专利名称：水稻基因OsbZIP46在调控耐热性和耐冷性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及(I)通过分离、克隆和功能验证得到一种能够提高对高温和低温耐受能力的水稻0sbZIP46基因，(2)该基因在水稻抗热性和抗冷性遗传改良中的应用。本发明采用候选基因筛选方法，克隆到控制水稻抗热性和抗冷性的基因0sbZIP46，超量表达0sbZIP46基因增强了对ABA信号的传导能力，提高了转基因水稻抗热和抗冷的能力，证实了该基因的功能及应用途径。
背景技术：
非生物胁迫如干旱、高盐、极端温度(热、冷)等会严重危害植物的生长发育，会导致农作物的大規模减产，制约农业发展。提高农作物的抗逆能力已经成为急需解决的关键 问题。通过转基因技术对农作物进行抗逆性遗传改良，培育耐逆性的作物品种显得越发重要，成为农业科学技术研究的主要目标之一。寻找植物中可真正用于抗逆性遗传改良的基因是其中的关键。植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，发生一系列生理和发育上的变化，来降低或消除胁迫给植株带来的危害。植物的这种应答反应是ー个涉及多基因、多信号途径的复杂过程。许多基因被证明受逆境诱导并在植物的对逆境的耐性方面发挥作用(Shinozaki等，1997)。这些基因及其表达产物可以分为三类參与信号级联放大系统和转录调控的基因及产物，如一些激酶和转录因子；直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。其中转录因子在植物对非生物胁迫的应答反应中起着非常重要的作用。它们在胁迫诱导下不断合成，调控一系列下游基因的表达，将信号传递和放大，引起植物生理生化方面的改变，最終使其产生相应的抗逆性。如拟南芥的DREB2A转录因子可能參与了对干旱、高温和低温的应答(Yoh Sakuma等，2009)。通过基因工程，部分逆境应答转录因子已经成功应用于水稻抗逆遗传育种，如利用水稻NAC家族转录因子SNAC2培育的转基因水稻显著提高了抗盐和抗冷能力(Hu等.2008);将拟南芥的CBF3在水稻内进行组成性超表达，显著提高了水稻的耐旱耐盐能力，还部分提高了水稻的耐冷性，同时没有引起植株其他表型上的变化(Oh等，2005)。bZIP转录因子含有碱性亮氨酸拉链结构域，广泛參与植物对非生物逆境的应答，迄今已鉴定出许多与逆境相关的bZIP转录因子。Liao等认为大豆中的131个bZIP基因中，有三分之一以上跟植株应答旱、盐、冷胁迫和ABA四种处理条件的至少ー种相关(Liaoet al.，2008)。bZIP转录因子參与依赖于ABA的胁迫应答。ABA是植物非生物逆境信号传导途径重要信号分子，非生物逆境以及外源ABA能诱导植物体内ABA的合成，bZIP蛋白也随之被激活并与ABA应答元件ABRE (ABA responsive element)结合,启动下游基因的表达(Choi等，2000)。拟南芥中已鉴定许多參与逆境应答的bZIP转录因子。Choi等用酵母One-Hybrid的方法从拟南芥中分离出4种逆境诱导的bZIP蛋白，分别称做ABF1、ABF2/AREBI、ABF3/DPBF5 和 ABF4/AREB2。其中 ABF2/AREB1、ABF3/DPBF5 和 ABF4/AREB2 的表达受ΑΒΑ、干旱和高盐的诱导，而ABFl的表达受冷的诱导，同时它们调节了大量抗逆相关基因的表达。超量表达ABF2提高了植株对葡萄糖的敏感性，并影响了植株对早、盐和热的耐性。ABF3和ABF4在拟南芥ABA和逆境信号传递中起着重要的作用，超量表达ABF3和ABF4后，提高了植株对ABA的敏感性，降低了蒸腾速率，提高了植株抗旱和抗盐能力(Choi et al.，2000 ；Kang et al. , 2002 ；Kim et al. ,2004 ；0h et al. ,2005 ；Zhou et al. ,2006)οΑΒΙδ是另ー个拟南芥中研究的比较多的与ABA信号传导相关的bZIP类转录因子。ABI5能被干早、盐和ABA诱导，超量表达ABI5能使转基因植株对ABA超敏感，提高其抗旱能力。水稻中也已鉴定ー些具有抗逆效果的bZIP转录因子基因，如0sABI5，0sbZIP23 (Zou等，2008 ；Xiang等，2008)。本发明涉及的0sbZIP46基因是水稻中bZIP家族成员之一，其生物学功能尚未报道。本发明通过候选基因筛选和鉴定，验证了 0sbZIP46基因參与水稻对ABA处理、高温和低温胁迫的应答，超量表达0sbZIP46基因表现出增强对ABA信号的传导，提高了转基因水稻抗热和抗冷的能力，因此本发明对于在极端气候条件频发的今天，培育对极端温度耐受能力增强的水稻具有重要的意义
发明内容
本发明的目的涉及ー个bZIP转录因子家族成员0sbZIP46基因在控制水稻抗热性和抗冷性改良中的应用。在水稻逆境处理后上升表达的转录因子中，其中ー个基因属于bZIP转录因子家族，申请人将该基因命名为0sbZIP46 (Qryza Sativa Stress-inducedTranscription factor 46)。本发明分离和应用一种包含0sbZIP46基因的DNA片段,该片段赋予水稻在高温条件下抗热性增强的能力，在低温条件下增强抗冷性的能力。其中，所述的含有0sbZIP46基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO : I所示，序列长度为975bp，它对应的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，其氨基酸序列为324个。携带有本发明0sbZIP46基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化,微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach, 1998,Method forPlant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411—463 ；Geiserson andCorey, 1998, Plant Molecular Biology (2nd Edition))。可使用包括本发明的0sbZIP46基因的表达载体转化宿主(包括水稻在内多种植物)，培育抗热植物品种和抗冷植物品种。本发明基因是受高温诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的高温诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在高温条件下可诱导表达基因，提高植物抗热性。下面结合附图和实施例对本发明做进ー步说明。
