专利名称：：双相多孔三维细胞培养支架的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种双相多孔三维细胞培养支架，属于细胞、组织培养领域。
背景技术：
：在现有技术中，常规使用的主要的细胞培养方式包括以下两种O以单层二维方式培养细胞细胞培养是一种在药物开发、细胞生物学、毒理学、生物工程以及组织工程领域中非常有用并且被广泛使用的技术。常规的细胞培养是在细胞培养板如2、4、6、24、96孔细胞培养板中进行，上述细胞培养板由非降解性的聚合物包括聚苯乙烯制成。这些细胞培养板往往用等离子体处理其表面以改进其表面的亲水性，从而使得培养的细胞可以更好地粘附于所述培养板的二维表面。在典型的采用聚苯乙烯细胞培养平板进行的细胞培养实验中，所培养的细胞是在细胞培养基中以一种二维方式单层生长。2)以三维方式培养细胞二维细胞培养是一种用于制备、观察和研究细胞以及它们与药物、生物因子和生物材料在体外相互作用的方便的方法。但这与所述细胞在体内的生长方式相距甚远。在真实的活体内，细胞通常是三维生长的并构建形成三维的活组织或器官。越来越多的证据表明体外的三维细胞培养体系可以加深对正常和病理的组织的结构-功能关系的了解。为了研究这种功能性和形态学上的相互关系，一些研究者已经探索使用三维的凝胶基质，包括胶原凝胶[DouglasWHJ,MoormanGW,和TeelRW,Theformationofhistotypicstructuresfrommonodispersefetalratlungcellsculturedonathreedimensionalsubstrate.InVitro1976;12:373-381]、明胶、血纤维蛋白、琼脂糖和藻酸盐[GruberHE，FisherECJrjDesaiB，StaskyAAjHoelscherG，HanleyENjHumanintervertebraldisccellsfromtheannulus:ThreedimensionalcultureinagaroseoralginateandresponsivenesstoTGF—bLExp.CellRes.1997，235:13-21;GruberHE,StaskyAAjHanleyENJrjCharacterizationandphenotypicstabilityofhumandisccellsinvitro.MatrixBiol.1997;16:285-288]。在这些凝胶体系中，将细胞培养在凝胶基质内以三维的方式生长。近来的研究已经显示，与单层生长的细胞相比，培养在三维的藻酸盐或琼脂糖凝胶体系中的人椎间盘细胞(humanannulusdisccells)显示出不同的形态,增加了含蛋白多糖的合成，并且形成带有沉积在细胞周围和之间的胞外基质的多细胞集落[GruberHE,FisherECJr,DesaiB,StaskyAAjHoelscherG，HanleyENjHumanintervertebraldisccellsfromtheannulus:ThreedimensionalcultureinagaroseoralginateandresponsivenesstoTGF-bl.Exp.CellRes.1997，235:13-21;GruberHE，StaskyAAjHanleyENJrjCharacterizationandphenotypicstabilityofhumandisccellsinvitro.MatrixBiol.1997;16:285-288]。此外，在所述三维藻酸盐凝胶体系中培养的人椎间盘细胞证实产生了I型和II型胶原，而该I型和II型胶原在单层细胞培养时未有发现[GruberHE和HanleyEN，Jr，Humandisccellsinmonolayervs3Dculture:cellshape,divisionandmatrixformation,BMCMusculoskeletalDisorders,2000;1:1]。体外动物细胞的三维生长促进正常上皮细胞的极化和分化[RoskelleyCD，BissellMJjDynamicreciprocityrevisited:acontinuous,bidirectionalflowofinformationbetweencellsandtheextracellularmatrixregulatesmammaryepithelialcellfunction,BiochemCellBiol1995;73(7-8):391-7]。与活组织细胞相比较，三维培养的细胞移动和分裂得更快并且具有一种特征性的不对称外形[CukiermanEjPankovRjStevensDRjYamadaKMjTakingcellmatrixadhesionstothethirddimension,Science，2001;294(5547):1708-12]。