专利名称：一种能促进vbnc细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物筛选和培养领域，尤其涉及一种活的非可培养(VBNC)菌种的复苏培养基及其制备方法和应用。
背景技术：
VBNC (viable but non-culture)指的是有些微生物可以在它们的栖息地被检测到存在，但不能在实验室进行人工培养。1982年徐怀恕等通过对V. cholerae和 E. coli存活规律的研究，首次发现并提出了细菌〃活的非可培养〃状态(Viable but non-culturable state, VBNC),即细菌处于不良环境条件下,其细胞通常缩成球形(最近许多研究中发现还有些细菌表现为体积增大，细胞伸长)，用常规方法培养不能使其生长繁殖，但仍然具有代谢活性，在DNA合成抑制剂的作用下，添加一定量的营养物培养时，这些细胞虽然不能分裂，但仍可以伸长生长，证明其仍然存活，并非死亡.处于VBNC状态的细菌，在一定的条件下可以复苏。现在在自然生态环境中的细菌能够经传统分离法获取的仅有O. 01-10%,绝大部分处于活的非可培养(VBNC)、类似于休眠的状态。就环境微生物资源而言，如何获取自然界中 90-99. 99%的资源菌种需要有新思路、新方法的创新，才能挖掘、开发、利用这些未知的微生物资源。中国发明专利申请(申请号200810051555. 3申请日2008-12-09)公开了一种 VBNC沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法，复苏液是由血清I份、灭菌纯水I 3份组成，经混合搅拌混匀，用微孔滤器过滤除菌制得；将进入VBNC的沙门氏菌置于复苏液中， 在热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在 5°C到37°C区间，温育时间为2MIN I. 5H ;然后接种于SS液体培养基，并在气浴振荡摇床内，200 220R/MIN 培养。(丁林贤，苏晓梅，横田明.活的但非可培养(VBNC)状态菌的研究进展及应用展望·《微生物学报》.2011，51 (7) : 858-862.)阐述了 VBNC状态菌的形成机理、转变与种类、复苏、研究意义及其应用展望。并报道了丁林贤等在十余年间针对生态环境中处于 VBNC状态菌的复苏、可培养化、系统进化关系及潜在功能等方面的一些研究成果，拟为微生物资源的开发与应用提供新的科学依据。并公开了复活促进因子(Rpf,resuscitation promotingfactor)是由藤黄球菌CK Iuteus)分泌的一种能使处于VBNC状态的该菌重新恢复其生长繁殖能力的蛋白质，分子量约为16 — 17 kDa。Mukamolova报道了 Rpf可以复苏处于VBNC时期的革兰氏阳性菌属的结核分枝杆菌(#. tuberculosis)、
牛分枝杆菌他 bovis )、堪萨斯分枝杆菌(M· kansasii)，耻垢分枝杆菌(M· smegmatis)和鸟分枝杆菌(M· avium)等。并且同Rpf相似的基因也在链霉菌、结核菌、 棒状杆菌等高GC的革兰氏阳性菌中被发现。另外,Mukamolova等人还报道了 Rpf采用自分泌或旁分泌的方式分泌信号，不但能使休眠的微生物复活，还可以刺激正常菌的生长，并能调控细胞的繁殖过程。但是在该文献中没有公开采用何种配方的复苏培养基，而且在实际应用中，单纯的复活促进因子在促进非可培养(VBNC)状态菌复苏生长以及分离丰度上效果还未非常显著
发明内容
为了解决活的非可培养(VBNC)菌种的复苏生长以及分离丰度的技术问题。本发明的第一个目的是提供一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，该培养基利用一种特殊蛋白质信号分子构建能够促进VBNC细菌复苏生长，提高从生态环境中分离VBNC细菌丰度。第二个目的是提供上述的复苏培养基的制备方法。第三个目的是提供上述的复苏培养基的应用。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案
一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，该复苏培养基由培养基基液、细菌液和土壤液构成；所述的细菌液由藤黄微球菌菌种在菌种液体培养基上培养至对数期后期，经离心去除菌种液体培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，细菌液按体积比为培养基基液的O. 5-30% ;所述的土壤液由经风干、过筛、去除杂质的土壤，加水，多次灭菌，过滤取滤液或离心取上清液，土壤液按体积比为培养基基液的O. 1-20%。作为优选，上述的细菌液按体积比为培养基基液的1_10%，土壤液按体积比为培养基基液的1_5%。作为优选，上述的培养基基液选用以下配方中的一种
