专利名称：一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用四环素菌渣的方法，尤其是涉及一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法。
背景技术：
中国是四环素类抗生素生产大国，年产量居世界首位。然而在四环素生产过程中， 会产生大量的废弃菌渣，这些菌渣主要是发酵醪液进行固液分离时形成的菌饼部分，其主要成分是微生物菌丝体、未代谢利用完的有机物、无机盐等。长期以来，抗生素菌渣多采用简单晾晒或烘干后，作为动物饲料或肥料使用，经济附加值较低。更重要的是，菌渣在晾晒或烘干过程中，会散发出一种特殊异味，而且，菌渣因有机质含量高，易引起二次发酵，颜色变黑，产生恶臭味，给周围环境带来危害。酵母浸膏是以酵母为原料，利用现代生物技术通过酵母细胞自溶破壁和酵母自身的酶系对酵母细胞质进行水解或以酶制剂进行水解，再经一系列的抽提、浓缩等工序得到的粉状或膏状或液体的产品，营养丰富，富含有18种以上氨基酸、功能性多肽、抗衰老活性因子、膳食纤维和甘露糖，还含有人体不可缺少的核酸、核苷酸和钙，富含B族维生素及磷、 镁、锰、锌、硒等多种微量元素。酵母浸膏被广泛应用于生物发酵、生物工程、生物医药等领域，具体地说，可广泛用于发酵法生产抗生素、氨基酸、有机酸、酶制剂、生物防腐剂、生物材料、维生素、透明质酸等的培养基配制以及生物工程、生物医药等领域。我国目前生产酵母浸膏的厂家较少，但市场需求量较大。由于酵母浸膏生产原料主要是以小麦等粮食作物为原料，价格偏高，因而造成酵母浸膏的生产成本还处在一个比较高的水平，难以达到实际且实惠的应用。目前还没有一种能利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低、制备工艺简单独特、 生产周期短、使四环素菌渣得以高效转化、有效避免四环素菌渣不合理使用对环境造成危害的一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法。本发明通过如下方式实现
一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法，其特征在于该方法包括如下步骤
a.种子活化培养分别从酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露保存管中挑取一环，分别接入种子活化培养基中，30 35°C，10(Tl40r/min下好氧培养36 48h，可分别得到活化的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子；
b.一级种子制备将上述步骤a制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子按质量百分比为1 5%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，3(T35°C，10(Tl40r/min下好氧培养36 48h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子；
c.二级种子制备将上述步骤b制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子按质量百分比为广5%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，3(T35°C，10(Tl40r/min下好氧培养36 48h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子；
d.菌渣培养基制备按下述重量比的原料混合即可得菌渣培养基四环素菌渣 11 13kg，玉米面粉0. 2 0. 5kg，酶制剂0. 4 0. 8kg，(NH4)2SO4 0. I 0. 3kg，加水使菌渣培养基中水分含量为75 85% ;
e.将上述步骤c制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子，分别按质量百分比为I 10%接种量接入上述步骤d制备的菌渣培养基中，30 35°C，4(T80r/min下好氧培养4 6d，然后调节pH为6. 5^7. 0，在55°C水浴中按质量百分比为0. 03%的量加入酵母抽提酶，水解16 24h，升温到80°C使酶失活，待其冷却后，离心、微滤膜过滤，滤液经减压浓缩控制其水分为15 25%，即为酵母浸膏；
所述种子活化培养基，种子扩大培养基，霉菌培养基，产酶培养基，酶制剂制备方法分别是
1)种子活化培养基制备按下述重量比的原料混合即可得种子活化培养基蛋白胨 10g，酵母浸膏10g，葡萄糖20g，水IOOOml ；
2)种子扩大培养基制备按下述重量比的原料混合即可得种子扩大培养基蛋白胨 IOg,酵母浸膏5g，葡萄糖5g，水IOOOml ；
3)霉菌培养基制备按下述重量比的原料配制即可得霉菌培养基取新鲜去皮土豆 200g，切碎后，加IOOOml水煮沸20分钟，过滤后滤液用水稀释至1000ml，然后再加入葡萄糖 20g即可；
4)产酶培养基制备按下述重量比的原料配制即可得产酶培养基四环素菌渣700g， 麸皮300g，再加水使产酶培养基水分含量为6(T65% ；
