专利名称：双路温控聚合酶链式反应器与实时检测装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及荧光聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)在微流控芯片上实现DNA扩增及实时荧光检测，应用于生化反应和医学检测领域。
背景技术：
医学与生化检测设备中微型化是一个重要发展方向，微机电系统技术 (Micro-electro-mechanical systems, MEMS)的发展为PCR反应在芯片上完成提供了可能。传统荧光PCR仪中存在以下缺点仪器体积大，升降温速率慢，动态控温，温度精度不高，半导体加热制冷器长期温度骤变寿命缩短。现在利用MEMS技术制造的PCR反应芯片分为三种微阱式芯片、微流控芯片和微水浴芯片。微阱式芯片存在以下缺点升降温速率慢，动态控温，温度精度不高，一般只有合金层微加热器，没有主动式的制冷器，如专利 200310122607. 9和200510011180. 4等。微流控芯片存在以下缺点一般只有合金层微加热器，没有主动制冷器，如专利200410024703. 4等。微水浴芯片200610043243. 9等，加热制冷结构复杂。利用MEMS技术制造的PCR反应芯片，解决了仪器体积大的问题，但是又出现了主动制冷、实时荧光检测在芯片上集成的难题。
实用新型内容本实用新型目的是通过两路半导体加热制冷实现三个恒温区的控制，并且利用半导体工艺加工光源与半导体加热制冷器，利用MEMS技术构建精简温控聚合酶链式反应与实时检测装置。为实现上述目的，本实用新型采取以下技术方案双路温控聚合酶链式反应器与实时检测装置，它包括微流控芯片，该芯片包括带有环形微流道的基底层1、盖板层2，基底层1和盖板层 2 一起构成微流控芯片；盖板层2上有一个进样孔3和一个出样孔4，进样孔3和出样孔4 位于环形微流道上；基底层1的材料为具有良好导热性能的材料；盖板层2采用透光材料；热循环单元，该单元包括半导体加热制冷器5和驱动电路、温度传感器6，以及基于微处理器与比例积分微分算法的控制模块；两个半导体加热制冷器5在环形微流体的下方根据控制温度的不同形成变性区、退火区和延伸区；变性区、延伸区中温度传感器6放置在半导体加热制冷器5和微流控芯片之间，退火区中温度传感器6放于微流控芯片下方；温度传感器6连接至控制模块，控制模块连接至驱动电路，驱动电路与半导体加热制冷器5相连，控制半导体加热制冷器5的加热或制冷温度；实时荧光检测单元，该单元包括光源9、光电探测器8和上述的控制模块；光源9 为发光二极管，放置于基底层1和盖板层2之间，通过键合工艺固定在基底层上；光电探测器8放置在微流控芯片上方，正对光源9，用光学支架7固定光电探测器8 ；光源9与光电探测器8垂直放置；光电探测器8连接至控制模块。上述热循环单元和实时荧光检测单元中的控制模块连接至计算机。[0010]所述的基底层1与盖板层2以键合技术密封在一起形成微流控芯片.所述的温度传感器6为钼电阻传感器；半导体加热制冷器5、温度传感器6、光源 8、采用半导体工艺制作、。所述的控制模块是以采用数字信号处理器DSP或现场可编程门阵列FPGA为核心的控制模块。控制整个装置的计算机接口采用串口或USB或蓝牙或Wi-Fi或internet网络有线或无线方式连接至控制模块。所述的两个半导体加热制冷器5所控制的温度分别为95°C和72°C，95°C的半导体加热制冷器所在的区域形成变性区，72°C的半导体加热制冷器所在的区域形成延伸区，变性区和延伸区之间由于温度下降构成温度为65°C的延伸区。双路温控聚合酶链式反应器与实时检测装置包括带有环形微流道结构的基底层， 基底层与盖板层以键合技术密封在一起形成微流控芯片，在盖板层上有一个进样孔和一个出样孔。采用微处理器数字信号处理器(Digital Signal Processor, DSP)或现场可编程门阵列(Field -Programmable Gate Array, FPGA)通过控制两路半导体加热制冷，使整个微流道区域形成PCR反应所需的变性区、退火区、延伸区三个恒定温度场。半导体加热制冷器在微流控芯片的下方，钼电阻温度传感器置于微流控芯片和半导体加热制冷器之间， 为DSP/FPGA提供温度反馈信号，利用比例积分微分(Proportional-integral-derivative ，PID)算法形成闭环控制。半导体加热制冷器与钼电阻温度传感器是采用半导体工艺制作的。实时荧光检测系统包括光源、光电探测器和荧光信号采集处理系统。光源采用发光二极管(Light Emitting Diode，LED)，放置于基底层和盖板层之间，通过键合工艺固定在基底层上；光电探测器放置在微流控芯片上方，用支架固定光电检测装置。