A、一般细菌复苏培养使用的配方
细菌用胰蛋白胨 8.(Tl5.0g，
酵母抽提液3. (Γ8. Og,
麦芽提取物3. (Γ8. Og,
牛肉膏l.(T3.0g，
酪蛋白氨基酸 3.(T8.0g，
甘油L(T3.0g，
吐温-80O. 03 O. Ig,
七水硫酸镁O. 5^2. Og,
加去离子水IOOOmL,调节ρΗ7· O ；
B、适合革兰氏阳性菌无枝菌酸菌属(Amycolatopsis属)的配方
葡萄糖2. O 6. Og,
酵母抽提液 2. O 6. Og,
麦芽抽提液 O. 6^2. O g，
蒸懼水1000.0 ml,
pH 7. 2，配置琼脂培养基时加用碳酸钙CaC03，I. O 3. Og ；
C、适合革兰氏阳性菌节杆菌属(Arthrobacter属)、红球菌iRhodococcus属)、莱夫氏属(lej· fsonia属)、诺卡氏属iNocardia属)、北里孢属(Ji tasa tospora属)、链霉菌属 (.Streptomyces属)、枯草杆菌属{Bacillus属)、类芽孢杆菌属iPaenibacillus属)的配方蛋白胨3.0 8.0 g
酵母提取物 I. 0 5. 5 g，
葡萄糖O. 5^2. O g，β-苯乙醇 2.0 "4. 0ml,
杀真囷素 O. 03 O. 08 g,
放线菌酮 O. 02 O. 08 g，
去离子水 1000 ml, pH 7. O ;
D、适合贫营养土壤生态中的细菌的配方
营养肉汤I. O 2. 50 g,
酵母提取液 O. 20 L Og,
蒸馏水1000 ml, pH 7. O ；
E、适合贫营养深水生态中的细菌的配方
酪蛋白l.(T3.0 g，
豆柏O. 10^0. 50 g,
氯化钠O. 20 1· O g,
磷酸氢二钾 O. Γ0. 5 g，
葡萄糖O. Γθ. 5 g，
蒸馏水1000 ml, pH 7. 3。在需要配制固体培养基时，在所述的A、B、C、D或E的各组配方中加琼脂15 20g， 经ll(Tl30°C、l(T30min高压灭菌后冷却使用。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案
一种制备上述的复苏培养基的方法，该方法包括以下的步骤
1)取少量藤黄球菌菌种接种于菌种液体培养基，25^35C、100^150rpm振动培养；细菌生长至对数期后期，培养液用300(T8000rpm，l(T30min离心抽提去除菌体；经
O.20 0. 25 μ m膜过滤灭菌后，-3(T-10°C保存备用；
2)取经风干、过筛、去除杂质的园土1kg，加自来水l 2L，ll(ri30°C、l(T40min高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度用同法灭菌；150(T2500r/min低速离心取上清液或用滤纸过滤弃渣获得滤液，经ll(Tl30°C、l(T30min高压灭菌锅灭菌后冷却，-3(T-10°C保存备用；
3)准确称取培养基基液的各组分，pH调至7.O, ll(Tl30°C、l(T30min高压灭菌锅灭菌后冷却至室温待用；培养基基液适宜多数细菌的分离，对于有特殊要求以及有选择性的细菌可以相应加减营养组分；
4)使用前，在无菌条件下，培养基基液中加相应量的细菌液，再加相应量的土壤液，混匀后使用。作为优选，上述的菌种液体培养基的配方如下
氯化铵 3. (Γ5. Og,
磷酸二氢钾I. 2^1. 6g，
生物素 O. 003^0. 008g,
L-蛋氨酸(λ ΟΓΟ. 04g，
硫胺素 O. 02 O. 05g，肌苷(λ 8^1. 5g，
七水硫酸镁O. 05 0. lg，
矿物质溶液O. 8 I. 5ml，
L-乳酸锂 5· (Γ20. Og,
蒸懼水 1000ml, pH7. 5。作为再优选，上述的矿物质溶液的配方如下
硫酸铜 O. 2(T0. 30g，
氯化锰 O. 3(T0. 80g，
硫酸亚铁 O. 08 O. 20g，
钥酸钠 O. ΟΓΟ. 03g，
硫酸锌 O. 02 O. 08g，
蒸懼水 1000ml。为了实现上述的第三个目的，本发明公开了三种应用的方案。I、一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的方法，该方法包括以下的步骤