5)酶制剂制备从黑曲霉、康宁木霉、绿色木霉保存管中挑取一环，分别接入霉菌培养基中，菌株经活化和扩大培养后，分别以5%的接种量接种于产酶培养基中，28 35°C好氧培养6(T72h后，可得生产酵母浸膏所用的酶制剂。 本发明有如下效果
1)制备工艺简单独特本发明提供的一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法， 包括种子活化培养、一级种子制备、二级种子制备、菌渣培养基制备，然后将制备的二级种子，按质量百分比为I 10%的接种量接种于菌渣培养基中，经好氧发酵、酶解、离心、微滤膜过滤、浓缩等步骤，即可得酵母浸膏；
2)生产的酵母浸膏中蛋白质含量高利用本发明提供的方法制得的酵母浸膏具有较高的蛋白质、氨基酸和核苷酸含量，本发明产品的真蛋白，氨基酸态氮及核苷酸含量相对较高，同时氨基酸种类较多，不仅适用于生物发酵行业，而且还适用于生物工程、生物医药等领域；
3)降低环境污染变废为宝、生产成本低本发明在原料的选择上主要是以四环素生产过程中产生的废弃菌渣为主，配以少量玉米面粉、(NH4)2SO4为辅料，不仅来源丰富而且价格低廉。本发明可以有效的利用四环素菌渣，减少其大量堆放对环境造成的危害。此外，本发明实现了好氧发酵工艺条件的优化，降低了生产酵母浸膏的成本，增加了投产后的产品竞争力；
4)安全可靠本发明生产酵母浸膏所使用的发酵原料均不含任何有毒有害物质，具有安全性和补充营养的特点，对环境无直接或间接的污染作用；
5)生产的产品质量高本发明针对目前大量四环素菌渣利用现状，以选育优化的酿酒酵母、热带假丝酵母、EM原露为酵母浸膏生产菌株，所产生的酵母浸膏中蛋白质、氨基酸与核苷酸含量较高，其中氨基酸种类较多，同时还提高四环素菌渣资源化利用的经济附加值， 本发明酵母浸膏中水分含量15 25%，铵盐含量I 3%，pH 6. 0 7. 0，真蛋白含量35 50%，氨基酸态氮含量4. 5^7. 5%，核苷酸含量8 15呢/g ；
6)采用本发明提供的方法得到的酵母浸膏，可以达到以下指标
I.感官指标棕黄色膏状，有特殊的酵母香味。2.卫生指标(每千克成品中含)
总菌落，浸膏为阴性。重金属未检出。
具体实施例方式实施例I :
一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法，该方法包括如下步骤
a.种子活化培养分别从酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露保存管中挑取一环，分别接入种子活化培养基中，35°C，140r/min下好氧培养36h，可分别得到活化的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子；
b.一级种子制备将上述步骤a制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子按质量百分比为5%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，35°C，140r/min下好氧培养36h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子；
c.二级种子制备将上述步骤b制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子按质量百分比为5%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，35°C，140r/min下好氧培养 36h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子；
d.菌渣培养基制备按下述重量比的原料混合即可得菌渣培养基四环素菌渣11kg， 玉米面粉0.2kg，酶制剂0.4kg，(NH4)2SO4 0.3kg，适当加水使菌渣培养基中水分含量为 80% ；
e.将上述步骤c制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子，分别按质量百分比为1%接种量接入上述步骤d制备的菌渣培养基中，300C，80r/min下好氧培养6d，然后调节pH为6. 5，在55°C水浴中按质量百分比为0. 03%的量加入酵母抽提酶，水解16h，升温到 80°C使酶失活，待其冷却后，离心、微滤膜过滤，滤液经减压浓缩控制其水分为15 25%，即为
酵母浸膏。经测定酵母浸膏中水分含量22%，铵盐含量2. 3%，pH 6. 3，真蛋白含量43. 8%，氨基酸态氮含量5. 9%，核苷酸含量9. 7/g。。实施例2:
一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法，该方法包括如下步骤
a.种子活化培养分别从酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露保存管中挑取一环，分别接入种子活化培养基中，33°C，120r/min下好氧培养42h，可分别得到活化的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子；b.一级种子制备将上述步骤a制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子按质量百分比为3%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，33°C，120r/min下好氧培养42h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子；
