专利名称：利用纤维水解液生产d-乳酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种利用纤维水解液生产D-乳酸的方法。
背景技术：
纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生性天然资源。据估计，地球上纤维素中所蕴藏的能量大约相当于6400亿吨的石油所含的能量，而且纤维素的可再生性是石油等矿质能源所不可比拟的。近年来随着对生物新材料的深入研究，特别是由乳酸聚合获得生物可降解材料-聚乳酸的深入研究，D-乳酸的应用前景和需求也越来越广泛。例如，通过向L-乳酸的聚合物中添加不同组分比例的D-乳酸，可调控最终材料的降解速度，从而控制聚乳酸的物理特性，使聚乳酸逐步取代各种非降解的石化来源的塑料。另外在医药、农药制药和除草剂方面的实际应用正日益引起人们的重视，由于D-乳酸作为一个手性物质，是合成多种手性物质的前提。D-乳酸可以作为钙拮抗剂降压药、优良除草剂-膘马、威霸、二甲四氯丙酸、氟系等的重要合成前体。随着研究的深入，D-乳酸用途不断扩宽，市场需求量也将随之不断增加，但是 D-乳酸的工业化生产仍然还是处于空白或停顿状态，这与D-乳酸生产技术有待突破有很大的关系。目前国内大多数的研究方向都为直接利用葡萄糖、玉米糖化液，国外虽然有利用纤维糖的研究，但工艺路线长、产酸低，纯度低。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法。为了实现本发明目的，本发明的一种利用纤维水解液生产D-乳酸的方法，其是在发酵过程中利用秸秆类木质纤维素原料水解液进行D-乳酸的发酵生产。本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。前述的方法，所述秸秆类木质纤维素原料水解液是先对秸秆类木质纤维素原料进行预处理，然后通过酶解得到的。前述的方法，所述预处理包括酸法处理、碱法处理或汽爆处理。经预处理的原料， 原料中的大部分纤维素在此过程中转化为小分子的葡萄糖。 前述的方法，所述酶解使用的酶为纤维素酶，酶加入量为10 30FPIU/克底物，酶解时间为30 80小时。前述的方法，所述D-乳酸发酵使用的发酵菌为芽孢乳杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、左旋乳酸芽孢杆菌、菊糖芽孢乳杆菌等。优选使用的发酵菌株为芽孢乳杆菌 (Bacillus Lactobacillus) Y2-8，保藏号为 CCTCC AA 208052。前述的方法，所述D-乳酸发酵的温度为30 38°C，发酵周期为48 96h。
前述的方法，所述秸秆包括玉米秸秆、玉米芯、高梁秸秆、小麦秸秆和稻草秸秆等。前述的方法，所述D-乳酸发酵中还添加适量玉米浆、酵母膏、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和/或碳酸钙等。利用芽孢乳杆菌Y2-8进行发酵的具体过程为按照10%接种量接种芽孢乳杆菌 Y2-8至含有秸秆类木质纤维素原料水解液的发酵培养基中，以0. 1-0. 2L/min的流量通入氮气，发酵温度30 38°C，控制发酵体系pH为5. 5，转速250 400rpm。优选地，氮气流量为 0. 12L/min,发酵温度 37°C，转速 300rpm。本发明提供的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，在发酵过程中利用玉米芯、秸秆等纤维素原料水解液进行D-乳酸的发酵，能够合成高光学纯度的D-乳酸，且原料易得， 成本低廉，发酵工艺简单方便，在保证产物高光学纯度的基础上达到较高的产酸能力。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的芽孢乳杆菌(Bacillus Lactobacillus)Y2_8，保藏号为 CCTCC AA 208052，购自中国典型培养物保藏中心。本发明中涉及到的溶液百分比，若未特别说明，是指IOOml溶液中含有溶质的克数。 实施例1芽孢乳杆菌Υ2-8发酵生产D-乳酸平板培养基葡萄糖10 %，酵母膏0. 3 %，无水乙酸钠0. 2 %，无水硫酸镁0. 01 %， 磷酸二氢钾0. 2%，琼脂2%，水余量，ρΗ7.0 ；种子培养基玉米芯水解液(以葡萄糖计)6%，酵母膏1%，蛋白胨1%，麸皮0. 5 %，无水硫酸镁0. 05 %，硫酸亚铁0. 002 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙2 %，水余量， pH7. 0 ；发酵培养基玉米芯水解液(以葡萄糖计)8 %，酵母膏2 %，玉米浆2 %，无水硫酸镁0. 02 %，硫酸亚铁0. 001 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙3 %，水余量，ρΗ7. 0。其中，玉米芯水解液的制备为玉米芯先经酸法处理后再酶解，酶解使用的酶为纤维素酶，酶加入量为10FPIU/克底物，酶解时间为80小时，获得玉米芯水解液。(酸法处理包括用4%硫酸(质量百分数)对玉米芯进行水解，水解温度130°C，水解时间150min，玉米芯与硫酸的重量体积比为1 8。玉米芯经酸法预处理后，半纤维素脱除率达到80%以上)将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度 37°C，培养时间20h。将平板培养好的芽袍乳杆菌接种到装液量为IOOmL的种子培养基中， 加入15粒玻璃珠，并以2-3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37°C，培养转速为 ISOrpm,培养时间16h，当种子液D66tlnm达到6左右时即可转接进入发酵培养。选用5. OL发酵罐，配置3. OL发酵培养基，以10% (ν/ν)接种量进行接种，以总流速0. lL/min量通入氮气，发酵温度37°C，通过流加氨水的形式发酵体系pH控制在5. 5，搅拌转速400rpm，发酵周期80h，用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达12.07%，光学纯度为 99. 03%。实施例2芽孢乳杆菌Y2-8发酵生产D-乳酸