1)取分离源I份加上述的复苏培养基疒12份，充分混匀做成母液，经10倍梯度稀释到一定程度；
2)用加2%琼脂的相同成分固体平板培养基进行涂布，在细菌的常规培养温度下平板倒置培养，一般细菌24-48h，放线菌5-14d，挑取单菌落，扩大培养获得纯菌种。2、一种能促进VBNC细菌复苏生长的方法，该方法将实验培养基上不生长的前培养菌种或已经保存在超低温_80°C的菌种,接种到上述的复苏培养基上,部分菌种恢复生长。3、一种VBNC菌种的确认方法，该方法对使用上述的复苏培养基分离获得的菌种是否属于分离源中处于VBNC的细菌，采用上述的复苏培养基以及不添加细菌液的复苏培养基作为对照，采用常规MPN计数法、DGGE或FISH分子生物学方法分析证得。本发明由于采用了上述的技术方案，利用一种特殊蛋白质信号分子复活促进因子 Rpf，同时加入土壤液，构建成复苏培养基，由于土壤液中包含多种特殊的微量元素，能够进一步促进VBNC细菌复苏生长，提高了从生态环境中分离VBNC细菌丰度。本发明具有操作简单、复苏快的特点。
图I为公园土壤样本分离对比结果图。图2为海岛沙地土壤样本分离对比结果图。
具体实施例方式实施例I
一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，培养基组成由A、B、与C成分构成(简称=ABC复苏培养基)。A 成分 细菌液藤黄球菌Micrococcus luteus IAM14879菌种在LMMD培养基上培养至对数期后期，经离心培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，用量为C成分体积的5%。B 成分
土壤液取经风干、过筛、去除石块草根等杂质的园土 1kg，加自来水lL，12rC、30min 高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度灭菌、重复三次；2000r/min低速离心取上清液(或用滤纸过滤获得滤液),用量为C成分体积的2%。C 成分
细菌用胰蛋白胨(Difco 公司)(Bacto peptone (Difco) ) 10. O g,
酵母抽提液(Yeast extract (Difco) ) 5. O g,
麦芽提取物(Malt extract (Difco) ) 5. O g,
(水解)酪蛋白氨基酸(Casamino acids (Difco) ) 5. Og,
牛肉膏(Beef extract (Difco) ) 2. Og,
甘油(Glycerol) 2. Og,
吐温 80 (Tween 80) O. 05g,
七水硫酸镁(MgS04*7H20) 1.0 g,
加去离子水lOOOmL，ρΗ7·0。以上培养基为液体培养基成分，如配制固体培养基时，需加琼脂15_20g，经 121°C，15min高压灭菌后冷却使用。A成分中LMMD培养基组成
氯化铵(NH4Cl) 4.0 g,
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.4 g,
生物素(Biotin) O. 005 g,
L-蛋氨酸(L-Methionine) O. 02 g,
硫胺素(Thiamine) O. 04 g,
肌苷(Inosine) I. O g,
七水硫酸镁(MgSO4WH2O) O. 07 g,
矿物质溶液(Mineral solution) I. O ml,
L-乳酸锂(Lithium L-lactate) 10. 0 g,
蒸懼水(Distilled water) 1000 ml, pH 7.5。其中，上述的矿物质溶液(Mineral solution)
硫酸铜(CuSO4 )0. 24 g，
氯化锰(MnCl2)0. 50 g,
硫酸亚铁(FeSO4)0. 10 g,
钥酸钠(Na2MoO4) O. 025 g,
硫酸锌(ZnSO4)0.05 g,
蒸懼水(distilled water) 1000 ml。以上为一般细菌复苏培养使用的配方。根据不同生态环境的要求，C成分可以作相应的调整。上述的复苏培养基的配制方法
I.取少量藤黄球菌菌种接种于LMMD液体培养基，30 C、120 rpm振动培养；细菌生长至对数期后期，培养液用5000 rpm, 20 min离心抽提去除菌体；经0.22 μ m膜过滤灭菌后，-20°C保存备用；
2.取经风干、过筛、去除石块草根等杂质的园土Ikg,加自来水1L, 12rC、30min高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度用同法灭菌；2000r/min低速离心取上清液(或用滤纸过滤弃渣获得滤液)，经121°C、15min高压灭菌锅灭菌后冷却，_20°C保存备用；