三维细胞培养还被用于研究细胞与生长因子以及细胞和药物之间的相互作用。癌细胞的三维细胞培养可用于研究许多与癌生物学有关的基础性问题，因为与标准的二维组织培养平板相比，癌细胞的肿瘤发展生长因子的受体在三维细胞培养时的表达方式是不同的[WangF，WeaverVMjPetersenOWjLarabellCA，DedharS，BriandP，LupuRjBissellMJ.Reciprocalinteractionsbetweenbetal—integrinandepidermalgrowthfactorreceptorinthreedimensionalbasementmembranebreastcultures:adifferentperspectiveinepithelialbiology.ProcNatlAcadSciUSA1998;95(25):14821-6;JacksT，WeinbergRA.Takingthestudyofcancercellsurvivaltoanewdimension.Cell,2002;111(7):923-5]对于乳腺癌，三维细胞培养体系提供一种用于了解癌细胞增殖调控以及用于评价不同抗癌药物的模型体系[BissellMJjRizkiA,MianIS,Tissuearchitecture:theultimateregulatorofbreastepithelialfunction.CurrOpinCellBiolmj2003;15(6):753-62;PadronJMjvanderWiltCL，SmidK，Smitskamp-WilmsE，BackusHHjPizaoPEjGiacconeGjPetersGJ.Themultilayeredpostconfluentcellcultureasamodelfordrugscreening.CritRevOncolHematol，2000;36(2-3):141-57]大量的证据表明，与在单层或分散培养物中的细胞相比，三维培养中生长的细胞对细胞毒性试剂具有更高的耐受性。许多研究已经揭示，与单层细胞相比，球体细胞培养具有更高的耐药性[HoffmanRM.Three-dimensionalhistoculture:originsandapplicationsincancerresearch.CancerCells1991;3(3):86-92]。起初，研究者们将细胞球体对药物的耐受性归因于药物向球体内部细胞的不良扩散，但是现在已经证实，耐药性是由三维细胞培养而引起的，而不是仅仅无法接触到营养物质[LawlerEMjMillerFR，HeppnerGHjSignificanceofthreedimensionalgrowthpatternsofmammarytissuesincollagengels.InVitro1983;19(8):600-10;MillerBE，MillerFR,HeppnerGHjFactorsaffectinggrowthanddrugsensitivityofmousemammarytumorlinesincollagengelcultures.CancerRes,1985;45(9):4200-5]。进一步的研究证实，三维细胞培养是一种用于评价抗癌药物的体外细胞毒性的更好的模型[HarpreetK.DhimanjAlokRRayjAmulyaKPanda，Three-dimensionalchitosanscaffoldbasedMCF—7cellcultureforthedeterminationofthecytotoxicityoftamoxifen,Biomaterials,2005;26979-986]o不断增加的证据表明，三维的环境也能揭示细胞功能的基本机制，而且体外的三维培养体系可以促进对在正常和病理条件中的结构-功能关系的了解[AbbottA.Cellculture:biology’snewdimension.Nature,2003;424(6951):870-2;HutmacherDW.Scaffolddesignandfabricationtechnologiesforengineeringtissues—stateoftheartandfutureperspectives.JBiomaterSciPolymEdj2001;12:107-24;SchmeichelKLjBissellMJ.Modelingtissue-specificsignalingandorganfunctioninthreedimensions.JCellScij2003;116(Ptl2):2377-88;ZahirN，WeaverVMjDeathinthethirddimension:apoptosisregulationandtissuearchitecture.CurrOpinGenetDev2004;14:71-80;MartinI，WendtD，HebererMjTheroleofbioreactorsintissueengineering,TrendsBiotechnolj2004;22:80-6]。