卵巢癌异种移植物的动物之间没有观察到可检测到的体重增加或腹水形成(图19B)。经过本研究的过程，即使是血清病毒荷载量超过病毒接种剂量10-100倍(注射后7-14天； 数据未显示)的情况下，在用活EVl注射的小鼠中没有观察到疾病显著进展的指征。4. 3 讨论使用有复制能力的病毒成功进行病毒溶瘤策略的主要要求之一是病毒对宿主的致病性很低，但对肿瘤细胞有很高的选择性。在本研究中，评价了代表性的人艾柯病毒诱发体外培养的人卵巢癌细胞裂解性感染的能力。尽管对黑色素瘤细胞具有很高的溶瘤作用，CVA21和EV7的原型株在许多人卵巢癌细胞单层中诱发增殖细胞裂解性感染的能力不如EV1。单克隆抗体阻断研究证实了 EVl 介导的卵巢癌细胞裂解性感染是通过具体病毒衣壳与细胞表面表达的整合蛋白Ci2^1的结合所启动的。因为整合蛋白CI2^1不能同时结合EVl和胶原，EVl对卵巢癌细胞的裂解性感染不仅能介导肿瘤细胞迅速地裂解，还可以干预1型胶原和Q2^整合蛋白之间的相互作用，因此有可能减少癌细胞通过腹膜表面的播散。EVl激发对多细胞三维球状体的破坏反映了 EVl介导的溶瘤作用在体内缩小实体肿瘤体积的能力。EVl这种对卵巢球状体有效的裂解令人信服地使人认为卵巢球状体中的单个细胞较形成单层中的细胞更稳固，对放射线和化学物质诱导的凋亡有较强的抵抗力 (Frankel，A 等人，1997)。治疗性溶瘤病毒对于恶性细胞的靶向应该有一种特殊的机制。选择性EVl介导的感染作用的突出特点是EVl不能诱导正常卵巢上皮细胞系和外周血淋巴细胞(PBL)的大量裂解。在卵巢癌细胞中而不是PBL悬液中产生高滴度的子代病毒再次说明了 EVl感染非肿瘤细胞的特异性和低致病性。除了卵巢癌，恶性黑色素瘤细胞表面整合蛋白Cij1的表达水平也是上调的，因此使它们对EVl的激发也是易感的。有些相反的论点认为，EVl对卵巢癌细胞的感染可诱导ICAM-I (Pietiainen，V等人，2000)，CVA21的细胞靶向受体在黑色素瘤细胞表面上的表达增加。因此，通过含有活EVl和CVA21的治疗制剂激发卵巢癌和/或恶性黑色素瘤可引起更有效的溶瘤性感染。腹膜内给予EVl可非常有效的控制SCID小鼠腹腔内卵巢肿瘤异种移植物的进展。所有注射活EVl的小鼠没有显示体重增加(相对没有注射卵巢癌异种移植物的小鼠) 以及可检查到的腹水发生。通过体内裂解性感染卵巢肿瘤细胞产生的子代EVl在注射后7 天小鼠的血中可被检测到(数据未显示)。血中(vireamic)的EVl可被认为是控制播散性疾病的储备库，检测到其显著的水平(大约IO6TCID5tl)也表明可显著降低病毒的给药剂量-IO5TCID5ci，仍可维持其溶瘤作用。在没有携带卵巢癌异种移植物的小鼠中(数据未显示)注射后7天不能检测到血中的EVl表明在缺少易感性肿瘤细胞的情况下，EVl迅速和有效地从全身循环中被清除。总体来说，这些结果高度提示，EVl的溶瘤性治疗可在体外和体内非常有效地控制腹膜卵巢癌。应用相对非侵入性的EVl治疗被认为是现有治疗方案中的另一种非常吸引人的方法，现有方案涉及手术减积术后进行联合化疗。EVl治疗也可被用作肿瘤减积手术后的辅助治疗，目标是靶向和破坏在手术操作过程中释放的肿瘤细胞。EVl溶瘤治疗也可被用作治疗整合蛋白α 高表达水平的其他人类恶性肿瘤中的一种新的治疗方法。而且， 因为EVl和EV8可竞争整合蛋白α 2β i上的相同结合表位，因此EV8可替代EVl，诱导卵巢癌细胞迅速的裂解性感染。利用两个不同的病毒血清型可相继地通过整合蛋白α 2 β工的靶向作用激发卵巢癌，不依赖首次给予病毒产生的保护性免疫反应。对于EVl利用一种有效的抗肠道病毒药物(pleconaril) (Pevear,D. C.