3.准确称取C成分的各组分，pH调至7.0，12rC、15min高压灭菌锅灭菌后冷却至室温待用。C组分适宜多数细菌的分离，对于有特殊要求以及有选择性的细菌可以相应加减营养组分；
4.使用前，应在无菌条件下，C成分中加5%(A/C)A成分，再加3% (B/C)B成分，混匀后使用。实施例2
一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，培养基组成由A、B、与C成分构成(简称ABC复苏培养基),适合革兰氏阳性菌无枝菌酸菌属iAmycolatopsis属)。 A 成分
细菌液藤黄球菌Micrococcus luteus IAM14879菌种在LMMD培养基上培养至对数期后期，经离心培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，用量为C成分体积的1%。B 成分
土壤液取经风干、过筛、去除石块草根等杂质的园土 1kg，加自来水lL，12rC、30min 高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度灭菌、重复三次；2000r/min低速离心取上清液(或用滤纸过滤获得滤液)，用量为C成分体积的10%。C成分的配方
葡萄糖 Glucose, 4. O g
酵母抽提液 Yeast extract, 4. O g
麦芽抽提液 Malt extract, 10. O g
蒸懼水 Distilled water, 1000. O ml ；
pH 7. 2，配置琼脂培养基时加用碳酸钙CaC03，2. O g。以上培养基为液体培养基成分，如配制固体培养基时，需加琼脂15_20g，经 121°C，15min高压灭菌后冷却使用。实施例3
一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，培养基组成由A、B、与 C成分构成(简称ABC复苏培养基)，适合革兰氏阳性菌节杆菌属属)、红球菌iRhodococcus属)、莱夫氏属iLeifsonia属)、诺卡氏属iNocardia属)、北里孢属 iKi tasa tospora属)、链霉菌属(属)、枯草杆菌属{Bacillus属)、类芽孢杆菌 M iPaenibacillus 属)。A 成分
细菌液藤黄球菌Micrococcus luteus IAM14879菌种在LMMD培养基上培养至对数期后期，经离心培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，用量为C成分体积的8%。B 成分
土壤液取经风干、过筛、去除石块草根等杂质的园土 1kg，加自来水lL，12rC、30min高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度灭菌、重复三次；2000r/min低速离心取上清液(或用滤纸过滤获得滤液)，用量为C成分体积的15%。C成分的配方
蛋白胨 Tryptone, 5. O g
酵母提取物 Yeast extract, 2. 5 g
葡萄糖 Glucose, l.Og
β-苯乙醇 β-Phenethyl alcohol, 3. O ml
杀真菌素 Kabicidin, O. 05 g
放线菌酮 Cycloheximide, O. 05 g
去离子水 Deionized water, 1000 ml, pH 7.0。以上培养基为液体培养基成分，如配制固体培养基时，需加琼脂15_20g，经 121°C，15min高压灭菌后冷却使用。实施例4
一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，培养基组成由A、B、与C成分构成(简称ABC复苏培养基)，适合贫营养土壤生态中的细菌。A 成分
细菌液藤黄球菌Micrococcus luteus IAM14879菌种在LMMD培养基上培养至对数期后期，经离心培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，用量为C成分体积的15%。B 成分
土壤液取经风干、过筛、去除石块草根等杂质的园土 1kg，加自来水lL，12rC、30min 高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度灭菌、重复三次；2000r/min低速离心取上清液(或用滤纸过滤获得滤液)，用量为C成分体积的18%。C成分的配方
