一种以环糊精辅助植物甾醇组合物制备雄甾4-烯-3，17-双酮的方法
【专利摘要】一种以环糊精辅助植物甾醇组合物制备雄甾4-烯-3，17-双酮的方法，提供一种利用诺卡氏菌属或分支杆菌属微生物对植物甾醇组合物进行发酵得到雄甾-4烯-3，17二酮和/或雄甾-1，4-二烯-3，17二酮的制备方法，发酵过程中加入环糊精，环糊精与植物甾醇组合物的摩尔比在1:?10-1:2之间。
【专利说明】—种以环糊精辅助植物留醇组合物制备雄留4-烯-3，17-双酮的方法
发明领域
[0001]本发明一般地涉及制备雄留-4-烯-3，17-双酮的方法，该种方法通过加入少量环糊精有效地提高了以植物留醇组合物为底物制备雄留-4-烯-3，17-双酮的收率，同时缩短了发酵时间，非常有利于工业化。
【背景技术】:
[0002]雄留4-烯-3,17-双酮(androst-4-ene_3,17-dione,简称:雄烯二酮或 AD)是留体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的。如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用于合成氢化可的松，氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是直接用于生产抗早孕药米非司酮和各类计划生育用药的必不可少的基本原料。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及类固醇类激素免疫抗原等，目前全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD做原材料生产的医药品种不断增加。
[0003]由于化学全合成雄烯二酮成本较高，国内外很多科学家一直研究如何通过生物发酵方法得到雄烯二酮。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆留醇和麦角甾醇为原料生产出雄留-4-烯-3，17 二酮(AD)及雄留-1,4- 二烯-3，17- 二酮(ADD)并以此作为合成留体药物的原料。近年来，由于留体药物应用量逐年增加，人们的目光又转到在动植物界中含量较多的胆留醇，谷留醇，菜油留醇等，并被认为是具有巨大潜能的留体激素类药物的起 始原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除留醇的饱和侧链而得到AD和ADD，70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用留醇为唯一碳源分离微生物和改变留醇结构用作发酵的底物，并用能防止留醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力己获得很大进展(Marsheck等，ApliedMicroobiology, 23 (I):72~77，1972)。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5~7.38可提高生物降解AD、ADD的转化率。Upjohn公司在美国专利N0.4，293，644中描述了一种通过分枝杆菌(ATCC 29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄_4_烯-3，17-二酮(AD)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的产物的方法。以后的研究发现节杆菌，诺卡氏菌和分枝杆菌等微生物均可用于直接切除留醇的饱和侧链，在一定条件下得到AD和ADD，这使得微生物转化工业化生产成为可能。
[0004]由于生物发酵方法研究较多的是菌种，但发酵效果除了与菌种本身密切相关外，菌种在发酵过程中所使用的方法也十分重要。杨英在文章中指出(微生物降解留醇侧链转化雄留-4-烯-3 17-二酮的研究进展，微生物学通报，2006年33 ( 6)，142-145)留醇底物在水溶液培养基中溶解度差和存在严重的产物(底物)抑制的问题一直困扰了整个甾类工业，留醇是一种疏水性化合物，在水中溶解度极低，这就导致底物与微生物细胞不能很好的接触，使转化率偏低及转化时间延长。采用超声破碎、表面活性剂及有机溶剂来溶解底物虽然取得了一定成果，但表面活性剂和有机溶剂对细胞的活性有一定的抑制从而制约了它的应用。
[0005]分支杆菌(Mycobacterium sp.)是一种可以使植物甾醇发酵而得到雄甾-4-烯-3，17 二酮(AD)及雄甾-1，4- 二烯-3，17- 二酮(ADD)的重要菌种，其发酵过程也存在上述问题。