等人，1999)可进一步增强这种治疗的目的性，因为它能够直接控制非特异性病毒的复制和播散的子代病毒。在pleconaril和EVl之间潜在的协同性也可允许在全身注射给药多重度非常高的病毒后，在病毒已经靶向并开始对恶性细胞进行裂解性感染后马上再应用pleconaril (为了灭活游离的病毒)。应当理解的是本领域普通技术人员对于以具体实施例所显示的本发明可进行大量的修动和/或变动，这从广义上来说是不背离本发明的精神和范围的。因此这些实施例从所有方面应均可被认为是说明性的，而不是限制性的。参考文献1. Andreansky SS,He B,Gillespie GY,Soroceanu L,Markert J,Chou J,Roizman B和Whitley RJ(1996)。应用遗传改造的单纯疱疹病毒治疗试验性脑肿瘤。Proc Natl Acad Sci USA 93 :11313-8.2. Ansardi, D. C. , Porter, D. C, Jackson, G. , Gillespie, Y.禾口 Morrow，CD.来自脊髓灰质炎病毒的RNA复制子对于不同来源的人肿瘤细胞是具有直接溶瘤作用。Cancer Res, 2001,61 :8470-8479o3. Bartolazzi, Α. , J. Kaczmarek, G, Nicolo, Α. Μ. Risso, G. Tarone, P, Rossino, P.Defilippi，和P.Caetellani。在一些常见卵巢上皮肿瘤和正常相应组织中α 3 β i整合蛋白的定位。Anticaneer Res, 1993. 13(1) :ρ· 1-11.4. Bergelson, J. Μ.，B. Μ. Chan，R. W. Finberg，和 Μ· Ε. Hemler。整合蛋白 VLA-2 通过不同的机制与艾柯病毒1和细胞外基质配体结合。J Clin Invest, 1993. 92(1) :p. 232-9.5. Cannistra, S. Α. ，C. Ottensmeier, J. Niloff, B. Orta,禾口 J.DiCarlo。 Bl 禾口 α νβ 3整合蛋白在卵巢癌中的表达和功能。Gynecol Oncol, 1995. 58(2) :ρ· 216-25.6. Cardarelli,P. Μ. , S, Yamagata, I. Taguchi,F. Gorcsan, S. L. Chiang,禾口 Τ· Lobl。 来自MG-63和HT1080细胞的胶原受体α 2 β 1可与环RGD肽相互作用。J Biol Chem, 1992， 267(32) :ρ. 23159-64.7. Casey, R. C.等人，(2001)。β 1_整合蛋白可调节卵巢癌多细胞球状体的形成和粘附。Am J Pathol. 159 :2071-80.8. Chan, B. Μ.，N. Matsuura, Y. Takada, B, R. Zetter，禾口 Μ· Ε. Hemler。体内禾口体夕卜 VLA-2在横纹肌肉瘤细胞上表达的结果。Science, 1991. 251(2001) :ρ· 1600—2.9. Fenner,F.等人。动物病毒生物学。Academic Press. New York，1974 第二版。10. Fields，B. N，和 D. Μ. Knipe。病毒学领域。第四版，Vol. 1. 2000，New York Raven Press.11. Flint, SJ.等人，2000，病毒学原理分子生物学，发病机理和调控。ASM Press, Washington.