c.二级种子制备将上述步骤b制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子按质量百分比为3%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，33°C，120r/min下好氧培养 42h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子；
d.菌渣培养基制备按下述重量比的原料混合即可得菌渣培养基四环素菌渣12kg， 玉米面粉0.3kg，酶制剂0.6kg，(NH4)2SO4 0.2kg，适当加水使菌渣培养基中水分含量为 75% ；
e.将上述步骤c制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子，分别按质量百分比为5%接种量接入上述步骤d制备的菌渣培养基中，330C，60r/min下好氧培养5d，然后调节pH为6. 8，在55°C水浴中按质量百分比为0. 03%的量加入酵母抽提酶，水解20h，升温到 80°C使酶失活，待其冷却后，离心、微滤膜过滤，滤液经减压浓缩控制其水分为15 25%，即为
酵母浸膏。经测定酵母浸膏中水分含量24%，铵盐含量2. 1%，pH 6. 8，真蛋白含量44. 6%，氨基酸态氮含量6. 5%,核苷酸含量11. 4Mg /go实施例3
一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法，该方法包括如下步骤
a.种子活化培养分别从酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露保存管中挑取一环，分别接入种子活化培养基中，30°C，100r/min下好氧培养48h，可分别得到活化的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子；
b.一级种子制备将上述步骤a制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子按质量百分比为1%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，30°C，lOOr/min下好氧培养48h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子；
c.二级种子制备将上述步骤b制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子按质量百分比为1%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，3(TC，100r/min下好氧培养 48h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子；
d.菌渣培养基制备按下述重量比的原料混合即可得菌渣培养基四环素菌渣13kg， 玉米面粉0.5kg，酶制剂0.8kg，(NH4)2SO4 0. 1kg，适当加水使菌渣培养基中水分含量为 85% ；
e.将上述步骤c制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子，分别按质量百分比为10%接种量接入上述步骤d制备的菌渣培养基中，35°C，40r/min下好氧培养4d，然后调节PH为7. 0，在55°C水浴中按质量百分比为0. 03%的量加入酵母抽提酶，水解24h，升温到80°C使酶失活，待其冷却后，离心、微滤膜过滤，滤液经减压浓缩控制其水分为15 25%， 即为酵母浸膏。经测定酵母浸膏中水分含量21%，铵盐含量2%，pH 7. 0，真蛋白含量44. 4%，氨基酸态氮含量6. 4%,核苷酸含量10. 6I^g /go上述种子活化培养基，种子扩大培养基，霉菌培养基，产酶培养基，酶制剂制备方法分别是1)种子活化培养基制备按下述重量比的原料混合即可得种子活化培养基蛋白胨 10g，酵母浸膏10g，葡萄糖20g，水IOOOml ；
2)种子扩大培养基制备按下述重量比的原料混合即可得种子扩大培养基蛋白胨 10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，水IOOOml ；
3)霉菌培养基制备按下述重量比的原料配制即可得霉菌培养基取新鲜去皮土豆 200g，切碎后使其粒度小于5mmX 5mmX 5mm，加1000ml水煮沸20分钟，过滤后滤液用水稀释至1000ml,然后再加入葡萄糖20g即可；
4)产酶培养基制备按下述重量比的原料配制即可得产酶培养基四环素菌渣700g， 麸皮300g，再适当加水使产酶培养基水分含量为60飞5% ；
5)酶制剂制备从黑曲霉、康宁木霉、绿色木霉保存管中挑取一环，分别接入霉菌培养基中，菌株经活化和扩大培养后，分别以5%的接种量接种于产酶培养基中，28 35°C好氧培养6(T72h后，可得生产酵母浸膏所用的酶制剂。上述酵母抽提酶是由木瓜蛋白酶和5’ -磷酸二酯酶组成，其中木瓜蛋白酶活力 900000U/g，5，-磷酸二酯酶活力 120U/g。采用本发明提供的方法得到的酵母浸膏，可以达到以下指标