平板培养基葡萄糖10 %，酵母膏0. 3 %，无水乙酸钠0. 2 %，无水硫酸镁0. 01 %， 磷酸二氢钾0. 2%，琼脂2%，水余量，pH7.0 ；种子培养基秸秆水解液(以葡萄糖计)6%，酵母膏1%，蛋白胨1.2%，麸皮0. 6 %，无水硫酸镁0. 05 %，硫酸亚铁0. 002 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙2 %，水余量， ρΗ7· 00 ； 发酵培养基秸秆水解液(以葡萄糖计)7 %，酵母膏2 %，玉米浆3 %，无水硫酸镁 0. 02%,硫酸亚铁0. 001 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙3%，水余量，pH7. 0。其中，秸秆水解液的制备为秸秆先经碱法处理后再酶解，酶解使用的酶为纤维素酶，酶加入量为20FPIU/克底物，酶解时间为60小时，获得秸秆水解液。(碱法处理包括 用5%氢氧化钠溶液进行水解，水解温度100°C，水解时间lOOmin，秸秆与碱溶液的重量体积比为1 6。秸秆经碱法预处理后，木质素脱除率达到70%以上)将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度 37°C，培养时间20h。将平板培养好的芽袍乳杆菌接种到装液量为IOOmL的种子培养基中， 加入15粒玻璃珠，并以2-3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37°C，培养转速为 220rpm,培养时间18h，当种子液D66tlnm达到6左右时即可转接进入发酵培养。选用5. OL发酵罐，配置3. OL发酵培养基，以10% (ν/ν)接种量进行接种，以总流速0. 12L/min量通入氮气，发酵温度37°C，通过流加氨水的形式发酵体系pH控制在5. 5，搅拌转速400rpm，发酵周期73h，用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达11. 35 %，光学纯度为 99. 01%。实施例3芽孢乳杆菌Y2-8发酵生产D-乳酸平板培养基葡萄糖10 %，酵母膏0. 3 %，无水乙酸钠0. 2 %，无水硫酸镁0. 01 %， 磷酸二氢钾0. 2%，琼脂2%，水余量，pH7.0 ；种子培养基秸秆汽爆水解液(以葡萄糖计)6%，酵母膏1. 2 %，蛋白胨1. O %， 麸皮0. 6 %，无水硫酸镁0. 05 %，硫酸亚铁0. 002 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙2 %，水余量， pH7. 00 ；发酵培养基秸秆汽爆水解液(以葡萄糖计)8%，酵母膏1%，玉米浆4%，无水硫酸镁0. 015 %，硫酸亚铁0. 001 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙3 %，水余量，pH7. O。其中，秸秆汽爆水解液的制备为秸秆先经汽爆法处理后再酶解，酶解使用的酶为纤维素酶，酶加入量为30FPIU/克底物，酶解时间为30小时，获得秸秆汽爆水解液。(汽爆法处理包括在汽爆机内装入玉米秸秆，打开蒸汽阀快速升温至220°C，保温15分钟后，关闭蒸汽阀，打开汽爆机汽爆快开阀将物料喷放出。喷放出的物料经离心分离，所得固相进行酶解)将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度 37°C，培养时间20h。将平板培养好的芽袍乳杆菌接种到装液量为IOOmL的种子培养基中， 加入15粒玻璃珠，并以2-3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37°C，培养转速为 200rpm,培养时间20h，当种子液D66tlnm达到6左右时即可转接进入发酵培养。选用5. OL发酵罐，配置3. OL发酵培养基，以10% (ν/ν)接种量进行接种，以总流速0. 12L/min量通入氮气，发酵温度37°C，通过流加氨水的形式发酵体系pH控制在5. 5，搅拌转速400rpm，发酵周期76h，用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达11. 93 %，光学纯度为 99. 05%。实施例4芽孢乳杆菌Y2-8发酵生产D-乳酸平板培养基葡萄糖10 %，酵母膏0. 3 %，无水乙酸钠0. 2 %，无水硫酸镁0. 01 %， 磷酸二氢钾0. 2%，琼脂2%，水余量，pH7.0 ；种子培养基玉米芯水解液(以葡萄糖计)6%，酵母膏1%，蛋白胨1%，麸皮0. 5 %，无水硫酸镁0. 05 %，硫酸亚铁0. 002 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙2 %，水余量， pH7. 0 ；发酵培养基玉米芯水解液(以葡萄糖计)8 %，酵母膏2 %，玉米浆2 %，无水硫酸镁0. 02 %，硫酸亚铁0. 001 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙3 %，水余量，ρΗ7. 0。其中，玉米芯水解液的制备为玉米芯先经酸法处理后再酶解，酶解使用的酶为纤维素酶，酶加入量为10FPIU/克底物，酶解时间为80小时，获得玉米芯水解液。(酸法处理包括用5%硫酸(质量百分数)进行水解，水解温度100°C，时间80min，玉米芯与酸的重量体积比为1 5，玉米芯经酸法预处理后，半纤维素脱除率达到80%以上)将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度 35°C，培养时间Mh。