专利名称：叶点霉发酵液中蒽醌类物质的提取的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，是生物技术在大分子分离纯化方面的探索性应用研究。
背景技术：
蒽醌类物质主要以两种形式存在，一是游离型蒽醌衍生物，多数为羟基蒽醌衍生物，二是游离型蒽醌衍生物与葡萄糖结合而成的苷类，可在酸性条件下加热水解，生成游离型蒽醌衍生物与葡萄糖。在蒽醌类物质中，具有生物活性的是带有羟基的蒽醌衍生物，如大黄、虎杖中的主要成分为大黄素、大黄酚和大黄酸，茜草中的主要成分为茜草素，番泻叶的主要成分为番泻苷。此类蒽醌物质广泛存在天然药材中，并且具有重要的功效。有研究表明，羟基蒽醌类物质具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤的作用，可应用于保健食品中，起到抗疲劳、抗衰老以及强身健体的作用。另外，此类物质在老年痴呆、艾滋病、心脑血管疾病和癌症的预防和治疗方面，也得到了更进一步的研究和广泛的应用。为寻求适用于工业生产蒽醌类功能因子的方法，有必要从原料上降低成本，简化操作方法。本实验利用从自然环境中分离的野生叶点霉菌发酵，并从其发酵液中提取出具有生物活性的蒽醌类物质，作为一种功能因子。由于分离技术和检测手段的快速发展，在进行纯化时，本实验将分离和检测两者结合应用，首先根据相似相容原理，用多种溶剂进行粗提取，同时结合相应的检测手段，将其中主要组分分离出来，然后定向的将含量较低的组分通过层析等分析方法分离出来，并加以鉴定。
发明内容
本发明目的是提供一种从野生叶点霉菌发酵液中高效提取蒽醌类物质的快捷方法。该方法简单，可操作性强，提取效率高，原料成低廉。
具体实施例方式实施例I目标组分的粗提取用灭菌后的纱布过滤叶点霉发酵液，除去固体培养基物质，得棕色澄清过滤液。取滤液500mL，加入15%的硫酸溶液(V/V) IOOmL进行酸化，摇匀，静止30min，得棕色酸化液。利用相似相容原理，以正丁醇为萃取剂萃取酸化液，按照少量多次的原则，分三次进行萃取，正丁醇用量依次为200mL、200mL、100mL，得500mL棕黄色正丁醇萃取液。 2检测波长的确定设置检测波长范围200nm 900nm,利用紫外-可见光分光光度计检测萃取液的最佳吸收波长。3 浓缩采用旋转蒸发仪进行减压浓缩，设置参数压力为0. 085MPa，转速为60rpm，温度为81 °C，浓缩至30mL。取5mL浓缩液加入5mL水稀释备用。
4凝胶分离利用凝胶柱层析分离目标物质，固定相为Sephadex LH-20，流动相为水，柱温18. 6°C，pH值为8. 2，设置流速为1. OmL/min,检测波长为291nm,在3. 6min时开始进样，进样量为2. OmL稀释液。5TLC 纯化层析后对分离出的组分用250 u m薄层硅胶板纯化，展开剂为苯、乙酸乙酯、醋酸的混合液，混合比例为苯乙酸乙酯醋酸为75 24 1(V/V/V)。切下含有目标物质的硅胶，溶于乙酸乙酯，充分搅拌，过滤回收硅胶，调滤液至中性，真空冷冻干燥滤液，即得纯品。·
权利要求
1.本发明涉及叶点霉发酵液中蒽醌类物质的提取方法，其特征在于所述方法包括下述步骤a.选用从野生环境下分离的叶点霉菌，在PDA培养基中发酵。b.利用相似相容原理对发酵液进行粗提取，并利用紫外-可见光分光光度计进行吸收波长的检测。c.利用分子筛原理，进行凝胶柱层析进一步分离。d.对于分子量相近而结构不同的目标物，利用TLC进行进一步的纯化。
2.根据权利要求1a所述的原料的选择，其特征在于首先选取了野生叶点霉菌作为实验原料，该原料容易获得，培养基简单，培养条件温和，成本低，并且是一种新型的提取蒽醌类物质的资源。
3.根据权利要求1b所述的特征波长的检测，其特征在于测得特征吸收波长为291nm。
4.根据权利要求1c所述的凝胶层析,其特征在于固定相为SephadexLH-20,流动相为水，柱温18. 6°C，pH值为8. 2，设置流速为1. OmL/min，检测波长为291nm，在3. 6min时开始进样，进样量为2. OmL稀释液。
5.根据权利要求1d所述的TLC纯化部分，其特征在于主要对蒽醌类物质进行了分类提取，区别于史料均是对原料中总蒽醌类物质进行粗提取，本发明中的TLC纯化可将分子量相似，而结构不同的蒽醌类物质分离开来。采用250 μ m薄层硅胶板纯化，展开剂为苯、乙酸乙酯、醋酸的混合液，混合比例为苯乙酸乙酯醋酸为75 24 I (V/V/V) 0
全文摘要
本发明公开了一种从野生叶点霉菌发酵液中高效提取蒽醌类物质的方法，属于生物大分子纯化技术。首先利用相似相容原理，用正丁醇萃取叶点霉发酵液，进行粗提取。然后检测特征吸收波长为291nm。粗提液减压浓缩后，以Sephadex LH-20为固定相，水为流动相进行柱层析分离，得到的层析液进一步使用250μm薄层硅胶板进行TLC纯化，展开剂为苯、乙酸乙酯、醋酸的混合液，混合比例为苯乙酸乙酯醋酸为75∶24∶1(V/V/V)。方法包括紫外-可见光分光光度计检测技术、层析分离纯化技术。优点是原料成本低，可用于高效提取功能因子蒽醌类物质，操作简便、提取效率高。
文档编号C12R1/645GK102994581SQ20121054918
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者潘风光, 王楠, 任林柱, 宫新统 申请人:吉林大学