专利名称：两核苷酸同时合成dna测序方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，是一种实现核酸序列高通量测定的方法，具体涉及一种两核苷酸同时合成的编码、解码核酸序列测定方法及其应用。
背景技术：
随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。目前，无论是找寻新的还是确认已知SNP位点，传统的SangerDNA测序法，仍处于无可替代的地位。但这一方法存在通量低和价格高的问题。第一个人类基因组序列测定的费用大约为10亿美元，虽然目前这一费用已经大大降低，但功能基因组的研究进展仍然受限于DNA测序技术。为此，美国Venter 基金会在2003年提出了 1000美金人类全基因组测序的研究目标。美国国立卫生研究院人类基因组研究中心主任Collins教授指出大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。如Roche公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及Applied Biosestems公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割的SOLiD平台、pH敏感场效应管阵列芯片的Ion Torrent平台等高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。聚合酶链式反应(PCR)表明合成延伸反应理论上合成测序方法可以测定数千甚至上万个碱基，这无疑代表高通量核酸测序的巨大潜力。然而现有的合成测序要么是简单地每次只加一种核苷酸的方法通过确定每次合成的碱基的个数，或者通过可逆封闭核苷酸单体3端羟基的特殊单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现的。前者，要么每个模板需要独立的“反应池”而使得测序通量大大降低，要么是需要四个独立的反应来完成所有模板的一个碱基的测定而增加测序时间；后者由于在测定下一个碱基前需要将3端羟基的保护基团脱出，而每增加一步反应将导致反应效率的降低，最终导致测序长度的下降。本发明的目的就是通过一种两核苷酸同时合成的编码、解码核酸序列的测定方法，每组测序由包含四个标记的核苷酸A、G、C、T，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行两次由两个不同标记核苷酸同时合成测序反应的循环，每进行一次合成测序反应得到由核酸片段构成的一个编码，核酸片段的编码按照核苷酸的标记物和标记物的强度进行，一个序列片段对应一个编码，并用一个专属的符号表示，编码包括单个标记物对应的单个碱基字符、由两个不同标记物构成的两个碱基字符串，称之为母码，表示标记物或者碱基的种类码；以及由标记物强度反映的核苷酸个数构成，称之为子码，表示标记物强度对应的碱基个数码；若干次测序反应后得到由编码构成的核酸序列信息。当该组测序反应完成后，通过变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行下一组测序反应；最后将三组测序反应获得的三组编码信息，通过解码转化成三组核酸片段信息，并通过比较三组核酸片段信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的是提供一种基于两种3’端羟基非封闭核苷酸的同时合成测序方法来实现核酸序列的高通量测定，本发明有助于降低测定成本，具有方法简单的优点。技术方案一种两核苷酸同时合成DNA测序方法，待测核酸序列由标记的核苷酸 dATP、dGTP、dCTP、dUTP按照一定组合分成三组对同一模板进行三次测序每组测序由包含四个标记的核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dUTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行两次由两个不同标记核苷酸同时合成测序反应的循环，每进行一次合成测序反应得到由核酸片段构成的一个编码，核酸片段的编码包括按照核苷酸的标记物和标记物的强度进行，一个序列片段对应一个编码，并用一个专属的符号表示，编码包括单个标记物对应的单个碱基字符、由两个不同标记物构成的两个碱基字符串，称之为母码，表示标记物或者碱基的种类码；以及由标记物强度反映的核苷酸个数构成，称之为子码，表示标记物强度对应的碱基个数码；若干次测序反应后得到由若干个编码构成的核酸序列信息。当该组测序反应完成后，通过变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行下一组测序反应; 最后将三组测序反应获得的三组编码信息，通过解码转化成对应的三组核苷酸(碱基)片段信息，并通过比较三组核酸片段信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。标记核苷酸与相同的非标记核苷酸是按1 1000 1 1的摩尔比例参与进行合成测序反应的，其标记物是荧光染料或量子点，可以通过光学等检测获得标记物种类和强度信号的物质。核苷酸的标记物与核苷酸母体是通过含二硫键或酰胺键等的连接臂连接，并可以通过巯基乙醇或紫外光的辐射切割二硫键、酰胺键等而将标记物从测序合成链中清除。核苷酸标记物可以通过光、或者化学漂白的方式将标记物特性消除。待测核酸序列的解码是将每一组合成测序得到的一组编码信息，通过查阅编码表转换为碱基个数或者碱基序列片段的信息。待测核酸序列的组装是通过比较三组的合成测序得到明确碱基序列片段的信息， 按照测序的顺序确定出具体的碱基信息。两核苷酸同时合成DNA测序方法，步骤为a.