现已被普遍接受的是，骨和软骨来源的细胞在三维与二维的环境中的行为不同，并且，上述三维体外培养体系比二维培养体系能更接近地模拟体内的情况[KaleS，BiermannS，EdwardsC，TarnowskiC，MorrisM,LongMW,Three-dimensionalcellulardevelopmentisessentialforexvivoformationofhumanbone.NatBiotechnol,2000;18:954-8;FerreraD,PoggiS,BiassoniC,DicksonGR,AstigianoS,Barbieri0,FavreA,FranziAT,StrangioA,FedericiA,ManducaP,Three-dimensionalculturesofnormalhumanosteoblasts:proliferationanddifferentiationpotentialinvitroanduponectopicimplantationinnudemice,Bone2002;30:718-25;TallhedenT,KarlssonC,BrunnerA,VanDerLeeJ,HaggR,TommasiniR,LindahlA.Geneexpressionduringredifferentiationofhumanarticularchondrocytes.OsteoarthritisCartilage,2004;12:525-35;]。在近期的研究中，在一种羟丙基甲基纤维素水凝胶基质的内部，三维培养三种人成骨细胞系以及正常的人成骨细胞。已经证实，骨肉瘤细胞以群落球体的方式而增殖，而且所述的人成骨细胞集落存活至少3周。成骨细胞标志物和细胞因子的矿化试验和基因表达分析表明，在上述水凝胶基质中进行三维培养的细胞比在塑料细胞培养平板中单层培养的细胞表现出一种更加成熟的分化状况[TrojaniC，WeissP,MichielsJF,VinatierC，GuicheuxJ,DaculsiG,GaudrayP,CarleGF,RochetN.,Three-dimensionalcultureanddifferentiationofhumanosteogeniccellsinaninjectablehydroxypropylmethyIceIlulosehydrogel,Biomaterials,2005;26(27):5509-17]。迄今为止的证据已经清楚地表明，在三维环境下培养细胞具有二维细胞培养不可比拟的巨大优点。目前的三维细胞培养产品主要有凝胶体系和三维细胞培养支架。采用凝胶体系时，所述培养的细胞被包埋在凝胶基质内部，由于物质在所述凝胶中的扩散受到一定的限制，因此该细胞培养的营养和代谢产物的交换是个问题。并且，由于所述培养的细胞包埋在凝胶内部，培养后回收或分离所述细胞非常困难。这与使用二维细胞培养平板不同，二维培养的细胞可以使用胰蛋白酶简单地将细胞从培养平板上洗脱并通过离心加以分离。此外，在凝胶基质内培养细胞要求在每次培养细胞前制备所需的凝胶体系，这不仅会在大量培养时给研究者们造成不方便，而且由于在不同的研究者和实验室之间凝胶的制备方式上存在着轻微的差异，从而会在不同批次的凝胶制备之间造成质量的不—致。三维多孔支架是另一种能够用来进行三维细胞培养的体系。三维多孔支架在使用时将细胞接种于支架的多孔结构中，在适当的细胞培养条件下，细胞即可在此多孔结构中培养形成三维组织结构。常见的有多孔磷酸钙支架，聚乳酸支架，聚乳酸和乙交酯共聚物支架，胶原蛋白支架，海藻酸钠支架。其共同的特点是它们具有无规的孔洞形状和尺寸。孔洞之间的连通性不好，因此细胞不容易进入支架中心，即使进入到多孔支架的中心，由于营养和代谢产物的交换不容易，因此细胞在这些三维细胞培养支架的中心生长受到限制，甚至死亡。因此大大限制了采用三维多孔支架进三维细胞培养的进展。综上所述，尽管三维细胞培养有更多的优点，但由于上面提到的目前使用的三维凝胶培养体系所存在的种种问题，二维细胞培养仍然是主要的细胞培养方法。因此，一种兼具二维细胞培养体系的全部便捷之处的三维培养体系，对于医药、生命科学以及生物工程研究领域极具价值。这一理想的三维细胞培养体系将需要首先具有能够让使用者像在使用平面细胞培养板那样很方便地观察细胞在三维细胞培养支架中的生长情况。长期以来，聚苯乙烯已经成为一种成功地用于二维细胞培养的培养物基底材料。由聚苯乙烯制造的细胞培养平板被广泛地使用并且具有可从许多供应商处商购获得的多种尺寸规格。