序列表SEQ ID NO 1是本发明分离克隆的包含有0sbZIP46基因编码区的核苷酸序列，序列长度为975bp，它对应的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，氨基酸序列为324个。图1.0sbZIP46基因在多种逆境和激素处理下的表达情況。各处理样品为干旱(drought)处理 0d, 3d, 5d,复水 12h ;高盐(salt)处理 Oh, 3h, 6h, 12h ;低温(cold)处理 Oh,3h，6h，12h;高温(heat)处理 Oh，2h，6h，12h ;氧化胁迫(H2O2)处理 0h，3h，6h，12h。激素处理茉莉酸(JA)处理0h，lh，3h，6h ;脱落酸(ΑΒΑ)，吲哚こ酸(IAA)，赤霉素(GA)，细胞分裂素(KT)，油菜素内酷(BR)处理都为0h，3h，6h，12h。图2. 0sbZIP46超表达载体示意图及超表达植株的表达量检测，CK为野生型对照。图3. 0sbZIP46的超表达材料在ABA处理下的发芽试验表型，ox2、oxl3、oxl5为超表达家系，ck9、ckl5为分离出来的转基因阴性家系，ZHll为野生型。
图4. 0sbZIP46的超表达材料在ABA处理下的发芽率统计，ox2、oxl3、oxl5为超表达家系，ck9、ckl5为分离出来的转基因阴性家系，ZHll为野生型。图5. 0sbZIP46的超表达材料在幼苗期对ABA敏感性试验表型，0sbZIP46U-15_0X、0sbZIP46U-2-0X 为超表达家系，0sbZIP46U_15_NCK、0sbZIP46U_2_NCK 为分离出来的转基因阴性家系。图6. 0sbZIP46的超表达植株在幼苗期对ABA敏感性试验的株高和根长统计，15-0X、2-0X为超表达家系，15-NCK.2-NCK为分离出来的转基因阴性家系。图7. 0sbZIP46超表达植株高温胁迫下的表型，OX为超表达家系，CK为野生型对照。图8. 0sbZIP46超表达植株高温胁迫后存活率统计，0sbZIP46U_2，0sbZIP46U_9，0sbZIP46U-15为超表达家系，ZHll为野生型对照。图9. 0sbZIP46超表达植株低温胁迫下的表型，OX为超表达家系，CK为野生型对照。图10. 0sbZIP46超表达植株高温胁迫后存活率统计，0sbZIP46U_2，0sbZIP46U_9，0sbZIP46U-15为超表达家系，ZHll为野生型对照。
具体实施例方式以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离、克隆包含有0sbZIP46基因完整编码区段的DNA片段，以及验证0sbZIP46基因功能的方法。根据以下的描述的全部或部分实施步骤，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。I、检测水稻内源0sbZIP46基因受逆境诱导水平为初步判断0sbZIP46基因是否与抗逆相关，本发明首先检测了水稻内源基因0sbZIP46是否受逆境诱导。申请人选用粳稻品种“中花11”(简称ZH11，来自中国农业科学院作物科学研究所)作为表达谱分析的材料。生长至4叶期幼苗进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是不浇水让其自然干燥，0d，3d，5d，复水12小时后取样；高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200mM NaCl的溶液，0h，3h，6h，12h后取样；低温胁迫是将幼苗放入4°C人エ气候室，0h，3h，6h，12h后取样。高温胁迫是将幼苗放入42で人エ气候室，011，211，611，12h后取样。氧化胁迫是将幼苗根部浸泡在1%11202溶液中，011，311，611，1211后取样。激素处理是用100 μ M的脱落酸(ABA)，油菜素内酯(BR)，吲哚こ酸(IAA)，细胞分裂素(KT)，赤霉素(GA)，茉莉酸(JA)分别均匀的喷洒水稻植株表面后并加到幼苗根部，茉莉酸(JA)按时间点0h，lh，3h，6h取样，其它按时间点0h，3h，6h，12h取样。总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照TRIZOL试剂说明书，利用反转录酶SSIII (购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA (方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为65°C 5min, 50°C 60min, 70°C IOmin0以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(0sbZIP46RealT-1025F :5，-CTTGGACCAAAGGCAAAGAGA-3，和 0sbZIP46RealT_1097R 5，-ACCGGAGACTCTGGCTTCAG-3，)对0sbZIP46基因进行特异的PCR扩增。同时用引物(actin76F :5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3，和 actin76R :5，_TGCACAAT GGATGGGTCAGA-3，)对水稻Actinl基因(登录号X16280)做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，45个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明，0sbZIP46基因(SEQ NO 1)在干旱，高盐，高温，氧化胁迫后诱导上升表达，0sbZIP46基因受ABA，IAA诱导上升表达(图I)。2、0sbZIP46基因超量表达载体的构建和遗传转化超量表达载体的构建为了研究0sbZIP46基因的抗逆功能，申请人将其在水稻中超量表达，期望从转基因植株的表型来研究该基因的功能。