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权利要求
1.一种治疗哺乳动物异常细胞的方法，其特征在于包括用有效量的病毒治疗哺乳动物，所述病毒选自可识别α J1以感染细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合，这样至少一些细胞被所述的病毒杀死。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于包括让哺乳动物接受多次病毒治疗，在每次治疗中的病毒是相同的或不同的。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于所述的病毒包含艾柯病毒血清型或其修饰形式。
4.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于所述的病毒选自EV1、EV7、EV8和EV22。
5.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于所述的病毒是修饰后的艾柯病毒。
6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于修饰所述的病毒以提高病毒感染异常细胞的能力。
7.根据权利要求5或6中所述的方法，其特征在于所述的修饰后艾柯病毒是选自EV1、 EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修饰形式。
8.根据权利要求1至7任何一项中所述的方法，其特征在于所述的病毒与另一种感染异常细胞的病毒联合给予哺乳动物。
9.根据权利要求8中所述的方法，其特征在于所述的异常细胞表达ICAM-1，所述的另一种病毒可识别ICAM-I以感染异常细胞。
10.根据权利要求9中所述的方法，其特征在于所述的病毒是柯萨奇病毒或其修饰形式。
11.根据权利要求10中所述的方法，其特征在于所述的柯萨奇病毒是选自A13、A15、 A18和A21的柯萨奇病毒血清型。
12.根据权利要求1至11任何一项中所述的方法，其特征在于所述的异常细胞是癌细胞。
13.根据权利要求12中所述的方法，其特征在于所述的癌细胞是选自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和结直肠癌的癌细胞，或已经从卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌或结直肠癌播散的癌细胞。
14.根据权利要求1至13任何一项中所述的方法，其特征在于所述的异常细胞中 Q2^1的表达是上调的。
15.根据权利要求1至14任何一项中所述的方法，其特征在于所述的病毒通过局部、全身或肿瘤内给予哺乳动物。
16.一种筛选对诱发细胞死亡的病毒具有易感性的哺乳动物异常细胞样本，评价给予哺乳动物所述病毒对异常细胞治疗作用的方法，其特征在于包括(a)提供异常细胞的样本；(b)用所述病毒处理细胞足够的时间使细胞被病毒感染；和 (d)确定所述病毒是否感染并至少引起一些异常细胞的死亡；其中所述的病毒选自可识别Cij1以感染异常细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组I=I O
17.根据权利要求16中所述的方法，其特征在于所述的病毒包括艾柯病毒血清型或其修饰形式。
18.根据权利要求16中所述的方法，其特征在于所述的病毒选自EV1、EV7、EV8和 EV22。
19.根据权利要求17中所述的方法，其特征在于所述的病毒是修饰后的艾柯病毒。
20.根据权利要求19中所述的方法，其特征在于修饰所述的病毒以提高病毒感染异常细胞的能力。
21.根据权利要求19或20中所述的方法，其特征在于所述的修饰艾柯病毒是选自 EV1、EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修饰形式。
22.根据权利要求16至21任何一项中所述的方法，其特征在于进一步包括使用另一个细胞样本进行步骤(b)和(c)比较所述病毒和另一种不同的可识别Ci2^1以感染细胞的病毒感染细胞并引起细胞死亡的能力。
23.根据权利要求22中所述的方法，其特征在于所述的另一种不同的病毒是一种不同的艾柯病毒或其修饰形式.
24.根据权利要求16至23任何一项中所述的方法，其特征在于所述的细胞是癌细胞。
25.根据权利要求M中所述的方法，其特征在于所述的癌细胞是选自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和结直肠癌的癌细胞，或已经从卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌或结直肠癌播散的癌细胞。
26.—种筛选具有感染并引起哺乳动物异常细胞死亡能力的病毒，评价对哺乳动物应用所述病毒对异常细胞的治疗作用的方法，其特征在于包括(a)选择病毒；(b)用所述病毒处理哺乳动物异常细胞样本足够的时间使病毒感染细胞；和(c)确定所述病毒是否已经感染并至少引起一些异常细胞死亡；其中所述的病毒选自可识别α J1以感染异常细胞的艾柯病毒及其修饰形式。
27.根据权利要求沈中所述的方法，其特征在于所述的病毒包括艾柯病毒血清型或其修饰形式。
28.根据权利要求沈中所述的方法，其特征在于所述的病毒选自EV1、EV7、EV8和 EV22。
29.根据权利要求27中所述的方法，其特征在于所述的病毒是修饰后的艾柯病毒。
30.根据权利要求四中所述的方法，其特征在于修饰所述的病毒以提高病毒感染异常细胞的能力。
31.根据权利要求四或30中所述的方法，其特征在于所述的被修饰后艾柯病毒是选自 EV1、EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修饰形式。
32.根据权利要求沈至31任何一项中所述的方法，其特征在于进一步包括使用另一种细胞样本进行步骤(b)和(c)比较所述病毒与另一种不同的可识别Cij1以感染细胞的病毒感染并引起细胞死亡的能力。