由于聚苯乙烯培养平板对做细胞或组织培养的研究者们来说相当熟悉，因此可以想像，一种由聚苯乙烯制造的三维细胞培养体系将不仅能提供三维培养环境的优点，而且能够提供聚苯乙烯二维细胞培养体系的许多其它优点，具有明确的表面性质且易于使用。然而，聚苯乙烯作为三维细胞培养体系的应用在以前却几乎从未被探索过。近来，Baker等人报导其使用静电纺丝技术加工出一种三维多孔的聚苯乙烯纤维基体[BakerSC,AtkinN,GunningPA,GranvilleN,WilsonK,WilsonDandSouthgateJ,Characterisationofelectrospunpolystyrenescaffoldsforthree-dimensionalinvitrobiologicalstudies,Biomaterials,2006;27,3136-46]。他们获得的三维聚苯乙烯纤维基体类似于一种无纺垫，其中有内部纤维间的空隙就是多孔的空隙。他们将该三维聚苯乙烯纤维基体切割成适当的可以放在6孔聚苯乙烯培养平板的孔中的尺寸。经在氩气中等离子体处理后，将这些三维聚苯乙烯纤维基体接种细胞并且在常用的6孔聚苯乙烯细胞培养平板中进行细胞培养。结果表明，这些三维聚苯乙烯纤维基体具有适于细胞贴附的良好的表面性质。该数据揭示，这些聚苯乙烯三维纤维性支架可以是二维聚苯乙烯细胞培养平板体系的一种补充。然而，这些纤维性聚苯乙烯基体的缺点是所述基体的孔径尺寸和孔的形状不易确定并且该纤维性基质在自然状态下是软的，从而令所述基质在不发生变形的情况下进行进一步的操作产生困难。发明专利“三维细胞培养插入件，其制造设备和成套用具”(200720187562.7)提供了一种具有规则孔洞结构的三维细胞培养支架。该支架用于三维细胞培养应用，与目前的二维组织培养体系包括组织培养平板一起使用。该支架具有100%的孔联通性，细胞可以很容易均匀地接种在支架上并且生长良好。然而，在进行细胞接种时，由于孔是100%联通的，因此会有少量的细胞从此三维细胞培养支架上漏到细胞培养板上，从而影响到细胞在三维支架上的接种效率。
发明内容本发明的目的在于克服上述不足，提供一种双相多孔三维细胞培养支架，可以提高细胞接种效率，并能够对在其上生长的细胞，特别是干细胞的成长和分化起到促进和调控作用。本发明的目的是这样实现的一种双相多孔三维细胞培养支架，所述双相多孔三维细胞培养支架是由粗纤维相和细纤维相两种直径截然不同的材料构成的，其中粗纤维相比所培养的细胞的尺寸大，细纤维相比所培养细胞的尺寸小，粗纤维相分为多层粗纤维结构，所述相邻两层粗纤维结构按一定角度排列，细纤维相单独结合在粗纤维相的一面或多面；细纤维相可均匀分布或集中分布在粗纤维相构成的三维细胞培养支架的孔洞结构中。本发明双相三维细胞培养支架，所述粗纤维构成的三维细胞培养支架由恒定或不同直径的支柱和/或纤维组成。本发明双相三维细胞培养支架，所述细胞培养支架的孔隙率通过改变所述支架中的支柱和/或纤维的数量和尺寸而改变；和/或所述多孔结构可通过改变支柱和/或纤维的三维定位图案而改变。本发明双相三维细胞培养支架，粗纤维具有圆形、三角形、正方形和/或矩形的横截面。本发明双相三维细胞培养支架做成适合细胞培养平板孔、培养室、培养瓶和/或生物反应器的尺寸。本发明双相三维细胞培养支架,粗纤维相的材料与细纤维相的材料为同一种材料。本发明双相三维细胞培养支架，所述粗纤维与细纤维均由无细胞毒性的材料制成。本发明双相三维细胞培养支架，粗纤维相与细纤维相均为非降解性材料。本发明双相三维细胞培养支架，粗纤维相与细纤维相均为可降解性材料。本发明双相三维细胞培养支架，其中一相材料为非降解材料，另一相为可降解材料。本发明双相三维细胞培养支架，所述细胞培养支架采用表面改性技术处理改善所述细胞支架的细胞贴附作用。本发明双相三维细胞培养支架，所述表面改性技术是物理化学方式包括等离子体处理、辉光放电处理，和/或化学方式，使用H2SO4、HNO3强酸处理。本发明双相三维细胞培养支架，所述表面改性技术是一种表面涂覆技术，通过施加一种不同于用于制备权利要求I所述构建体的聚合物的涂层物质，所述涂层物质是天然存在的聚合物，和/或合成聚合物，和/或无机物质，和/或两种或多种有机材料组成的复合涂层，和/或一种无机/有机的复合物。本发明双相三维细胞培养支架，所述涂层物质包括蛋白、肽、糖胺聚糖、胶原、粘连蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚赖氨酸、磷酸钙、TiO2,SiO2,Al2O3、凝胶和脱乙酰壳多糖、聚丙烯酸和聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙/胶原复合物、钙磷酸/聚乙二醇复合物、磷酸钙/胞外基质中的一种或几种。本发明双相三维细胞培养支架，所述的表面涂层物质是以化学方式包括共价键、氢键、离子键或范德华力结合到所述细胞培养支架的支柱和/或纤维上。