全基因组模板制备将目标基因组用超声破碎成大小为100-500碱基的片段， 并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，并进行预扩增10 个循环；然后凝胶电泳切割160-200bp DNA片段，并纯化，将这些160_200bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的目标基因组，并将这些扩增双链DNA模板的微珠固定到平板基片上，通过变性得到目标基因组测序DNA模板；b.测序引物杂交将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有目标基因组DNA模板的测序引物；c.将Cy3-S-S-dNIPs和Cy5-S-S-dNIPs按照下述的方式进行两核苷酸同时合成循环测序一组-1 :Cy3-S-S-dATP、Cy5-S-S_dGTP ；—组 _2 :Cy3-S-S_dCTP、Cy5-S-S_dUTP ；二组-1 :Cy5-S-S-dATP、Cy5-S-S_dCTP ；二组 _2 :Cy3-S-S_dUTP、Cy5-S-S_dGTP ；三组-1:Cy3-S-S-dATP、Cy5-S-S_dUTP ；三组 _2 :Cy3-S-S_dCTP、Cy5-S-S_dGTP ；I)在第一组测序反应中，首先按照摩尔比Cy3-S-S_dATP/dATP =1 300、 Cy5-S-S-dGTP/dGTP = 1 500的比例将两核苷酸加入，在0. 25U/ μ L Klenow聚合酶作用下反应5分钟，然后用含0. 2%wtTrion X-100和2%wt SSCUwt SDS的缓冲液1洗涤， 最后用CCD成相，得到该次测序反应的荧光种类和强度信息的编码；II) 50mM的巯基乙醇在 37°C下处理10分钟，将二硫键切割，清除荧光基团；III)按照摩尔比Cy3-S-S-dCTP/dCTP =1 100、Cy5-S-S-dUTP/dUTP = 1 100 的比例将两核苷酸加入，在 0. 25U/μ L Klenow 聚合酶作用下反应5分钟，然后用含0. 2% wtTrion Χ-100和2% wt SSC-0. 1% wt SDS的缓冲液1洗涤，最后用CCD成相，得到该次测序反应的荧光种类和强度信息；IV)50mM的巯基乙醇在37°C下处理10分钟，将二硫键切割，清除荧光基团；V)循环步骤(II)-(IV)，直到获得所需核酸片段相应编码构成的序列信息；d.用8M尿素在75°C下处理5分钟，将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板；e.更换两核苷酸组合，按照上述a_d的布置分别将第二、三组的两核苷酸同时合成循环测序，分别得到第二、三组核酸片段编码构成的序列信息；f.按照编码对应核酸片段的方式，分别将每个模板第一、第二、三组行两核苷酸同时合成循环测序的编码信息转化为碱基片段信息；g.将每个模板第一、第二、三组的碱基片段信息，分别组装成碱基序列信息，将所有模板的碱基序列信息，分别组装得到目标基因组序列。上述两核苷酸同时合成DNA测序方法是在滚环、桥式或乳液扩增技术获得的DNA 模板的高通量合成测序中的应用。表 1
组循环合成测序步骤参与合成测序碱基第一组1Fl-dATP、F2- dGTP2Fl-dCTP、F2-dUTP第二组1F2-dATP、 Fl-dCTP2F2-dGTP、Fl-dUTP第三组1Fl-dATP、F2-dUTP2Fl-dCTP、F2-dGTP 表1是本发明一种两核苷酸同时合成DNA测序方法的一种分组方法。将标记核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dUTP分成三组，即第一组为核苷酸dATP、dGTP (碱基A、G标记不同的标记物)，核苷酸dCTP、dUTP (碱基C、T标记不同的标记物)分别进行两核苷酸同时合成测序反应的循环；第二组为核苷酸dATP、C (碱基A、C标记不同的标记物)，核苷酸dGTP、
6dUTP (碱基G、T标记不同的标记物)分别进行两核苷酸同时合成测序反应的循环；第三组为核苷酸碱基dATP、dUTP (碱基A、T标记不同的标记物)，碱基dCTP、dGTP (碱基C、G标记不同的标记物)分别进行两核苷酸同时合成测序反应的循环。表权利要求
1.一种两核苷酸同时合成DNA测序方法，其特征在于待测核酸序列由标记的核苷酸 dATP、dGTP、dCTP和dUTP按照一定组合分成三组对同一模板进行三次测序其中每组测序由包含四个标记的核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dUTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行两次由两个不同标记核苷酸同时合成测序反应的循环，每进行一次合成测序反应得到由核酸片段构成的一个编码，核酸片段的编码包括按照核苷酸的标记物和标记物的强度进行，一个序列片段对应一个编码，并用一个专属的符号表示，编码包括单个标记物对应的单个碱基字符、由两个不同标记物构成的两个碱基字符串，称之为母码，表示标记物或者碱基的种类码；以及由标记物强度反映的核苷酸个数构成，称之为子码，表示标记物强度对应的碱基个数码；若干次测序反应后得到由若干个编码构成的核酸序列信息；当该组测序反应完成后，通过变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行下一组测序反应；最后将三组测序反应获得的三组编码信息，通过解码转化成对应的三组核苷酸(碱基)片段信息，并通过比较三组核酸片段信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。