33.根据权利要求32中所述的方法，其特征在于所述的另一种不同的病毒是一种不同的艾柯病毒或其修饰形式。
34.根据权利要求沈至33中任何一项的方法，其特征在于所述的异常细胞是癌细胞。
35.根据权利要求34中所述的方法，其特征在于所述的癌细胞选自卵巢癌、黑色素瘤、 前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和结直肠癌的癌细胞，或已经从卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和结直肠癌播散的癌细胞。
36.一种在哺乳动物中诱导针对表达Cij1的异常细胞发生免疫反应的方法，其特征在于包括用选自艾柯病毒，其修饰形式及其组合的病毒感染哺乳动物异常细胞，至少引起一些细胞裂解。
37.根据权利要求36中所述的方法，其特征在于所述的病毒包括艾柯病毒血清型或其修饰形式。
38.根据权利要求37中所述的方法，其特征在于所述的病毒选自EV1、EV7、EV8和 EV22。
39.根据权利要求37中所述的方法，其特征在于所述的病毒是修饰后的艾柯病毒。
40.根据权利要求39中所述的方法，其特征在于修饰所述的病毒以提高所述病毒感染异常细胞的能力。
41.根据权利要求39或30中所述的方法，其特征在于所述的被修饰病毒是选自EV1、 EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修饰形式。
42.根据权利要求36至41任何一项中所述的方法，其特征在于所述的异常细胞的 Q2^1的表达是上调的。
43.根据权利要求36至42任何一项中所述的方法，其特征在于所述的病毒与可感染异常细胞的另一个病毒联合给予哺乳动物。
44.根据权利要求43中所述的方法，其特征在于所述的异常细胞表达ICAM-1，所述的另一个病毒可识别ICAM-I以感染异常细胞。
45.根据权利要求44中所述的方法，其特征在于所述的另一个病毒是柯萨奇病毒或其修饰形式。
46.根据权利要求45中所述的方法，其特征在于所述的柯萨奇病毒是选自A13、A15、 A18和A21中的柯萨奇病毒血清型。
47.根据权利要求36至46任何一项中所述的方法，其特征在于所述的异常细胞是癌细胞。
48.根据权利要求47中所述的方法，其特征在于所述的癌细胞是选自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和结直肠癌的癌细胞，或从卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌或结直肠癌播散的癌细胞。
49.根据权利要求36至48任何一项中所述的方法，其特征在于所述的病毒通过局部、 全身或肿瘤内给药给予哺乳动物。
50.一种治疗哺乳动物异常细胞的药物组合物，包括产生病毒治疗细胞的接种物以使至少一些细胞被病毒和药学可接受的载体杀死，其特征在于所述的病毒选自可识别α 2 β工以感染细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。
51.根据权利要求50中所述的药物组合物，其特征在于所述的病毒包括艾柯病毒血清型或其修饰形式。
52.根据权利要求51中所述的药物组合物，其特征在于所述的病毒选自EV1、EV7、EV8 和 EV22。
53.根据权利要求49中所述的药物组合物，其特征在于所述的病毒是修饰后的艾柯病
54.根据权利要求51中所述的药物组合物，其特征在于修饰所述的病毒以提高病毒感染异常细胞的能力。
55.根据权利要求53或M中所述的药物组合物，其中被修饰的艾柯病毒是选自EV1、 EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修饰形式。
56.根据权利要求50至55任何一项中所述的药物组合物，其特征在于所述的异常细胞是癌细胞。
57.根据权利要求50至56任何一项中所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物是局部给药或注射的。
58.一种将接种物用于哺乳动物以产生病毒治疗哺乳动物异常细胞的涂药器，其特征在于所述的涂药器包括侵入接种的哺乳动物的区域，这样接种物可与哺乳动物接触，所述病毒选自可识别Qj1以感染细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。
59.根据权利要求58中所述的涂药器，其特征在于所述的病毒侵入的区域包括与哺乳动物保持接触的填料或填塞物。
60.根据权利要求58或59中所述的涂药器，其特征在于所述的异常细胞是异常皮肤细胞，所述涂药器进一步包括一个或多个与哺乳动物的皮肤粘附的粘附表面。
61.一种根据权利要求58至60中任何一项所述的涂药器，其特征在于是贴片或粘性膏药形式。
62.一种在制造药物时使用接种物来产生病毒，诱发哺乳动物对异常细胞的免疫反应的应用，其特征在于所述的病毒选自可识别Qj1以感染细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。
63.一种在制造药物时使用接种物来产生病毒，诱发哺乳动物对异常细胞的免疫反应的应用，其特征在于所述的病毒选自可识别Cij1以感染异常细胞并杀死细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。
全文摘要
本发明涉及一种通过小核糖核酸病毒直接介导的溶瘤作用治疗受试者恶性肿瘤的方法。本发明提供了治疗哺乳动物异常细胞如癌细胞的方法。该方法涉及使用病毒治疗哺乳动物，该病毒选自可识别α2β1以感染细胞的艾柯病毒，其修饰形式及其组合。本发明也提供了筛选用于本发明的方法中的病毒以及用于这些方法中的药物组合物的方法。
文档编号C12N7/00GK102166228SQ20111009101
公开日2011年8月31日 申请日期2003年12月18日 优先权日2002年12月18日
发明者D.雪弗伦 申请人:溶瘤病毒有限公司