本发明双相三维细胞培养支架的制作方法，所述方法包括(A)采用快速成型方法制备粗纤维相构成的半成品多孔三维支架；(B)在半成品多孔三维支架外表面采用静电纺丝技术喷涂细纤维；(C)继续在带有细纤维相的面上采用快速成型方法制备多孔三维支架，从而使得细纤维相被固定在粗纤维相构成的三维支架内部；(D)利用机械切割方法，将双相多孔三维细胞培养支架切割成所需尺寸；(E)使用一种等离子体表面处理器，在氩气气氛中将所述细胞培养支架进行等离子体处理；(F)分别地包装该等离子体处理过的细胞培养支架，并且最终用20KGy剂量的Y射线辐射进行灭菌。本发明双相三维细胞培养支架培养细胞的方法，所述方法包括(A)使用动态接种或静态接种方法，将细胞接种于所述细胞培养支架中；(B)接种细胞以后，将所述细胞培养支架保持在浸没于生长培养基之中的细胞培养支持物，包括组织培养平板、培养室、培养瓶和/或生物反应器中进行培养。与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明双相多孔三维细胞培养支架，进一步增加了比细胞直径小的多的细纤维，包括纳米直径的纤维。细纤维，特别是纳米纤维，能够促进细胞吸附。纳米纤维具有比细胞小的多的直径，在结构方面与哺乳动物体内的胶原和弹性纤维相似，因此细胞能够很容易贴附到纳米纤维上。纳米纤维还能够有效的促进干细胞在其上的分化。因此，添加细纤维到三维细胞培养支架上能够提高细胞接种效率，并能够对在其上生长的细胞，特别是干细胞的成长和分化起到促进和调控作用。图I为本发明双相多孔三维细胞培养支架的结构示意图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。所属领域技术人员应当理解，对于下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。参见图1，本发明双相多孔三维细胞培养支架是由两种直径截然不同的材料构成的，其中一相是由比所培养的细胞尺寸大的粗纤维相所构成，粗纤维相分为四层粗纤维结构，所述相邻两层粗纤维结构按一定角度排列，相邻两层粗纤维之间呈90度排列，或者成60度排列，或者成45度排列；粗纤维相提供规则的多孔结构供细胞在其中进行三维生长；另一相则是由比所培养细胞尺寸小的细纤维相所构成，细纤维相单独结合在粗纤维相的一面或多面，促使细胞吸附在细纤维上，从而阻止细胞从粗纤维相构成的多孔三维细胞培养支架中漏出。细纤维相还被选择性的加入到粗纤维相构成的多孔三维细胞培养支架中。构形本发明双相多孔三维细胞培养支架可以形成用于实现具体的应用目的的任何大小和形状，所述应用目的适合细胞/组织培养平板、烧瓶和生物反应器的大小和形状。在一种实施方式中，本发明提供一种由粗细不同的两种纤维构成的三维细胞培养支架。其中，粗纤维或支柱构成三维细胞培养支架的主要框架结构。所述支柱和纤维按照一种预先设计的方式或图案结合在一起。细纤维依托于粗纤维，提供细胞更容易吸附的结构并影响细胞的生长和分化情况。通过所述支架的整体设计来确定细胞培养支架的孔隙率和孔径尺寸，所述支架的设计包括支柱或粗纤维的尺寸和几何结构，每单位体积内支柱或粗纤维的数目，以及该三维支架中粗纤维或支柱的结构图案。细纤维则以一种无序或有序排列的方式加入到支架的多孔结构中。在一种实施方式中，本发明的支架设计是一种由支柱和/或粗纤维在连接处相互垂直结合而组成的三维细胞培养支架。细纤维则以一种无序或有序排列的方式加入到支架的多孔结构中。在一种实施方式中，本发明提供一种由支柱和/或粗纤维组成的三维细胞培养支架，在该支架中，所述支柱和/或纤维在连接处并不都是彼此垂直的，而是以不同的角度结合。细纤维则以一种无序或有序排列的方式加入到支架的多孔结构中。在一种具体的实施方式中，所述双相多孔三维细胞培养支架是一种三维的圆盘形多孔结构。在另一种具体的实施方式中，所述双相多孔三维细胞培养支架是一种三维的立方体形多孔结构。尺寸本发明所述的双相多孔三维细胞培养支架预先加工成标准尺寸，或者定做成适合具体的细胞培养平板孔、箱、烧瓶、生物反应器的尺寸。在一种实施方式中，本发明提供一种具有一种尺寸(直径和高度)的双相多孔三维细胞培养支架，其适合一种可商购的组织培养平板的圆形孔。在另一种实施方式中，本发明提供一种具有一种立方形尺寸(长X宽X高)的双相多孔三维细胞培养支架，其适合一种组织培养平板的矩形孔。在另一种实施方式中，该双相多孔三维细胞培养支架具有适合一种生物反应器的腔室的尺寸和形状。在一种具体实施方式中，该双相多孔三维细胞培养支架的尺寸适合一种组织培养烧瓶的立方空间。该双相三维细胞培养支架的支柱/粗纤维的直径为50Mm-1mm。细胞培养支架的平均孔径为50Mm—2mm。所述粗纤维相构成的三维细胞培养支架由恒定或不同直径的支柱和/或纤维组成；优选地，所述细胞培养支架的孔隙率通过改变所述支架中的支柱和/或纤维的数量和尺寸而改变；和/或优选地，多孔结构可通过改变支柱和/或纤维的三维定位图案而改变。