2.根据权利要求1所述的两核苷酸同时合成DNA测序方法，其特征在于标记核苷酸与相同的非标记核苷酸是按1 :1000 1 :1的摩尔比例参与进行合成测序反应的，其标记物是荧光染料或量子点，可以通过光学等检测获得标记物种类和强度信号的物质。
3.根据权利要求1所述的两核苷酸同时合成DNA测序方法，其特征在于核苷酸的标记物与核苷酸母体是通过含二硫键或酰胺键等的连接臂连接，并可以通过β-巯基乙醇或紫外光的辐射切割二硫键、酰胺键等而将标记物从测序合成链中清除。
4.根据权利要求1所述的两核苷酸同时合成DNA测序方法，其特征在于核苷酸标记物可以通过光、或者化学漂白的方式将标记物特性消除。
5.根据权利要求1所述的两核苷酸同时合成DNA测序方法，其特征在于待测核酸序列的解码是将每一组合成测序得到的一组编码信息，通过查阅编码表转换为碱基个数或者碱基序列片段的信息。
6.根据权利要求1所述的两核苷酸同时合成DNA测序方法，其特征在于待测核酸序列的组装是通过比较三组的合成测序得到明确碱基序列片段的信息，按照测序的顺序确定出具体的碱基信息。
7.根据权利要求1所述的两核苷酸同时合成DNA测序方法，其特征在于步骤为a.全基因组模板制备将目标基因组用超声破碎成大小为100-500碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，并进行预扩增10个循环；然后凝胶电泳切割160-200bp DNA片段，并纯化，将这些160_200bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的目标基因组，并将这些扩增双链DNA模板的微珠固定到平板基片上，通过变性得到目标基因组测序DNA模板；b.测序引物杂交将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有目标基因组DNA模板的测序引物；c.将Cy3-S-S-dNIPs和Cy5-S-S-dNIPs按照下述的方式进行两核苷酸同时合成循环测序一组一1 :Cy3-S-S-dATP、Cy5-S-S-dGTP ；一组一2 :Cy3-S-S_dCTP、Cy5-S-S-dUTP ；二组一1 :Cy5-S-S-dATP、Cy5-S-S-dCTP ；二组一2 :Cy3-S-S_dUTP、Cy5-S-S-dGTP ；三组一1 :Cy3-S-S-dATP、Cy5-S-S-dUTP ；三组一2 :Cy3-S-S_dCTP、Cy5-S-S-dGTP ；I )在第一组测序反应中，首先按照摩尔比Cy3-S-S-dATP/dATP= 1 300、 Cy5-S-S-dGTP/ dGTP= 1 500的比例将两核苷酸加入，在0. 25U/μ L Klenow聚合酶作用下反应5分钟，然后用含0. 2% wt Trion Χ-100和2%wt SSC-0. l%wt SDS的缓冲液1洗涤， 最后用CCD成相，得到该次测序反应的荧光种类和强度信息的编码；II)50mM的巯基乙醇在 37°C下处理10分钟，将二硫键切割，清除荧光基团；III)按照摩尔比Cy3-S-S-dCTP/dCTP= 1 100、Cy5-S-S-dUTP/dUTP= 1 100 的比例将两核苷酸加入，在 0. 25U/μ L Klenow 聚合酶作用下反应5分钟，然后用含0. 2% wt Trion Χ-100和2%wt SSC-0. l%wt SDS的缓冲液 1洗涤，最后用CCD成相，得到该次测序反应的荧光种类和强度信息；IV) 50mM的巯基乙醇在37°C下处理10分钟，将二硫键切割，清除荧光基团；V)循环步骤(II)-- (IV)，直到获得所需核酸片段相应编码构成的序列信息；d.用8M尿素在75°C下处理5分钟，将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板；e.更换两核苷酸组合，按照上述a— d的布置分别将第二、三组的两核苷酸同时合成循环测序，分别得到第二、三组核酸片段编码构成的序列信息；f.按照预定编码对应核酸片段的方式，分别将每个模板第一、第二、三组行两核苷酸同时合成循环测序的编码信息转化为碱基片段信息；g.将每个模板第一、第二、三组的碱基片段信息，分别组装成碱基序列信息，将所有模板的碱基序列信息，分别组装得到目标基因组序列。
8.上述任一权利所述的两核苷酸同时合成DNA测序方法是在滚环、桥式或乳液扩增技术获得的DNA模板的高通量合成测序中的应用。
全文摘要
两核苷酸同时合成DNA测序方法及其应用，待测核酸序列由标记的核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dUTP按照一定组合分成三组对同一模板进行三次测序每组测序由包含四个标记的核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dUTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行两次由两个不同标记核苷酸同时合成测序反应的循环，每进行一次测序反应得到由核苷酸(碱基)片段构成的一个编码，若干次测序反应后得到由一组若干编码构成的核酸序列信息；当该组测序反应完成后，通过变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行下一组测序反应，最后将三组测序反应获得的三组编码信息，通过解码转化成对应的三组核苷酸(碱基)片段信息，并通过比较三组核苷酸(碱基)信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。
文档编号C12Q1/68GK102329884SQ20111032179
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者肖鹏峰, 陆祖宏 申请人:东南大学