蛋白胨 Tryptone, 5. O g
酵母提取物 Yeast extract, 2. 5 g
葡萄糖 Glucose, l.Og
β-苯乙醇 β-Phenethyl alcohol, 3. 0 ml
杀真菌素 Kabicidin, 0. 05 g
放线菌酮 Cycloheximide, O. 05 g
去离子水 Deionized water, 1000 ml, pH 7.0。以上培养基为液体培养基成分，如配制固体培养基时，需加琼脂15_20g，经 121°C，15min高压灭菌后冷却使用。实施例4
一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，培养基组成由A、B、与C成分构成(简称=ABC复苏培养基)，适合贫营养深水生态中的细菌。A 成分
细菌液藤黄球菌Micrococcus luteus IAM14879菌种在LMMD培养基上培养至对数期后期，经离心培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，用量为C成分体积的25%。B 成分土壤液取经风干、过筛、去除石块草根等杂质的园土 1kg，加自来水lL，12rC、30min 高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度灭菌、重复三次；2000r/min低速离心取上清液(或用滤纸过滤获得滤液)，用量为C成分体积的1%。C成分的配方
酪蛋白 Casein, I. 70 g
柏 Soybean meal, O. 30 g
氯化钠 NaCl，O. 50 g
磷酸氢二钾 K2HPO4, O. 25 g 葡萄糖 Dextrose, O. 25 g
蒸懼水 Distilled water, 1000 ml; pH 7. 3。以上培养基为液体培养基成分，如配制固体培养基时，需加琼脂15_20g，经 121°C，15min高压灭菌后冷却使用。应用例I
液体培养基分离VBNC细菌。取分离源(水或土壤)I份加实施例3所述的ABC复苏培养基9份，充分混匀做成母液，经10倍梯度稀释到一定程度(水样一般为10-6，土样一般应为 10-8);用加2%琼脂的相同成分固体平板培养基进行涂布，在细菌的常规培养温度下平板倒置培养(一般细菌24-48h，放线菌5-14d)，挑取单菌落，扩大培养获得纯菌种。获得的纯菌种可以进行各种鉴定试验，如经PCR对16S rRNA基因扩增并测序，在NCBI网站GenBank作 BLAST检索对比，可大致鉴定到该纯菌种属的水平，有助于分析该纯菌种是否源自VBNC状态。应用例2
固体培养基对源自VBNC可培养化菌种的活化培养。经实施例I所述的ABC复苏培养基筛选到的一些菌株在连续培养过程中，特别是长期静置的状况下，可能回到VBNC状态， 此时，可以将某实验培养基上不生长的前培养菌种或已经保存在超低温_80°C的菌种，经接种到ABC复苏培养基上，部分菌种可以恢复生长。应用例3
VBNC菌种的确认方法。对以上使用实施例I所述的ABC复苏培养基分离获得的菌种是否属于分离源中处于VBNC的细菌，可以用ABC复苏培养基以及不添加A的BC培养基作为对照，采用常规MPN计数法以及DGGE或FISH等分子生物学方法分析证得。试验例I
土壤中VBNC细菌的分离。对来自公园、海岛和森林的68个土壤样品，采用实施例3所述的ABC复苏培养基分离到属于VBNC状态经复苏成为可培养化的40个菌株，提高5-490 倍的分离丰度。其中高GC革兰氏阳性放线菌占63%，低GC革兰氏阳性菌占37%，至少发现一个新种细菌。试验例2
污水处理系统中VBNC细菌的分离。对城市污水深度处理系统中,采用A实施例3所述的BC复苏培养基分离到属于VBNC状态经复苏成为可培养化的10个菌株，均为高GC革兰氏阳性放线菌，至少发现6个新种细菌。试验例3难培养革兰氏阴性细菌的生长促进作用。对来自深井水难培养Aquaspirillum属(螺旋菌属)、Curvibacter属(弯曲细菌属)的部分难培养革兰氏阴性菌种将实施例4所述的 ABC复苏培养基中的A成分添加到原培养基中结果发现明显的生长促进作用，细胞量增长 100倍以上，使3个难培养新种细菌获得鉴定。试验例4源自VBNC细菌的复苏促进保持培养。对来自土壤经实施例I所述的ABC复苏培养基属于VBNC状态的放线菌，该菌经长期静置后又回复到VBNC状态。采用ABC复苏培养后恢复近100倍的生长活力。对比例I