细纤维相可均匀分布或集中分布在粗纤维相构成的三维细胞培养支架的孔洞结构中。优选地，所述粗纤维相与细纤维相采用同种或不同种的材料。优选地，细纤维相由不同材料组成。所述材料优选为无细胞毒性的材料所制成的。材料是聚合物，无机非金属材料，金属材料以及上述材料的复合物。聚合物材料优选自聚苯乙烯、聚外消旋乳酸(PDLLA)、聚乳酸和乙交酯的共聚物，聚碳酸酯、聚酰胺和聚氯乙烯的聚合物材料制成。无机非金属材料优选自磷酸三钙，羟基磷灰石，硅酸盐，三氧化二铝。金属材料优选自钛，钛合金，不锈钢，钽，镁合金。所述双相多孔三维细胞培养支架通过表面改性技术处理，从而改善细胞贴附作用。优选地，所述表面改性技术是物理化学方式，包括等离子体处理、辉光放电处理，和/或化学方式，使用H2S04、HNO3强酸处理。优选地，所述表面改性技术是一种表面涂层技术，通过涂覆一种多种不同于用于制备本发明所述构建体的聚合物的涂层物质。优选地，所述涂层物质是天然聚合物，包括蛋白、肽、糖胺聚糖、胶原、粘连蛋白和/或合成聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚赖氨酸；和/或无机物质，包括磷酸钙、TiO2,SiO2,Al2O3;和/或两种或多种有机材料组成的复合涂层，包括凝胶和脱乙酰壳多糖，聚丙烯酸和聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮和/或一种无机/有机的复合物，包括磷酸钙/胶原复合物、钙磷酸/聚乙二醇复合物、磷酸钙/胞外基质。优选地，所述双相多孔三维细胞培养支架的细纤维相与支架涂覆同种或者不同种涂层。优选地，所述表面涂层物质是以化学方式包括共价键、氢键、离子键或范德华力结合到所述双相多孔三维细胞培养支架的支柱和/或纤维上。优选地，所述双相多孔三维细胞培养支架做成适合细胞培养平板孔、箱、烧瓶和/或生物反应器的尺寸。优选地，所述粗纤维相是由恒定或不同直径的聚合物支柱和/或纤维组成。优选地，所述粗纤维相的孔隙率通过改变构成所述支架的支柱和/或纤维的数量和尺寸而改变。所述粗纤维相的多孔结构也可通过改变支柱和/或纤维的三维定位图案而改变。优选地，所述粗纤维相的支柱和/或纤维具有圆形、三角形、正方形和/或矩形的横截面。优选地，所述双相多孔三维细胞培养支架带有的细纤维相覆盖在粗纤维相构成的三维细胞培养支架的外表面。优选地，细纤维相位于粗纤维相构成的支架材料中间。优选地，细纤维分布在粗纤维相构成的多孔支架中。实施例I:双相多孔三维细胞培养支架的制造方法方法一(A)使用聚苯乙烯材料制造双相多孔三维细胞培养支架，采用快速成型方法制备粗纤维相构成的半成品多孔三维支架。(B)在半成品多孔三维支架外表面采用静电纺丝技术喷涂细纤维。(C)继续在带有细纤维相的表面采用快速成型方法制备多孔三维支架，从而使得细纤维相被固定在粗纤维相构成的三维支架内部。(D)利用机械切割方法。将双相多孔三维细胞培养支架切割成所需尺寸。(E)使用一种等离子体表面处理器。在氩气气氛中将双相多孔三维细胞培养支架进行等离子体处理。(F)分别地包装该等离子体处理过的双相多孔三维细胞培养支架，并且最终用20KGy剂量的Y射线辐射进行灭菌。方法二(A)使用常规的聚合物加工方法，包括注塑、纤维织造和粘合技术制造所述支架的单个片层。(B)根据结构设计，将步骤(A)所述的多个多孔片层结构切割或不经切割后，组装成所述的细胞培养支架。所述组装优选使用非细胞毒性的聚合物纤维或夹子连接件。(C)根据结构设计，可将细纤维相通过静电纺丝技术喷涂在组装好的三维支架外表面。也可将纤维喷涂在未组装的支架的单个片层上，再进行支架组装。所述表面涂覆处理优选是将所述涂层物质化学交联、加热交联、真空加热交联和/或辐射交联到所述细胞支架上。优选地，所述交联是化学进行的。优选地，所述交联是使用加热进行的。优选地，所述交联是使用真空加热进行的。优选地，所述交联是使用辐射进行的。进一步优选地，所述福射是电子束(e-beam)福射、Y福射和/或紫外线福射。所述涂层优选是交联的。进一步优选地，所述交联是使用辐射进行的，所述辐射优选是电子束辐射、Y辐射和/或紫外线辐射。进一步优选地，所述交联是化学进行的。进一步优选地，所述交联是使用加热和真空进行的。实施例2:使用双相多孔三维细胞培养支架来培养细胞本发明还提供在组织培养聚苯乙烯平板中使用该双相多孔三维细胞培养支架培养活细胞的方法。用于该研究的双相多孔三维细胞培养支架具有IOmm宽XIOmm长X0.3mm厚的尺寸,具有200μm的正方形孔和400μm的纤维直径。细纤维直径为Iμm。使用静态接种方法接种平滑肌细胞用移液管将500μI平滑肌细胞悬浮液(1X105个细胞/毫升)从所述支架的上表面加入，使细胞在37°C下贴附2小时后再灌入更多细胞培养基。接种了细胞后，将所述细胞培养支架放入含有细胞培养基的多孔平板中，并且在37°C下，于一种90%湿度的含5-10%C02的空气气氛内于培养箱中进行培养。