光源与光电探测器垂直放置，实时检测PCR的荧光信号。荧光信号采集处理系统与温度控制系统通过微处理器连接到计算机上。微流控芯片利用MEMS技术制造带有环形微流道的基底层，盖板层上有一个进样孔和一个出样孔，根据动力学原理设计的倾斜式贯通孔可以防止样品外溢。基底层与盖板层以键合技术密封在一起形成微流控芯片。底板材料为导热材料，盖板材料具有良好光学特性的透光材料。样品从进样口进样，样品在微流道内流动依次经过变性区、退火区、延伸区，样品流动一圈即完成一次PCR反应。利用MEMS技术制造的微流控芯片实现了微量反应体系。热循环单元，该单元包括半导体加热制冷器5和驱动电路、温度传感器6，以及基于微处理器与比例积分微分算法的控制模块。半导体加热制冷器在环形微流体通道的下方。温度传感器放置在半导体加热制冷器和微流控芯片之间。半导体加热制冷器与钼电阻温度传感器是采用半导体工艺制作的。采用微处理器DSP/FPGA输出脉宽调制波(Pulse-width modulating，P丽)控制两路半导体加热制冷，三个钼电阻温度传感器为DSP/FPGA提供温度反馈信号，采用PID算法闭环控制调节温度，使整个微流道区域形成PCR反应所需的变性区、退火区、延伸区三个恒定温度场。两路半导体加热制冷器控制微流道相应区域恒温在PCR反应中的变性温度和延伸温度，典型温度别分为95°C和72°C。在两个恒温区周围会形成温度梯度场，通过控制半导体加热制冷器的功率、尺寸、放置位置等因素，在两恒温区之间会出现PCR反应中退火温度，典型温度为65°C。实时荧光检测装置包括固定支架、包括光源、光电探测器和荧光信号采集处理系统。光源采用半导体工艺制作的发光二极管，放置于基底层和盖板层之间，通过键合工艺固定在基底层上；光电探测器放置在微流控芯片上方，用固定支架固定光电检测装置。光源与光电探测器垂直放置。样品在微流道内流动一圈即完成一次扩增反应，期间利用光源照射样品，样品中的靶基因结合荧光基团，吸收光源能量后发射出特定波长的荧光，由于靶基因浓度与荧光强度成比例，通过检测荧光强度就可以实现实时定量荧光检测。光电探测器位于微流控芯片中的延伸区上方。本实用新型具有实质性的特点与进步，本实用新型的技术效果与经典的实时 PCR仪相比，利用MEMS技术制作微流控芯片，试剂微量化；通过三个恒温区的设计省去了升降温时间大大缩短了聚合酶链式反应的时间，同时延长了半导体加热制冷器的使用寿命。 与已经实用新型的PCR微流控芯片相比，在芯片上制作半导体加热制冷器代替现有的微加热器，不仅可以加热而且可以主动制冷；提出一个低成本高灵敏度的实时荧光检测系统，光源采用半导体工艺制作的发光二极管，光源与光电探测器垂直放置；微处理器采用数字信号处理器或现场可编程门阵列，可以方便地集成在微流控芯片上。与经典的实时PCR仪和已经实用新型的PCR微流控芯片相比，通过控制两路半导体加热制冷使整个微流道区域形成三个恒温区，精简了加热制冷装置。
以下结合附图对本实用新型进一步说明。
图1本实用新型的结构俯视图。图2本实用新型的结构侧视图。图3根据本实用新型的结构，计算机仿真的结果图。图4本实用新型的系统框图。图中1、带有环形微流道的基底层，2、盖板层，3、进样孔，4、出样孔，5、半导体加热制冷器，6、钼电阻温度传感器，7、光学支架，8、光电探测器，9光源。具体实施方法如
图1和2所示，本实用新型包括微流控芯片、温度控制系统和实时荧光检测装置。在微流控芯片下方是温度控制系统，在微流控芯片的上方是实时荧光检测器。微流控芯片连接方式是，带有环形微流道的基底层1和盖板层2都是利用MEMS工艺制造，通过键合成为一体。在盖板层2上有一个进样孔3和一个出样孔4，样品从进样孔3 进样，样品依次流过变性温区、退火温区、延伸温区，反复循环完成扩增反应，从出样孔4排出ο在微流控芯片下方是两个半导体加热制冷器5，在微流控芯片和半导体加热制冷器5之间设置钼电阻温度传感器6，实时监测PCR反应过程中的三个特征温度。采用微处理器DSP/FPGA输出脉宽调制波PWM控制两路半导体加热制冷，三个钼电阻温度传感器为DSP/ FPGA提供温度反馈信号，采用PID算法形成闭环控制调节温度，使整个微流道区域形成PCR 反应所需的变性区、退火区、延伸区三个恒定温度场。通过控制变性区半导体加热制冷器5 使微流道变性区恒温在典型温度95°C，为变性过程提供恒温；通过控制延伸区半导体加热制冷器5使微流道延伸区恒温在典型温度72°C，为延伸过程提供恒温。以两个半导体加热制冷器5为中心形成温度梯度场，在微流道的变性区和延伸区之间的区域温度会低于以上两个区域，通过控制可以实现微流道其中有一段区域的温度为退火典型温度65°C。如图3 所示，利用计算机仿真软件对其进行仿真模拟。本仿真中以样品5微升为例，这里样品参数用水代替，环形微流道内半径为12. 