专利名称：一种生物转化反应中快速计算γ-氨基丁酸生成量的检测装置的制作方法
技术领域：
一种生物转化反应中快速计算Y-氨基丁酸生成量的检测装置，属于化学仪器技术领域。
背景技术：
Y -氨基丁酸(GABA, Gamma-aminobutyric acid)是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，在哺乳动物体内GABA是一种抑制性神经递质，介导40%以上的抑制性神经信号。GABA具有提高脑活力、降低血压、安定精神、改善肝肾机能等功能，因而它在功能食品中具有广泛的应用前景。谷氨酸脱羧酶(GAD, Glutamate decarboxylase)是一种憐酸卩比卩多醒(PLP)类酶，它是GABA生物合成过程中的重要生物酶。GAD广泛存在于微生物、植物组织到高级哺乳动物体内，但是它在细胞中的存在量甚微。在GABA生物合成过程中，对GABA的测定目前有多种方法和仪器，而不同测定方法优缺点不同，因而有必要来根据实际情况，通过实验研究建立一种有针对性的快速、可靠、方便的测定方法，已有的检测方法报道有以下几种
双酶法运用双酶试剂盒Gabase (双酶试剂盒，S卩[a -酮戊二酸GABA，氨基转移酶(E. C. 2. 6. 19)]及[NAD(P):琥珀酸半缩醛，氧化还原酶(E. C. 1.2. I. 16)])，反应原理为a -酮戊二酸+GABA —琥珀酸半缩醛+L-谷氨酸；NADP + +琥珀酸半缩醛一NADPH+H + +琥珀酸。该方法对GABA进行定量分析，通过荧光检测NADH或NAD的变化量，所需时间短，灵敏度高，达lX10_n mol/L，在医学研究中常用于对神经组织中所含GABA的微量分析。但是该检测方法的测定成本比较昂贵，不适于工业应用。氨基酸分析仪测定法或高效液相测定法采用分析仪器定量测定GABA。此类方法目前应用广泛并且准确度很高，但是分析成本较高，有时需要对样品进行比较繁琐的预处理或衍生化准备，由于准确度高通常作为一种参照比较的标准方法。纸层析或薄层扫描法此类方法主要利用氨基酸与茚三酮反应生成有色物质，进行分离检测。此类方法比较经济快速，但是灵敏度较低，常常用作GABA的定性检测。比色法基本原理为，利用生物反应前后Berthelot比色法的显色差值来测定酶活。Berthelot反应利用苯酚、次氯酸钠与游离氨反应，显色灵敏度高，常用来测定体系中的氨及其盐类的含量，氨基酸具有游离氨基，在Berthelot反应中有一定响应，一个规律是，
氨基酸的反应灵敏度很高，而a-氨基酸响应低。对于体系中的L-谷氨酸和GABA来讲，它们在Berthelot反应中响应差别悬殊，即酶反应产物GABA的响应很高而底物L-谷氨酸响应低，因此酶反应发生时，可以根据体系显色强度变化进行酶活测定。Johnson和Tsushida等报道了利用比色法分别测定豇豆和茶叶中谷氨酸脱羧酶的酶活。此类方法所需样品量少，快速，但是准确度不高，反应体系小，不适于工业化应用。另外，根据谷氨酸脱羧酶反应的特点GAD属于裂解酶类，反应为作用于L-谷氨酸而产生CO2和GABA，反应过程中CO2不断逸出，因此GAD脱羧反应是一个不可逆过程，反应中不断消耗质子。通过计算反应中释放的CO2量来计算酶活也有报道采用电化学装置，原理为检测脱羧反应中定量释放的C02。凌达仁和吴国琪利用微机化离子分析仪和CO2气敏电极来测定谷氨酸脱羧酶活力，据此还可以推算GABA的生成量，此元素方法数据应用计算机记录，非常方便，易于操作。但是设备投资大，对反应体系要求严格。二氧化碳定量法。采用放射定量法来测定GAD的酶活，原理是以带有放射性元素14C的L-谷氨酸为底物，GAD脱羧反应中会定量释放14CO2,检测14CO2,然后根据反应中单位时间内释放的14CO2来确定GAD酶活，据此还可以推算GABA的生成量。此方法准确度极高，但是测定成本较高，操作繁琐，对设备要求严格。