所述生长培养基由包含5%(v/v)胎牛血清的Dulbecco氏改进的Eagle’s培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium,DMEM)组成。在使用动态接种方法的情形下，接种是通过将所述细胞培养支架浸没于装在旋转烧瓶内的细胞悬浮液中，于60rpm下搅拌进行的，并且将该旋转烧瓶在37°C下放在湿润的5%C02培养箱中。接种以后，将所述细胞培养支架放置到带有细胞培养基的组织培养平板的孔中，于37°C下湿润的5%C02培养箱中进一步培养，并定期更换培养基。当于某一确定的时间点完成细胞培养后，将所述细胞培养支架从细胞培养平板中取出，并进行常规的分析。并且显微镜下观察在所述细胞培养支架的不同层或位置上的细胞贴附和细胞活性。在所述细胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液(SigmaT4049)对所述细胞进行胰酶消化。当细胞从所述细胞培养支架上脱离后，将细胞再次悬浮在小体积的新鲜的包含血清的培养基中，从而使胰蛋白酶失活。然后将这些细胞用于其它目的。实施例3:与聚苯乙烯组织培养平板一起使用本发明还提供使用所述细胞培养支架在一种聚苯乙烯组织培养平板内培养活细胞的方法。该细胞培养支架是一种圆盘或立方体的形状，以适合组织培养平板的孔。使用动态接种或静态接种方法，将细胞接种于所述细胞培养支架中。在一个实施例中，使用静态接种方法，将一定体积的细胞悬浮液用吸量管从所述细胞培养支架的上表面加入，并让细胞有一定的时间贴附到其上，然后再用培养液灌洗。接种细胞以后，将所述细胞培养支架放入含有细胞培养液的孔板中，在37°C下，相对湿度90%、二氧化碳含量5-10%的气氛中于培养箱内培养。在另一个实施例中，使用动态接种方法，所述接种是通过在一种旋转烧瓶中，将所述细胞培养支架浸入细胞悬浮液中来进行的。在接种后，将细胞培养支架放置到带有培养基的组织培养平板的孔内，在37°C下、5%二氧化碳的培养箱内进行进一步的培养。定期替换细胞培养基。当在某一确定的时间点完成细胞培养以后，将所述细胞培养支架从该细胞培养平板中取出，并进行常规的试验。将细胞培养支架拆开，以便在显微镜下观察在所述细胞培养支架的不同层或者不同位置上的细胞贴附和细胞活性。在所述细胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液对所述细胞进行胰酶消化。当细胞从所述细胞培养支架上分离后，将细胞再次悬浮在小体积的新鲜的包含血清的培养基中，从而使胰蛋白酶失活。然后可以将这些细胞清洗回收后用于其它目的。实施例4:与生物反应器一起使用本发明还提供使用所述细胞培养支架在生物反应器内培养活细胞的方法。该细胞培养支架是一种圆盘形或立方形，其尺寸和形状适合放置于所述生物反应器。在使用静态接种方法的一个实施例中，将一定体积的细胞悬浮液用吸量管从所述细胞培养支架的上表面加入，并且在用培养基灌洗前允许细胞贴附一定的时间。在使用静态接种方法接种以后，将这些接种了细胞的细胞培养物支架放入充满细胞培养基的生物反应器中，在37°C下、90%湿度、5-10%二氧化碳的气氛中培养。在整个细胞培养过程中，细胞培养液持续地流通过细胞培养支架的孔洞，并被定期更换。当在某一确定的时间点完成细胞培养以后，将所述细胞培养支架从该生物反应器中取出，并进行常规的试验。将细胞培养支架拆开，以便在显微镜下观察在所述细胞支架的不同层或者不同位置上的细胞贴附和细胞活性。在所述细胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液对所述细胞进行胰酶消化。当细胞从所述细胞培养支架上分离后，将细胞再次悬浮在小体积的新鲜的包含血清的培养基中，从而使胰蛋白酶失活。然后可以将这些细胞清洗回收后用于其它目的。权利要求1.一种双相多孔三维细胞培养支架，其特征在于，所述双相多孔三维细胞培养支架是由粗纤维相和细纤维相两种直径截然不同的材料构成的，其中粗纤维相比所培养的细胞的尺寸大，细纤维相比所培养细胞的尺寸小，粗纤维相分为多层粗纤维结构，所述相邻两层粗纤维结构按一定角度排列，细纤维相单独结合在粗纤维相的一面或多面；细纤维相均匀分布或集中分布在粗纤维相构成的三维细胞培养支架的孔洞结构中。2.根据权利要求I所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，所述粗纤维构成的三维细胞培养支架由恒定或不同直径的支柱和/或纤维组成。3.根据权利要求I所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，所述细胞培养支架的孔隙率通过改变所述支架中的支柱和/或纤维的数量和尺寸而改变；和/或所述多孔结构通过改变支柱和/或纤维的三维定位图案而改变。4.