超量表达载体构建方法如下首先通过查找在水稻基因组注释网站TIGR(http://rice, plantbiology. msu.edu/)0sbZIP46 基因的注释号L0C_0s06gl0880,与 KOME (http://cdnaOl. dna. affrc.go. jp/cDNA/) 0sbZIP46 基因的注释号AK103188,预测 0sbZIP46 为ー个 bZIP 家族基因(该基因的完整核苷酸序列见SEQ ID NO :1所示，其编码区核苷酸长度为975bp，核苷酸序列对应的氨基酸序列为324个)。在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室明恢63全生育期平衡化cDNA文库(Chu等，2003)中检索到ー个含有0sbZIP46基因编码区5’部分序列的cDNA克隆(克隆号BI103-013)(该文库对外公开的网址http://redb. ncpgr. cn/modules/redbtools/)。从文库中挑取该克隆，抽提质粒，利用通用引物SP6(5’ -ATTTAGGTGACACTATA-3’)、T7(5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’ )从两端进行了测序验证，测序工作在ABI7500仪器上完成。然后与KOME数据库中的0sbZIP46基因的全长cDNA进行序列比较，确定克隆BI 103-013包含0sbZIP46基因的完整开放阅读框(0RF， open reading frame)。克隆BI103-013质粒用KpnI和BamHI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pCAMBIA1301U(pCAMBIA1301U是在国际上常用的植物遗传转化载体PCAMBIA1301基础上改建的，携帯具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体)，酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比为24 I)抽提，纯化酶切产物。用包含0sbZIP46基因的酶切片段和酶切的PCAMBIA1301U载体做连接反应，其后转化大肠杆菌DHlOii (该大肠杆菌DHlO β菌株购自Promega公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为0sbZIP46-1301U(图 2A)。遗传转化步骤通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述超表达载体0sbZIP46-1301U转入到水稻品种“中花11”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等,Efficient transformationof rice,Oryza sativa L ,mediated Dy Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNAiPlant J，6 :271-282,1994)基础上改良进行。本实施例的具体遗传转化步骤如下(I)电转化用1800v电压，将最终超表达目标载体0sbZIP46_1301U电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。(2)愈伤组织诱导将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用70%的乙醇处理I分钟；0. 15%氯化汞(HgCl2)表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1°C。(3)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1°C。(4)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗 下培养2周，温度25±1°C。(5)农杆菌培养在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105 (来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的超表达载体0sbZIP46_1301U)两天，培养温度28°C ;将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)，28°C摇床上培养2-3小时。(6)农杆菌侵染将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至0D_ 0. 8-1. 0 ;将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20°C。(7)愈伤洗漆和选择培养灭菌水洗漆愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm,潮霉素浓度250ppm)。(8)分化将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7天；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照(35001uX)下培养，温度26°C。(9)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C。(10)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。培养基组分及其配方(I)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA (6-BenzyIaminoPurine, 6-节基腺嘌呤)；CN (Carbenici 11 in,羧节青霉素)；KT (Kinetin,激动素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_aceticacid, 口引哚乙酸)；2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone,乙酸丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚讽)；N6max (N6 大量成分溶液);N6mix (N6微量成分溶液);MSmax (MS大量成分溶液);MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(IOX)]的配制