在利用复苏液分离土壤中处于VBNC状态细菌时，观察对比了添加土壤抽取液对分离土壤细菌的作用。土壤抽取液的制作方法为取经风干、过筛、去除杂质的园土 lkg，加自来水lL，121°C、30min高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度用同法灭菌；2000r/min低速离心取上清液或用滤纸过滤弃渣获得滤液，经12rC、15min高压灭菌锅灭菌后冷却，添加量为 1% (v/v);实验观察采用最大或然数法(MPN)，并查MPN数值表计数，重复三次的结果如下。图I是公园土壤样本，基础培养基分离到的菌数是，第2天可见菌数为 9. 3xl05cfu/g (每克土样中的细菌形成菌落数,下同),加土壤液是9. 3xl06 cfu/g,第3天以后两者菌数都稳定在9. 3xl06 cfu/g ;加复苏液第2天菌数为9. 3xl06 cfu/g,复苏液加土壤液的菌数为I. 5xl07 cfu/g ;第4天复苏液加土壤液的菌数为4. 3xl08 cfu/g，而单用复苏液第5天达到相同菌数，以后稳定在4. 3xl08 cfu/g，表明土壤抽取液能促进细菌的生长。就其时间上看比不添加大约提早一天到达最高可分离细菌数，但就获取细菌总量上看效果并不明显。图2是海岛沙地土壤样本，基础培养基分离到的菌数是，第2天可见菌数为 2. Ixl05cfu/g,加土壤液是9. 3xl06 cfu/g,第3天以后两者菌数都稳定在I. 5xl06 cfu/g ； 加复苏液第2天菌数为2.4xl06 cfu/g，复苏液加土壤液的菌数为4. 6xl06 cfu/g;第4天复苏液加土壤液的菌数为1.5xl07 cfu/g，达到最高可培养数，而单用复苏液第5天达到相同菌数，同样表明了土壤抽取液能促进细菌的生长，大约提早一天到达最高可分离细菌数的效果。实验观察结果表明，添加土壤抽取液对分离土壤细菌有明显的生长促进作用。添加复苏液能提高获取土壤中VBNC状态细菌，分离丰度可达10-46倍。
权利要求
1.一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，其特征在于该复苏培养基由培养基基液、细菌液和土壤液构成；所述的细菌液由藤黄微球菌菌种在菌种液体培养基上培养至对数期后期，经离心去除菌种液体培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，细菌液按体积比为培养基基液的O. 5-.30% ;所述的土壤液由经风干、过筛、去除杂质的土壤，加水，多次灭菌，过滤取滤液或离心取上清液，土壤液按体积比为培养基基液的 O. I-20%O
2.根据权利要求I所述的一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，其特征在于细菌液按体积比为培养基基液的1_10%，土壤液按体积比为培养基基液的1_5%。
3.根据权利要求I或2所述的一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，其特征在于培养基基液选用以下配方中的一种A、一般细菌复苏培养使用的配方细菌用胰蛋白胨 8.(Tl5.0g，酵母抽提液3. (Γ8. Og,麦芽提取物3. (Γ8. Og,牛肉膏l.(T3.0g，酪蛋白氨基酸 3.(T8.0g，甘油L(T3.0g，吐温-80O. 03 O. Ig,七水硫酸镁O. 5^2. Og,加去离子水IOOOmL,调节ρΗ7· O ；B、适合革兰氏阳性菌无枝菌酸菌属的配方葡萄糖2. O 6. Og,酵母抽提液 2. O 6. Og,麦芽抽提液 O. 6^2. O g，蒸馏水1000. O ml, pH 7. 2，配置琼脂培养基时加用碳酸钙I. O 3. Og ；C、适合革兰氏阳性菌节杆菌属、红球菌、莱夫氏属、诺卡氏属、北里孢属、链霉菌属、枯草杆菌属、类芽孢杆菌属的配方蛋白胨3.0 8.0 g酵母提取物 l.(T5. 5 g，葡萄糖O. 5^2. O g，β-苯乙醇 2.0 4.0ml，杀真囷素 O. 03 O. 08 g,放线菌酮 O. 02 O. 08 g，去离子水 1000 ml, pH 7. O ;D、适合贫营养土壤生态中的细菌的配方营养肉汤I. O 2. 50 g,酵母提取液 O. 20 L Og,蒸馏水1000 ml, pH 7. O ；E、适合贫营养深水生态中的细菌的配方酪蛋白l.(T3.0 g，豆柏(λ 10^0. 50 g,氯化钠O. 2(Γ · O g,磷酸氢二钾 O. Γθ. 5 g，葡萄糖0. Γθ. 5 g，蒸馏水1000 ml, pH 7. 3。