I.感官指标棕黄色膏状，有特殊的酵母香味。2.卫生指标(每千克成品中含)
总菌落，浸膏为阴性。重金属未检出。 本发明产品的真蛋白，氨基酸态氮及核苷酸含量相对较高，此外，本发明可以有效的利用四环素菌渣，减少其大量堆放对环境造成的危害。本发明生产酵母浸膏所用菌种是酿酒酵母{Saccharomyces Cerevisiae CGMCC 2. 1418)、热带假丝酵母{Candida tropicalis CGMCC 2. 587)、EM 原露、黑曲霉 (Aspergillus niger CGMCC 3. 4628)、绿色木霉{Trichoderma viride CGMCC 3.2942)和康宁木霉koningii CGMCC 3. 4033),均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
权利要求
1.一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法，其特征在于该方法包括如下步骤a.种子活化培养分别从酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露保存管中挑取一环，分别接入种子活化培养基中，30 35°C，10(Tl40r/min下好氧培养36 48h，可分别得到活化的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子；b.一级种子制备将上述步骤a制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露种子按质量百分比为1 5%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，3(T35°C，10(Tl40r/min下好氧培养36 48h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子；c.二级种子制备将上述步骤b制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露一级种子按质量百分比为广5%的接种量，分别接种于种子扩大培养基中，3(T35°C，10(Tl40r/min下好氧培养36 48h，可分别得到酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子；d.菌渣培养基制备按下述重量比的原料混合即可得菌渣培养基四环素菌渣 11 13kg，玉米面粉O. 2 O. 5kg，酶制剂O. 4 O. 8kg，(NH4)2SO4 O. Γθ. 3kg，加水使菌渣培养基中水分含量为75 85% ;e.将上述步骤c制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子，分别按质量百分比为I 10%接种量接入上述步骤d制备的菌渣培养基中，30 35°C，4(T80r/min下好氧培养4 6d，然后调节pH为6. 5^7. 0，在55°C水浴中按质量百分比为O. 03%的量加入酵母抽提酶，水解16 24h，升温到80°C使酶失活，待其冷却后，离心、微滤膜过滤，滤液经减压浓缩控制其水分为15 25%，即为酵母浸膏。
2.如权利要求I所述的一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法，其特征在于 所述种子活化培养基，种子扩大培养基，霉菌培养基，产酶培养基，酶制剂制备方法分别是O种子活化培养基制备按下述重量比的原料混合即可得种子活化培养基蛋白胨 10g，酵母浸膏10g，葡萄糖20g，水IOOOml ；2)种子扩大培养基制备按下述重量比的原料混合即可得种子扩大培养基蛋白胨 10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，水IOOOml ；3)霉菌培养基制备按下述重量比的原料配制即可得霉菌培养基取新鲜去皮土豆 200g，切碎后，加IOOOml水煮沸20分钟，过滤后滤液用水稀释至1000ml，然后再加入葡萄糖 20g即可；4)产酶培养基制备按下述重量比的原料配制即可得产酶培养基四环素菌渣700g， 麸皮300g，再加水使产酶培养基水分含量为6(Γ65% ；5)酶制剂制备从黑曲霉、康宁木霉、绿色木霉保存管中挑取一环，分别接入霉菌培养基中，菌株经活化和扩大培养后，分别以5%的接种量接种于产酶培养基中，28 35°C好氧培养6(T72h后，可得生产酵母浸膏所用的酶制剂。
全文摘要
本发明涉及一种利用四环素菌渣的方法，尤其是涉及一种利用四环素菌渣好氧生产酵母浸膏的方法，其特征在于该方法包括如下步骤a.种子活化培养、b.一级种子制备、c.二级种子制备、d.菌渣培养基制备、e.取步骤c制备的酿酒酵母、热带假丝酵母和EM原露二级种子，分别按质量百分比为1～10%接种量接入步骤d制备的菌渣培养基中，经好氧发酵、酶解、离心、微滤膜过滤、浓缩等步骤，可得酵母浸膏；本发明可使四环素生产企业排放的大量废弃菌渣得以高效转化，同时其产品可广泛用于生物发酵、生物工程、生物医药等领域，且工艺简单，成本低廉。
文档编号C12N1/06GK102586115SQ20121008454
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者惠兴育, 王敏, 马志强, 马玉龙 申请人:宁夏大学