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为IOOmL的种子培养基中， 加入15粒玻璃珠，并以2-3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度35°C，培养转速为 150rpm,培养1 后，当种子液D66tlnm达到6左右时即可转接进入发酵培养。选用50L发酵罐，配制30L发酵培养基，以10% (ν/ν)接种量进行接种，以总流速 0. 12L/min量通入氮气，发酵温度35°C，以流加氨水的形式发酵体系pH控制在5. 0，搅拌转速300rpm，发酵周期80h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达11.41%，光学纯度为 99. 21%。实施例5芽孢乳杆菌Y2-8发酵生产D-乳酸平板培养基葡萄糖10 %，酵母膏0. 3 %，无水乙酸钠0. 2 %，无水硫酸镁0. 01 %， 磷酸二氢钾0. 2%，琼脂2%，水余量，pH7.0 ；种子培养基秸秆水解液(以葡萄糖计)6%，酵母膏1%，蛋白胨1.2%，麸皮0. 6 %，无水硫酸镁0. 05 %，硫酸亚铁0. 002 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙2 %，水余量， pH7. 0 ；发酵培养基秸秆水解液(以葡萄糖计)7 %，酵母膏2 %，玉米浆3 %，无水硫酸镁 0. 02%,硫酸亚铁0. 001 %，硫酸锰0. 001 %，碳酸钙3%，水余量，pH7. 0。其中，秸秆水解液的制备为秸秆先经碱法处理后再酶解，酶解使用的酶为纤维素酶，酶加入量为20FPIU/克底物，酶解时间为60小时，获得秸秆水解液。(碱法处理包括 用氢氧化钠溶液进行水解，水解温度150°C，水解时间180min，秸秆与碱溶液的重量体积比为1 10。秸秆经碱法预处理后，木质素脱除率达到70%以上)将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度 35°C，培养时间Mh。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为IOOmL的种子培养基中， 加入15粒玻璃珠，并以2-3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度35°C，培养转速为 150rpm,培养1 后，当种子液D66tlnm达到6左右时即可转接进入发酵培养。选用50L发酵罐，配制30L发酵培养基，以10% (ν/ν)接种量进行接种，以总流速 0. 12L/min量通入氮气，发酵温度35°C，以流加氨水的形式发酵体系pH控制在5. 0，搅拌转速300rpm，发酵周期79h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达11.63%，光学纯度为 99. 37%。 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种利用纤维水解液生产D-乳酸的方法，其特征在于，其是在发酵过程中利用秸秆类木质纤维素原料水解液进行D-乳酸的发酵生产。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述秸秆类木质纤维素原料水解液是先对秸秆类木质纤维素原料进行预处理，然后通过酶解得到的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预处理包括酸法处理、碱法处理或汽爆处理。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶解使用的酶为纤维素酶，酶加入量为10 30FPIU/克底物，酶解时间为30 80小时。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述D-乳酸发酵使用的发酵菌株为芽孢乳杆菌(Bacillus Lactobacillus)Y2-8，保藏号为 CCTCC AA 208052。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述D-乳酸发酵的温度为30 38°C，发酵周期为48 96h。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述秸秆包括玉米秸秆、玉米芯、高梁秸秆、小麦秸秆和稻草秸秆。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述D-乳酸发酵中还添加玉米浆、酵母膏、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和/或碳酸钙。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用芽孢乳杆菌Y2-8进行发酵的具体过程为按照10%接种量接种芽孢乳杆菌Y2-8至含有秸秆类木质纤维素原料水解液的发酵培养基中，以0. 1-0. 2L/min的流量通入氮气，发酵温度30 38°C，控制发酵体系pH为5. 5， 转速 250 400rpm。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，以0.12L/min的流量通入氮气，发酵温度 37°C，转速 300rpmo
全文摘要
本发明提供了一种利用玉米芯、秸秆等纤维素原料水解液进行D-乳酸发酵生产的方法，其是先将玉米芯、秸秆等纤维素原料进行预处理得到以葡萄糖为主的水解液，添加适量玉米浆、硫酸铵、磷酸二氢钾等辅料，加入微生物后发酵生产D-乳酸，得到的D-乳酸光学纯度高。本发明方法原料易得，成本低廉，发酵工艺简单方便，在保证产物高光学纯度的基础上达到较高的产酸能力，符合可持续发展原则。
文档编号C12R1/07GK102329824SQ20111029836
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者何冰芳, 戴嘉, 李维理, 李荣杰, 柏中中, 穆晓玲 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司