4.根据权利要求3所述的一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基， 其特征在于配制固体培养基时，在所述的A、B、C、D或E的各组配方中加琼脂15 20g，经 ll(Tl30°C、l(T30min高压灭菌后冷却使用。
5.一种制备权利要求I或2所述的复苏培养基的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1)取少量藤黄球菌菌种接种于菌种液体培养基，25^35C、100^150rpm振动培养；细菌生长至对数期后期，培养液用300(T8000rpm，l(T30min离心抽提去除菌体；经O.20 0. 25 μ m膜过滤灭菌后，-3(T-10°C保存备用；2)取经风干、过筛、去除杂质的园土1kg，加自来水l 2L，ll(Tl30°C、l(T40min高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度用同法灭菌；150(T2500r/min低速离心取上清液或用滤纸过滤弃渣获得滤液，经ll(Tl30°C、l(T30min高压灭菌锅灭菌后冷却，-3(T-10°C保存备用；3)准确称取培养基基液的各组分，pH调至7.O, ll(Tl30°C、l(T30min高压灭菌锅灭菌后冷却至室温待用；培养基基液适宜多数细菌的分离，对于有特殊要求以及有选择性的细菌可以相应加减营养组分；4)使用前，在无菌条件下，培养基基液中加相应量的细菌液，再加相应量的土壤液，混匀后使用。
6.根据权利要求5所述的一种制备复苏培养基的方法，其特征在于菌种液体培养基的配方如下氯化铵 3. (Γ5. Og,磷酸二氢钾I. 2^1. 6g，生物素 O. 003^0. 008g,L-蛋氨酸(λ 0Γ0. 04g，硫胺素 O. 02 O. 05g，肌苷O. 8^1. 5g，七水硫酸镁O. 05^0. Ig,矿物质溶液O. 8 I. 5ml，L-乳酸锂 5· (Γ20. Og,蒸懼水 1000ml, pH7. 5。
7.根据权利要求6所述的一种制备复苏培养基的方法，其特征在于矿物质溶液的配方如下硫酸铜 O. 2(T0. 30g，氯化锰 O. 3(T0. 80g，硫酸亚铁 O. 08 O. 20g，钥酸钠 O. ΟΓΟ. 03g，硫酸锌 O. 02 O. 08g，蒸懼水 1000ml。
8.一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1)取分离源I份加权利要求I或2所述的复苏培养基7 12份，充分混匀做成母液，经 10倍梯度稀释到一定程度；2)用加2%琼脂的相同成分固体平板培养基进行涂布，在细菌的常规培养温度下平板倒置培养，一般细菌24-48h，放线菌5-14d，挑取单菌落，扩大培养获得纯菌种。
9.一种能促进VBNC细菌复苏生长的方法，其特征在于该方法将实验培养基上不生长的前培养菌种或已经保存在超低温_80°C的菌种，接种到权利要求I或2所述的复苏培养基上，部分菌种恢复生长。
10.一种VBNC菌种的确认方法，其特征在于该方法对使用权利要求I或2所述的复苏培养基分离获得的菌种是否属于分离源中处于VBNC的细菌，采用权利要求I或2所述的复苏培养基以及不添加细菌液的复苏培养基作为对照，采用常规MPN计数法、DGGE或FISH分子生物学方法分析证得。
全文摘要
本发明涉及微生物筛选和培养领域，尤其涉及一种活的非可培养(VBNC)菌种的复苏培养基及其制备方法和应用。一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，该复苏培养基由培养基基液、细菌液和土壤液构成；所述的细菌液由藤黄微球菌菌种在菌种液体培养基上培养至对数期后期，经离心去除菌种液体培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，细菌液按体积比为培养基基液的0.5-30%；所述的土壤液由经风干、过筛、去除杂质的土壤，加水，多次灭菌，过滤取滤液或离心取上清液，土壤液按体积比为培养基基液的0.1-20%。本发明利用复活促进因子Rpf，同时加入土壤液，构建成复苏培养基，能够进一步促进VBNC细菌复苏生长，提高了从生态环境中分离VBNC细菌丰度。本发明具有操作简单、复苏快的特点。
文档编号C12N1/20GK102618464SQ20121008112
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者丁林贤, 林冬珍, 金夷, 陈建荣 申请人:浙江师范大学