根据权利要求I所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，粗纤维具有圆形、三角形、正方形和/或矩形的横截面。5.根据权利要求I所述的双相多孔三维细胞培养支架，其特征在于，所述双相多孔三维细胞培养支架做成适合细胞培养平板孔、培养室、培养瓶和/或生物反应器的尺寸。6.根据权利要求1-5任一项所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，粗纤维相的材料与细纤维相的材料为同一种材料。7.权利要求6所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，粗纤维相与细纤维相均为非降解性材料。8.根据权利要求6所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，粗纤维相与细纤维相均为可降解性材料。9.根据权利要求6所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，其中一相材料为非降解材料，另一相为可降解材料。10.根据权利要求I所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，所述细胞培养支架采用表面改性技术处理改善所述细胞支架的细胞贴附作用。11.根据权利要求10所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，所述表面改性技术是物理化学方式包括等离子体处理、辉光放电处理，和/或化学方式，使用h2so4、HNO3强酸处理。12.根据权利要求11所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，所述表面改性技术是一种表面涂覆技术，通过施加一种不同于用于制备权利要求I所述构建体的聚合物的涂层物质，所述涂层物质是天然存在的聚合物，和/或合成聚合物，和/或无机物质，和/或两种或多种有机材料组成的复合涂层，和/或一种无机/有机的复合物。13.根据权利要求12所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，所述涂层物质包括蛋白、肽、糖胺聚糖、胶原、粘连蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚赖氨酸、磷酸钙、Ti02、Si02、Al203、凝胶和脱乙酰壳多糖、聚丙烯酸和聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙/胶原复合物、钙磷酸/聚乙二醇复合物、磷酸钙/胞外基质中的一种或几种。14.根据权利要求13所述的双相三维细胞培养支架，其特征在于，所述的表面涂层物质是以化学方式包括共价键、氢键、离子键或范德华力结合到所述细胞培养支架的支柱和/或纤维上。15.一种制造权利要求I所述的双相三维细胞培养支架的方法，所述方法包括(A)采用快速成型方法制备粗纤维相构成的半成品多孔三维支架；(B)在半成品多孔三维支架外表面采用静电纺丝技术喷涂细纤维；(C)继续在带有细纤维相的面上采用快速成型方法制备多孔三维支架，从而使得细纤维相被固定在粗纤维相构成的三维支架内部；(D)利用机械切割方法，将双相多孔三维细胞培养支架切割成所需尺寸；(E)使用一种等离子体表面处理器，在氩气气氛中将所述细胞培养支架进行等离子体处理；(F)分别地包装该等离子体处理过的细胞培养支架，并且最终用20KGy剂量的Y射线辐射进行灭菌。16.一种使用权利要求I所述的双相三维细胞培养支架培养细胞的方法，所述方法包括(A)使用动态接种或静态接种方法，将细胞接种于所述细胞培养支架中；(B)接种细胞以后，将所述细胞培养支架保持在浸没于生长培养基之中的细胞培养支持物，包括组织培养平板、培养室、培养瓶和/或生物反应器中进行培养。全文摘要本发明涉及一种双相多孔三维细胞培养支架由粗纤维相和细纤维相两种直径截然不同的材料构成的，其中粗纤维相比所培养的细胞的尺寸大，细纤维相比所培养细胞的尺寸小，粗纤维相分为多层粗纤维结构，所述相邻两层粗纤维结构按一定角度排列，细纤维相单独结合在粗纤维相的一面或多面；细纤维相均匀分布或集中分布在粗纤维相构成的三维细胞培养支架的孔洞结构中。本发明双相多孔三维细胞培养支架中细纤维相具有比细胞小的多的直径，细胞能够很容易贴附到纳米纤维上，还能够有效的促进干细胞在其上的分化。因此，添加细纤维到三维细胞培养支架上能够提高细胞接种效率，并能够对在其上生长的细胞，特别是干细胞的成长和分化起到促进和调控作用。文档编号C12N5/00GK102719391SQ201210186049公开日2012年10月10日申请日期2012年6月7日优先权日2012年6月7日发明者刘青申请人:江阴瑞康健生物医学科技有限公司