发明内容
本发明要解决的技术问题为针对目前GABA测定方法的费时长，成本高，操作复杂，规模小等缺陷，发明了一种专门用于生物转化中测定生成GABA含量的检测装置。
本发明的技术方案工业化生物转化生产GABA过程中，为了充分利用酶活，一般应分批添加底物，GAD脱羧不可逆消耗质子，需要在线调节pH，通过实验得出消耗质子数和Y-氨基丁酸生成量的比例关系，据此发明了一种生物转化过程中可快速检测GABA的新型装置。该检测装置主体包括1) pH感应仪；2)数字转化仪；3)滴液瓶；4)控制仪；5)反应器。反应器(5 )内放置反应液，pH感应仪(I)插入反应器(5 )内反应液中，pH感应仪(I)始终在线检测着反应液的pH值，pH感应仪(I)和控制仪(4)相接，控制仪(4)根据设定pH值控制滴液瓶(3)对反应液加酸；pH感应仪(I)又和数字转化仪(2)相接，数字转化仪(2)记录添加酸的体积，数字转化仪(2)将加酸量的体积转化为电信号传给控制仪(4)，然后控制仪(4)会根据计算程序直接显示出Y-氨基丁酸生成量。检测操作步骤为
A、设定反应pH(4.6-4.8)值、添加盐酸的浓度n(0. 1-0. 5M)两个参数，加谷氨酸溶液，和加谷氨酸脱羧酶溶液或产谷氨酸脱羧酶的湿细胞到反应器内，用水补足反应体积在100-500mL之间；添加的谷氨酸总量在5-100mmol之间，添加的谷氨酸脱羧酶溶液或产谷氨酸脱羧酶的湿细胞量(使总酶活为100-2000U)；
B、反应体系反应前应调至设定值；
C、pH感应仪始终在线监测反应液的pH，并用浓度为n的HCl调至最适设定值，记录累计添加盐酸的体积V ;
D、运用公式W= (nXVXkX103. I)计算出Y -氨基丁酸生成量W ; n的单位为mol/L, V的单位为mL, W的单位为mg ；
k定义为:谷氨酸脱羧酶脱羧反应中，Y-氨基丁酸生成量与质子消耗数之比，是谷氨酸脱羧酶的一个特征值。主要是应用本装置和高效液相法测定GABA对比得到，数值为0. 5。本发明的有益效果本装置测定生物转化过程中Y-氨基丁酸生成量无需对样品进行处理操作，操作简单易行，耗时短，成本低。
图I本发明结构示意图。
具体实施例方式实施例I :按如下步骤操作a.设定控制仪的参数pH4. 6，添加0. IM盐酸溶液；b.添加20mmol的谷氨酸到反应器,加入去离子水至反应体积IOOmL ;c.调至pH4. 6;d.添加IOmL谷氨酸脱羧酶溶液(酶活100U)到反应器内开始反应。IOmin后，记录累计添加盐酸的体积为79. 5mL，运用公式W = (nXVXAX 103. I)计算出生成GABA量为409. 8mg,高效液相的方法检测GABA结果为417mg，误差率为I. 8%。实施例2 :按如下步骤操作a.设定控制仪的参数pH4. 8，添加0. 5M盐酸溶液；b.添加5mmol的谷氨酸到反应器 ,加入去离子水至200mL ；c.调至pH4. 8 ；d.添加20g湿细胞(酶活500U)到反应器内开始反应。IOmin后，记录累计添加盐酸的体积为57. 