硝酸钾(KNO3)28.3 g
磷酸二氢钾(KH2PO4)4.0 g
硫酸铵((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸镁(MgSO4 .7H20)1.85 g
氯化钙(CaCl2 OH2O)1.66 g逐一溶解,然后室温下定容至1000ml。2) N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制
碘化钾(KI)0.08 g
硼酸(H3BO3)0.16g
硫酸锰(MnSO4MH2O)0.44 g
硫酸锌(ZnSO4IH2O)0.15 g室温下溶解并定容至1000ml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制
烟酸(Nicotinic acid)0.1 g
维生素BI (Thiamine HCl)0.1 g
维生素B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氨酸(Glycine)0.2 g
肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存备用。5)MS培养基大量元素母液(IOX)的配制
硝酸铵(NH4NO3)16.5 g
硝酸钾19.0 g
磷酸二氢钾1.7 g
硫酸镁3.7 g
氯化钙4.4 g室温下溶解并定容至1000ml。6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制碘化钾0.083 g
硼酸0.62 g
硫酸锰0.86 g
钥酸钠(Na2MoO4OH2O)0.025 g
硫酸铜(CuS04.5H20)0.0025 g室温下溶解并定容至1000ml。7)2，4_D 贮存液(lmg/ml)的配制称取2，4-D lOOmg，用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至IOOml,于室温下保存。 8)6-BA|C存液(lmg/ml)的配制称取6-BA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。9)萘乙酸(NAA)忙存液(lmg/ml)的配制称取NAA IOOmg,用ImllN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至IOOml，4°C保存备用。10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(lmg/ml)的配制称取IAA lOOmg，用ImllN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4°C保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4 *7H20)2. 78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水用。11)葡萄糖贮存液(0. 5g/ml)的配制称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。12) AS贮存液的配制称取AS 0. 392g, DMSO 10ml，分装至I. 5ml离心管内，4°C保存备用。13) IN氢氧化钾贮存液称取氢氧化钾5. 6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方I)诱导培养基
N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
2,4-D IC存液2.5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 gCH0-6 g鹿糖(Sucrose) 30gPhytagel 3 g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
2.4-DJC存液2.0 ml 脯氨酸0.5 g CH0.6 g 蔗糖30 g Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2.4-D贮存液0.75 ml CH0.15 g 蔗糖5g 琼脂粉(Agarose)1.75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u I AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2,4-D 贮存液0.75 ml
CH0.2 g
蔗糖5g
琼脂粉1.75 g
加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u I AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)0.5 ml
维生素贮存液(100X)I ml 2.4-D贮存液0.2 ml CH0.08 g 蔗糖2g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入Iml葡萄糖贮存液和100 u I AS贮存液。6)选择培养基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2.4-D贮存液0.625 ml CH0.15 g 蔗糖7.5 g 琼脂粉1.75 g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6. 0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 U IHN和400ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/皿)。7)预分化培养基N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
6-BA贮存液0.5 ml
KT贮存液0.5 ml
NAA贮存液50
IAA贮存液50 |il CH0.15g
蔗糖7.5 g