[0006]同时利用分支杆菌进行发酵，时间较长，往往长达72小时，多篇文献对此均进行了可介绍，例如CN03804973，而长时间发酵的问题在于首先是容易造成微生物过分发酵，将得到的AD/ADD转化为9 α -羟基睾酮甚至将留环降解，其次是反应时间过长会使杂菌增加，而培养菌的转化专一性下降，从而增加杂质，第三长时间反应还会造成生产周期、制造成本、人工成本等上升，不利于工业化。
[0007]环糊精(Cyclodextrin，简称⑶)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6~12个D-吡喃葡萄糖单元。其中研究得较多并且具有重要实际意义的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为alpha ( a ) -,beta ( β )-和gama ( Y )-环糊精。根据X_线晶体衍射、红外光谱和核磁共振波谱分析的结果，确定构成环糊精分子的每个D (+)_吡喃葡萄糖都是椅式构象。各葡萄糖单元均以I，4-糖苷键结合成环。
【发明内容】
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[0008]通过研究我们惊奇的发现，环糊精没有也无法对发酵底物进行包合的情况下，加入在分散植物留醇组合物的植物油中加入与植物留醇组合物的摩尔比为1:5-10环糊精，尤其是后，微生物将植物留醇组合物转化为AD的速度、纯度都有了明显的提高，尤其是在分支杆菌的发酵中体现的尤为明显。
[0009]有文献报道环糊精在生物发酵中可以起到一定的作用，这是通过环糊精对发酵底物进行包合，从而使底物溶解，提高发酵速度。
[0010]环糊精与植物甾醇组合物的摩尔比大于1: 10即可，但当摩尔比大于1: 2时得到的效果并不随着环糊精的增加而提高，为了降低成本，工业上一般对于这种情况习惯上环糊精与植物留醇组合物的摩尔比选择不超过1: 2。
[0011]众所周知环糊精与底物的摩尔比达到3:1时才能达到包合效果，但本发明中环糊精与与底物的摩尔比远小于此，所以是无法产生环糊精包合底物的结果的。
[0012]本发明中产生的技术效果，可能是由于环糊精尤其是Y环糊精在发酵过程中产生了类似催化剂的效果，促进了发酵过程，至于是否如此需要进一步研究。
[0013]以下的详细说明帮助本领域技术人员实施本发明。然而，此详细说明并不解释为对本发明范围的过度限制。本领域普通技术人员可以对在此讨论的实施例进行修饰和变化而不背离本发明范围的精神。在本发明中，该营养培养基适用于植物甾醇生物转化为AD和ADD所涉及各种微生物，包括分枝杆菌和诺卡氏菌。本领域中还有许多已知和可用微生物，本发明并不限制于其中的任何一个。
[0014]细菌发酵培养按其用途可分为孢子培养、种子培养、发酵培养三个过程，但这三个过程可以再同一个反应器中完成，也可以在不同的反应器中完成，甚至三个过程可以合并。
[0015]孢子培养是供菌种繁殖孢子的过程，是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是:第一，营养不要太丰富(特别是有机氮源)，否则不易产孢子。如灰色链霉在葡萄糖一硝酸盐一其它盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。第三，要注意孢子培养基的PH和湿度。生产上常用的孢子培养基有:麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。大米培养基的水分需控制在21% - 50%，而曲房空气湿度需控制在90% - 100%。一般该类培养基主要是在实验室内进行菌种传代使用，不参与工业化发酵过程。
[0016]种子培养是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”为目的。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的PH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。
[0017]发酵培养是供菌种生长、繁殖和合成产物的过程。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。发酵培养基也可以叫做生物转化培养基或发酵转化培养基。