5毫米，外半径为14毫米。加载的边界条件为微流道变性区恒温在典型温度95°C，微流道延伸区恒温在典型温度72°C，如图3所示，加热2. 33分钟之后的结果，在变性区和延伸区之间形成一段恒温区在65°C，满足退火的特征温度，此温度场满足整个PCR反应的温度条件。实时荧光检测系统包括光源9、光电探测器8、光学支架7和荧光信号采集处理系统。光源9采用发光二极管，放置于基底层和盖板层之间，通过键合工艺固定在基底层上； 光电探测器8放置在微流控芯片上方，用光学支架7固定光电检测装置。光源9与光电探测器8垂直放置。样品沿微流道1流动，经过变性区、退火区、延伸区温区，样品流动一圈即完成一次扩增反应，此过程反复循环就可以完成多次扩增反应。光源9和光电探测器8分别位于微流控芯片中延伸区的侧方和上方，在此典型位置可以使样品完成一次扩增后进行一次实时荧光定量检测。如图4所示，荧光信号采集处理系统与温度控制系统通过微处理器连接到计算机上，热循环系统和实时荧光检测系统所用的微处理器为数字信号处理器或现场可编程门阵列，数字信号处理器或现场可编程门阵列通过串口或USB或蓝牙或Wi-Fi或internet网络等有线或无线方式连接到计算机上，上位机程序控制整个装置。
权利要求1.双路温控聚合酶链式反应器与实时检测装置，其特征在于它包括微流控芯片，该芯片包括带有环形微流道的基底层(1)、盖板层(2)，基底层(1)和盖板层(2) —起构成微流控芯片；盖板层(2)上有一个进样孔(3)和一个出样孔(4)，进样孔 ⑶和出样孔⑷位于环形微流道上；基底层⑴的材料为具有良好导热性能的材料；盖板层(2)采用透光材料；热循环单元，该单元包括半导体加热制冷器(5)和驱动电路、温度传感器(6)，以及基于微处理器比例积分微分算法的控制模块；两个半导体加热制冷器(5)在环形微流体的下方根据控制温度的不同形成变性区、退火区和延伸区；温度传感器(6)放置在半导体加热制冷器(5)和微流控芯片之间；温度传感器(6)连接至控制模块，控制模块连接至驱动电路，驱动电路与半导体加热制冷器件(5)相连，控制半导体加热制冷器件(5)的加热或制冷温度；实时荧光检测单元，该单元包括光源(9)、光电探测器(8)和上述的控制模块；光源(9) 为发光二极管，放置于基底层(1)和盖板层(2)之间，通过键合工艺固定在基底层上；光电探测器⑶放置在微流控芯片上方，正对光源(9)，用光学支架(7)固定光电探测器⑶；光源(9)与光电探测器(8)垂直放置；光电探测器(8)连接至控制模块。上述的控制模块连接至计算机。
2.根据权利要求1所述的温控聚合酶链式反应与实时检测装置，其特征在于所述的基底层(1)与盖板层(2)以键合技术密封在一起形成微流控芯片.
3.根据权利要求1所述的温控聚合酶链式反应与实时检测装置，其特征在于所述的温度传感器(6)为钼电阻传感器；半导体加热制冷器(5)、温度传感器(6)、光源(8)采用半导体工艺制作。
4.根据权利要求1所述的温控聚合酶链式反应与实时检测装置，其特征在于所述的控制模块是以采用数字信号处理器DSP或现场可编程门阵列FPGA为核心的控制模块。
5.根据权利要求1所述的温控聚合酶链式反应与实时检测装置，其特征在于控制整个装置的计算机接口采用串口或USB或蓝牙或Wi-Fi或internet网络有线或无线方式连接至控制模块。
6.根据权利要求1所述的温控聚合酶链式反应与实时检测装置，其特征在于所述的两个半导体加热制冷器(5)所控制的温度分别为95°C和72°C，95°C的半导体加热制冷器所在的区域形成变性区，72°C的半导体加热制冷器所在的区域形成延伸区，变性区和延伸区之间由于温度下降构成温度为65°C的延伸区。
专利摘要双路温控聚合酶链式反应器与实时检测装置，应用于生化反应和医学检测领域，其包括带有环形微流道结构的基底层，基底层与盖板层密封形成微流控芯片，在盖板层上有一个进样孔和一个出样孔。采用微处理器控制两个半导体加热制冷，在整个微流道区域形成聚合酶链式反应所需的变性区、退火区、延伸区三个恒定温度场。半导体加热制冷器在微流控芯片的下方，采用半导体工艺制作的铂电阻温度传感器置于微流控道片和半导体加热制冷器之间，为微处理器提供温度反馈信号，形成闭环控制。实时荧光检测系统包括光源、光电探测器和荧光信号采集处理系统。本实用新型通过控制两路半导体加热制冷使整个微流道区域形成三个恒温区，精简了加热制冷装置。
文档编号C12M1/00GK202116542SQ2011201659
公开日2012年1月18日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者冯继宏, 刘有军, 吴水才, 孔晶晶, 常宇, 张晓光, 曾毅, 王冬, 袁玉强 申请人:北京工业大学