琼脂粉1.75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。使用前溶解培养基，
加入250 u IHN和200ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/ M )。8)分化培养基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)10 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
6-BA贮存液2 ml
KT贮存液2 ml
NAA JC存液0.2 ml
IAA IC存液0.2 ml
CHIg
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6. O。煮沸并定容至1000ml，分装到
50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。9)生根培养基
MSmax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)5 ml
维生素贮存液(100X)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。3、0sbZIP46超表达植株的表达量鉴定本发明采用Northern杂交方法对上述第2步获得的转基因水稻植株中0sbZIP46基因的表达进行检测。提取叶片的总RNACTrizol试剂，Invitrogen)，将15 Ug总RNA在I. 2%琼脂糖变性凝胶中电泳分离，转至尼龙膜，通过紫外交联固定，与32P标记的靶基因探针杂交，探针的标记、杂交、洗膜及显影等按《分子克隆》(科学出版社，1999)有关实验操作方法进行。表达量检测结果显示，大约一半转基因植株中0sbZIP46基因的表达量相对于野生型显著提高(图2B)。
4、0sbZIP46超表达植株的ABA敏感性鉴定
转基因家系对脱落酸(ABA)发芽敏感性检测是将将超量表达家系、转基因阴性对照家系和野生型的种子去壳消毒，直接在含ABA浓度梯度的MS培养基平板上发芽，在培养室避光生长并统计其发芽率。结果显示，在含3 ii M和6 ii MABA的MS培养基上，超表达家系的发芽率明显低于对照(转基因阴性家系和野生型)，在无ABA或I ii MABA的MS培养基上，两者发芽率无显著差异，说明超量表达0sbZIP46基因导致增强转基因植株发芽时对ABA的敏感性(图3和图4)。转基因家系ABA苗期生长敏感性检测是将超量表达转基因家系以及转基因阴性对照家系的种子去壳消毒，在含有100mg/L潮霉素的MS培养基上发芽，挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有3 u mo I/LABA的MS培养基在培养室避光生长。在生长一星期后分别观察表型和测量植株的根长和株高。结果显示超表达家系在ABA处理情况，根长和株高明显比对照要短，其生长受ABA的抑制更强烈，说明0sbZIP46基因导致转基因植株在苗期生长时对ABA的敏感性增强(图5和图6)。从以上两个阶段的实验结果可以看出，0sbZIP46超表达能增强了转基因植株对ABA的信号传导能力。5、0sbZIP46超表达植株的高温胁迫表型鉴定为了验证0sbZIP46超表达植株的抗热性，发明人对超表达植株进行了高温胁迫表型鉴定，将三个超表达家系(OX)和野生型家系(中花11，或称为ZH11)发芽后，挑选一致的植株种到小圆桶中，每桶种转基因植株和野生型对照各25株，置正常条件下生长。将生长正常的4叶期的植株移至42°C植物生长箱进行高温胁迫处理2天，然后恢复至正常条件生长一周，拍照并调查植株的存活率，试验设3次重复。结果显示，在高温胁迫处理过程中，野生型对照的叶片很快卷曲，失绿，萎蔫，而超表达植株并未表现出如此强烈的变化。经过高温胁迫并恢复生长一段时间之后，野生型(对照)的叶片基本都枯萎掉，无绿叶生长，而超表达植株部分叶片仍能恢复过来，且能很快恢复生长新的绿叶。进一步统计存活率发现野生型对照存活率低于40%，而超表达植株的存活率显著高于对照(在60%以上)。与野生型对照相比，超表达植株对高温胁迫表现出更强的抗性，说明0sbZIP46超表达后提高了植株的抗热性(图7和图8)。5、0sbZIP46超表达植株的低温胁迫表型鉴定为了验证0sbZIP46超表达植株的抗冷性，发明人也对超表达植株进行了低温胁迫表型鉴定，将三个超表达家系(OX)和野生型家系(ZHll)发芽后，挑选一致的植株种到小圆桶中，每桶种转基因植株和野生型对照各25株，置正常条件下生长。将生长正常的4叶期的植株移至4摄氏度冷库进行低温胁迫处理一周，然后恢复至正常条件生长一周，拍照并调查植株的存活率，试验设3次重复。结果显示，经过低温胁迫并恢复生长一段时间之后，超表达植株的存活率显著高于野生型对照(超表达植株的存活率在50%以上，而野生型植株的存活率低于30% )。与野生型对照相比，超表达植株对低温胁迫表现出更强的抗性，说明0sbZIP46超表达后提高了植株的抗 冷性(图9和图10)。
权利要求
1.水稻0sbZIP46基因在调控耐高温和低温遗传改良中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.水稻0sbZIP46基因在调控耐高温和低温遗传改良中的应用，其特征在于该基因的编码的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO 2所不。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻基因OsbZIP46在调控耐热性和耐冷性中的应用。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示；该基因的编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。本发明采用候选基因筛选方法，克隆到控制水稻抗热性和抗冷性的基因OsbZIP46，超量表达OsbZIP46基因增强了对ABA信号的传导能力，提高了转基因水稻抗热和抗冷的能力，证实了该基因的功能及应用途径。
文档编号C12N15/87GK102747099SQ20111009971
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者唐宁, 熊立仲 申请人:华中农业大学