[0018]如果需要，可以加入磷酸盐，镁和/或亚铁离子作为促生长因子；还可加入缓冲液以确保生长在基本中性的pH。开始时，消泡剂可能是有益的。当用于诱导发酵的是分离的细胞或酶而不是完整和生长的微生物时，不需要营养物质的存在；但是无论是何种情形，培养基通常主要为含水的。
[0019]在此使用的术语“植物留醇”包括所有的留醇并且没有限制，例如:谷留醇，莱油甾醇，豆留醇，菜籽留醇(包括二氢菜籽留醇)，链留醇，chalinosterol,多孔留醇，穿贝海绵甾醇，麦角甾醇，粪甾醇，科迪甾醇(codisterol ),异岩藻甾醇(isorucosterol),岩藻留醇，桐留醇，神经留醇(nervisterol )，7-烯胆留烷醇，星鱼留醇，菠菜甾醇，chondriIlasterol, peposterol，燕麦留醇，异燕麦留醇，fecosterol, Pollinastasterol,胆甾醇以及它们的所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体.并且包括它们所有的氢化对应物(“植物留烷醇(Phytostanols) ”)。植物留烷醇包括所有饱和或氢化的植物留醇以及它们的所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体。当在说明书全文中存在疑问时，需要了解的是术语“植物留醇”可包含植物留醇和植物留烷醇两者。
[0020]用于本发明生物转化的留醇和留烷醇(stanols)可以通过许多种天然来源获得。例如，它们可以从植物油(包括水生植物)的加工中获得，所述植物油如玉米油和其它植物油，麦胚芽油，大豆提取物，大米提取物，米糠，菜籽油，向日葵油，芝麻油。它们也可以衍生自真菌，例如麦角甾醇。因此，本发明并不限于甾醇的任何一个来源.美国专利4，420，427中公开了使用溶剂如甲醇从植物油渣中制备留醇。或者，植物留醇和植物留烷醇可以来自林业加工副产品妥尔油树脂(tall oil pitch )或制衆阜(pulping soap),如美国专利5，770, 749中所述，在此引入作为参考。
[0021]本专利中AD (D)的意思是AD和/或ADD。
[0022]本发明提供一种利用诺卡氏菌属或分支杆菌属微生物对植物留醇组合物进行发酵得到雄留-4烯-3，17 二酮和/或雄留-1,4- 二烯-3，17 二酮的制备方法，发酵过程中加入环糊精，环糊精与植物留醇组合物的摩尔比在1: 10-1:2之间。
[0023]所述制备方法，雄甾-4烯-3，17 二酮与雄甾-1，4-二烯-3，17 二酮的重量比为1:0.01-0.1。
[0024]所述制备方法，发酵温度为20_37°C。
[0025]所述制备方法，反应时间为20-60小时优选为25-50小时。
[0026]所述制备方法，反应中pH在7-9之间，优选在于反应中pH在7.5-8之间。
[0027]所述分支杆菌属微生物需要培养基培养。
[0028]所述培养基含有琼脂、碳源、氮源、PH调节剂、酶诱导剂、酶促进剂、水中的一种或几种。
[0029] 所述氮源为大豆粉、棉籽粉、酪蛋白的胰酶消化物、鱼粉、玉米浆、肉膏、蛋白质、带有奶固形物的自溶啤酒酵母、蛋白胨、酵母膏、水解酪蛋白、硝酸盐和/或铵类、乳清中的一种或几种。
[0030]所述碳源为碳水化合物，优选为甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、肌醇、糊精、蜜糖、淀粉、乳清中的一种或几种。
[0031]所述pH调节剂为碳酸钙、碳酸氢钠、磷酸盐中的一种或几种。
[0032]所述酶诱导剂为植物留醇组合物。
[0033]所述酶促进剂为含有Mn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、PO4'Ni2+、2，2’ -联吡啶，8_羟基喹啉中的一种或几种。优选为硫酸锰、硫酸镁、硫酸铜、氯化钙、氯化钴、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种。
[0034]所述分支杆菌属微生物为Mycobacterium NRRL B-3805、Mycobacterium NRRLB—3683、Mycobacterium VKMA C—1815D、Mycobacterium fortuitum.NRRL B—8153。
[0035]所述植物留醇组合物来自加工植物油的副产物。
[0036]所述植物油来自大豆、菜籽、玉米、棉籽、葵花籽、橄榄、亚麻籽、米糠中的一种或多种。
[0037]所述诺卡氏菌属微生物是Nocardia.aliena MC1-0710。