3mL，运用公式W = (nX VXAX 103. I)计算出生成GABA量为1477mg，高效液相的方法检测GABA结果为1489. 4mg，误差率为0. 9%。实施例3 :按如下步骤操作a.设定控制仪的参数pH4. 7，添加0. 25M盐酸溶液；b.添加IOOmmol的谷氨酸到反应器,加入去离子水至500mL ；c.调至pH4. 7 ；d.添加80g湿细胞(酶活2000U)到反应器内开始反应。IOmin后，记录累计添加盐酸的体积为331. 3mL,运用公式W = (nX VXAX 103. I)计算出生成GABA量为4. 2696g，高效液相的方法检测GABA结果为4. 32g，误差率为I. 1%。
权利要求
1.一种生物转化反应中快速计算Y-氨基丁酸生成量的检测装置，其特征在于该检测装置主体由PH感应仪(1)，数字转化仪(2)，滴液瓶(3)，控制仪(4)和反应器(5)构成；控制仪(4)用于设定反应pH值、添加酸的浓度两个参数，反应器(5)内放置反应液，pH感应仪(I)插入反应器(5)内反应液中，pH感应仪(I)始终在线检测着反应液的pH值，pH感应仪(I)和控制仪(4)相接，控制仪(4)根据设定pH值控制滴液瓶(3)对反应液加酸；pH感应仪(I)又和数字转化仪(2)相接，数字转化仪(2)记录添加酸的体积，数字转化仪(2)将加酸量的体积转化为电信号传给控制仪(4)，然后控制仪(4)会根据计算程序直接得出Y-氨基丁酸生成量，并直接显示在控制仪(4)上。
2.用权利要求I所述检测装置在生物转化反应中快速计算Y-氨基丁酸生成量的方法，其特征在于按以下步骤进行 A、设定反应pH4.6-4. 8值、添加盐酸的浓度n :0. 1-0. 5M两个参数，加谷氨酸溶液，和加谷氨酸脱羧酶溶液或产谷氨酸脱羧酶的湿细胞到反应器内，用水补足反应体积在100-500mL之间；添加的谷氨酸总量在5-100mmol之间，添加的谷氨酸脱羧酶溶液或产谷氨酸脱羧酶的湿细胞量为总酶活100-2000U ； B、反应体系反应前应调至设定值； C、pH感应仪始终在线监测反应液的pH，并用浓度为n的盐酸调至最适设定值，记录累计添加盐酸的体积V ; D、运用公式W= (nXVXkX103. I)计算出Y _氨基丁酸生成量W ; n的单位为mol/L, V的单位为mL, W的单位为mg ； k定义为谷氨酸脱羧酶脱羧反应中，Y-氨基丁酸生成量与质子消耗数之比，是谷氨酸脱羧酶的一个特征值，它是应用本装置和高效液相法测定GABA对比得到，数值为0. 5。
全文摘要
一种生物转化反应中快速计算γ-氨基丁酸(GABA)生成量的检测装置，属于化学仪器技术领域。本装置主体包括1)pH感应仪；2)数字转化仪；3)滴液瓶；4)控制仪和5)反应器。其数字转化仪可记录添加酸的体积，控制仪可以设定反应pH值、添加酸的浓度两个参数，由加酸体积经过程序计算可得GABA生成量，并直接显示在控制仪上。谷氨酸脱羧酶催化反应中不可逆消耗质子，本装置正是利用了消耗质子数和γ-氨基丁酸的比例关系。它解决了目前在生物转化过程中测定γ-氨基丁酸费时长，成本高，操作繁琐的缺陷。本装置测定生物转化过程中γ-氨基丁酸无需对样品进行处理，操作简单易行，耗时短，成本低。
文档编号C12M1/34GK102732421SQ20121017282
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者张天萌, 张涛, 江波, 沐万孟, 缪铭 申请人:江南大学