[0038]所述制备方法，其特征在于环糊精、植物留醇组合物和/或乳化剂混匀后投入发酵反应器。
[0039]所述乳化剂为来自大豆、菜籽、玉米、棉籽、葵花籽、橄榄、亚麻籽、米糠中的一种或多种植物油。优选为来自大豆的植物油。
[0040]所述乳化剂为聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物。，优选为名为Tegin，Tween和Span的乳化剂。
[0041]所述环糊精为Y环糊精。
[0042]所述环糊精与植物甾醇组合物的摩尔比在1: 5-1: 2之间。
[0043]在本发明中的发酵过程，可以将溶解于适宜溶剂中的或乳化形式的底物(植物甾醇组合物)和微生物培养物一起加入生物反应器中。进行发酵直到达到最大底物转化，即植物甾醇转化为AD(D)。
[0044]上述发酵方法尤其适用于分枝杆菌属(Mycobacterium)的微生物。
[0045]只要能促进植物留醇底物在溶剂中混合，从而最优化微生物培养物对底物的利用率，可以使用任何乳化剂。例如包括但并不局限于聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物和商品名为Tegin, Tween和Span的乳化剂。
[0046]或者，可以使用增溶剂溶解植物留醇组合物以形成澄清溶液，从而提供与在生物转化中所用微生物良好的接触。所选的适宜的增溶剂包括二醇(glycol)类和硅氧烷类增溶剂，它们能使高浓度的植物留醇被溶解于营养培养基中。这将使其与微生物良好接触，减少发酵时间，并得到最终产物的相对高收率。优选先前已知的增溶剂例如向日葵油、大豆油。
[0047]这种适用于植物留醇生物转化为AD和ADD所涉及细菌的培养基，其包含玉米浆和无机盐。而无机盐为优选硝酸钠和磷酸铵，更优选磷酸铵:硝酸钠为10:40-99。
[0048]上述培养基优选 含有葡萄糖的种子培养基。
[0049]上述所有培养基可以加入磷酸盐、镁和/或亚铁离子、缓冲液，其中的一种或多种。
[0050]上述所有培养基，其每升培养基含有玉米浆5_50ml。
[0051]上述培养基，其每升培养基含有无机盐4-10g。
[0052]上述所有培养基，其每升发酵培养基含有葡萄糖5_15g。
[0053]上述所有培养基，其每升培养基含有玉米浆5_50ml，无机盐4_10g，葡萄糖5_15g。
[0054]上述培养基如是种子培养基，则含有葡萄糖；上述培养基如是发酵培养基,则可以不含葡萄糖。
[0055]在发酵方法中，优选温度维持在大约20-37 V的范围内，更优选25-35 V。发酵或转化过程一旦完成，即用本领域已知和常规的方法回收AD (D)。
【具体实施方式】
[0056]以下的实施例代表实验室试验.然而，每个都能使用已知的工业技术扩展用于工业规模的应用以实施本发明。
[0057]以下的实施例中菌种中提到的NRRL是美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)的缩写，该中心是国际菌种保藏机构之一。
[0058]下述实施例中的植物甾醇是从市场上购买的含量大于95%的产品。
[0059]实施例1
[0060]实施例l-1-a
[0061]菌种:分枝杆菌:Mycobacteriumfortuitum.NRRL B-8153。[0062]取10个不同批号的玉米浆按照本实施例中的数量和工艺分别进行发酵。除玉米浆外其他的物料均为同一批物料。
[0063]种子培养阶段:
[0064]种子培养基(每升):
[0065]40ml 玉米衆
[0066]5.2g NaNO3,
[0067]0.8g NH4H2PO4
[0068]5.3g 葡萄糖
[0069]其余为无菌水
[0070]培养基量:200ml /烧瓶
[0071]接种物量:每200ml新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
[0072]容器:1000ml锥形瓶
[0073]揽拌:振荡器(I”throw) 200rpm
[0074]温度:30°C
[0075]生长时间:72小时培养
[0076]注解:如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生物
[0077]方法:
[0078]在培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂料面(在玻璃试管中培养)接种锥形瓶，在无菌条件下进行接种，移取无菌水(5mL )到琼脂抖面上.用移液管末端轻轻刮下细菌培养物.然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中.在旋转振荡器上进行细菌增殖(200rpm，l〃throW，30度)。在培养72小时后，此种子培养物即可转移至生物反应器中。在接种前对种子培养物长期储存是不可取的。在操作中，还可以针对种子进行二级乃至三级培养，将种子培养好，当进入发酵培养基后发酵的时间可以适当延长，以获得更好的生物转化率。
[0079]甾体发酵培养基(每升):
[0080]40ml 玉米浆
[0081]5.2g NaNO3,
[0082]0.8g NH4H2PO4
[0083]其余为无菌水
[0084]底物:0.05摩尔植物留醇组合物
[0085]乳化剂:向日葵油用量分别为50ml、150ml、250ml
[0086]在使用前一天，必需量的玉米浆与水(100mL)混合并在锥形瓶中灭菌(121°C持续20分钟)。
[0087]在烧瓶或烧杯中混合水(500ml)和培养基组分(除植物留醇和向日葵油以外)。用IM NaOH溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至8.0，将培养基转移至生物反应器中，随后加热至60-70°C。
[0088]在烧杯中称重植物留醇，加入向日葵油，加热边搅拌混合物，将上述向日葵油倒入生物反应器中已加热的液体培养基中(60-701:)，补无菌水至1L，无需搅拌。
[0089]将发酵罐灭菌(121°C持续30分钟)，然后冷却至30°C。使用上述培养基3L。[0090]在发酵罐中使用分枝杆菌进行的生物转化:
[0091]在带有有效底部搅拌的不锈钢发酵罐中进行生物转化实验。所用发酵罐的主要参数为:发酵罐总体积10升，工作体积3升，接种物量以0.4L，通气量0.3L/L/min,搅拌300rpmo
[0092]将发酵罐中培养基的温度调至30°C，在无菌条件下加入接种物。整个过程在30°C进行。从此阶段开始到最后都监测该过程的PH值和无菌度。10小时以后开始监测底物(植物甾醇)和产物AD(D)。此过程中生物转化混合物的pH值通常在IpH单位内变化并未校正。通过分析(HPLC)2小时内当泡沫层中的产物AD和ADD的总含量达到不变时，被认为已经完成生物转化，此是AD和ADD的总含量，具体发酵时间见下表。
[0093]HPLC测定AD (D)与植物甾醇的比例:
[0094]发酵液用1，2_ 二氯乙烷抽提，减压浓缩后稀释适当倍数，1000Or / min离心除去可能的不溶物，然后高压液相层析色谱柱:Alltima (4.6 mm(内径)X250mm) 5 μ m。流动相:石油醚:乙酸乙酯=6:4，流速:1.0mL / min,温度:室温,检测波长:240nm。
[0095]结果见下表
【权利要求】
1.一种利用诺卡氏菌属或分支杆菌属微生物对植物留醇组合物进行发酵得到雄甾-4烯-3，17 二酮和/或雄留-1,4- 二烯-3，17 二酮的制备方法，其特征在于的发酵过程中加入环糊精，环糊精与植物留醇组合物的摩尔比在1: 10-1:2之间。
2.如权利要求1的制备方法，其特征在于雄留-4烯-3，17二酮与雄留-1,4- 二烯-3，17 二酮的重量比为1:0.01-0.1。
3.如权利要求1的制备方法，其特征在于发酵温度为20-37°C。
4.如权利要求1的制备方法，其特征在于反应时间为20-60小时。
5.如权利要求1的制备方法，其特征在于反应时间为25-50小时。
6.如权利要求1的制备方法，其特征在于反应中pH在7-9之间。
7.如权利要求1的制备方法，其特征在于分支杆菌属微生物需要培养基培养。
8.如权利要求7的制备方法，其特征在于培养基含有琼脂、碳源、氮源、PH调节剂、酶诱导剂、酶促进剂、水中的一种或几种。
9.如权利要求1的制备方法,其特征在于分支杆菌属微生物为MycobacteriumNRRLB-3805、Mycobacterium NRRL B-3683、Mycobacterium VKMA C-1815D、Mycobacteriumfortuiturn.NRRL B_8153。
10.如权利要 求1的制备方法，其特征在于诺卡氏菌属微生物是Nocardia.alienaMC1-0710。
【文档编号】C12R1/365GK103865974SQ201210537585
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月13日 优先权日:2012年12月13日
【发明者】孙亮, 赵琳 申请人:天津金耀集团有限公司