适用于多种样本的dna提取试剂配制方法和提取方法
【专利摘要】适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，它涉及生物【技术领域】，它样本的预处理过程为：刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5mlPBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀，它的DNA样本的提取过程为：在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul的20mg/ml蛋白酶K涡旋混匀30-40min，温度为60-80℃，期间每隔10min震荡一次，然后进行DNA样本的纯化处理及检测。它简化了提取步骤，只需要经过细胞裂解、漂洗和溶解三个步骤，使提取质量和纯度得到大幅提升，并适用于多种不同样本，降低了成本。
【专利说明】适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法
[0001]
【技术领域】:
本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法。
[0002]【背景技术】:
DNA提取是分子生物学的基本实验，也是不断发展的基因芯片检测中最基本的方法，它是基因芯片制备、分析和诊断的前提，因此，DNA提取是生物学最基础的技术之一，成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤:组织或细胞的破碎和裂解，核蛋白复合体的变性，核酸酶的灭活以及污染物的去除，理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸，同时没有蛋白、糖、脂和其它核酸污染等。酚抽提法、异丙醇沉淀法、甲酞胺裂解法是动物来源的DNA最为经典的方法，现行的很多方法都是在此基础上改进得来，这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠消化破碎细胞，在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。提取DNA的纯度很高，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。植物来源的DNA提取方法有十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法，SDS法和高盐低pH法等，细菌、真菌来源的DNA提取方法为碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。以上方法虽然经典但多用到酚等有毒的有机试剂，安全性低，对人体毒性较大，步骤较多且繁琐，耗时较长，提取结果不稳定，鉴于这些缺点，目前使用相对较少。多数生物实验室开始使用试剂盒提取DNA，市场上大多数商业核酸抽提试剂盒采用固相纯化法，相对于传统方法，试剂盒提取较快速和高效，固相系统抽提核酸依赖缓冲液的PH值和盐浓度来吸附核酸，基于以下原理:氢与亲水基质发生相互结合作用，在水溶液中则通过阴离子交换柱发生离子交换，以及通过亲和力和大小排除机制。固相纯化通常采用离心柱通过离心力作用运行，支持物有硅胶、玻璃颗粒 、硅藻土、阴离子交换载体等，抽提包括细胞裂解、核酸吸附、漂洗和洗脱四个关键性步骤，但基于这种方法的提取结果存在从固相支持物上DNA洗脱不完全，导致得率低等缺点，不能满足下游某些对DNA质、量要求较高的实验操作，尤其不利于对小量珍贵样本的提取。
[0003]
【发明内容】
:
本发明的目的是提供适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，它简化了提取步骤，只需要经过细胞裂解、漂洗和溶解三个步骤，针对前有方法提出的DNA质量不佳，含有杂质太多做了更进一步改进，使提取质量和纯度得到大幅提升，并适用于多种不同样本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度减少核酸的损失，最终DNA得率高，质量好。
[0004]为了解决【背景技术】所存在的问题，本发明采用以下技术方案:1、样本的预处理过程为:刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀。
[0005]2、DNA样本的提取过程为:在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液I和10_15ul的20 mg /ml蛋白酶K涡旋混匀30_40min，温度为60_80°C，期间每隔IOmin震荡一次。
[0006]3、DNA样本的纯化处理及检测过程为:取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80°C保温10-15min，将Ep管中的液体转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6-8min，抽吸上清液到另一个Ep管中，然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min，缓缓倒出上清液，在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入l_3ml的70%乙醇洗涤沉淀，采用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5_8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测OD值。
[0007]所述的溶解液1 为 1Ommol /L 的 Tris -HCl, 10 mmol /L 的KCl, 10 mmol /L 的MgCl2, 2 mmol /L 的 EDTA，0.4 mol /L 的 NaCl, 1% 的 SDS 配制而成的水溶液。
[0008]所述的溶解液2为5 mol /L NaCl溶液。
[0009]所述的溶解液3为去离子水或者为采用10 mmol /L的Tris _HC1，1 mmol /L的EDTA配制成的水溶液。
[0010]本发明具有以下有益效果:它简化了提取步骤，只需要经过细胞裂解、漂洗和溶解三个步骤，针对前有方法提出的DNA质量不佳，含有杂质太多做了更进一步改进，使提取质量和纯度得到大幅提升，并适用于多种不同样本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度减少核酸的损失，最终DNA得率高，质量好。
[0011]【具体实施方式】一:
本【具体实施方式】采取以下技术方案:1、样本的预处理过程为:刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀。
[0012]2、DNA样本的提取过程为:在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液I和10_15ul的20 mg /ml蛋白酶K涡旋混匀30_40min，温度为60_80°C，期间每隔IOmin震荡一次。
[0013]3、DNA样本的纯化处理及检测过程为:取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80°C保温10-15min，将Ep管中的液体转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6-8min，抽吸上清液到另一个Ep管中，然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min，缓缓倒出上清液，在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入l_3ml的70%乙醇洗涤沉淀，采用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5_8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测OD值。
[0014]所述的溶解液I 为 IOmmol /L 的 Tris -HCl, 10 mmol /L 的KCl, 10 mmol /L 的MgCl2, 2 mmol /L 的 EDTA，0.4 mol /L 的 NaCl, 1% 的 SDS 配制而成的水溶液。
[0015]所述的溶解液2为5 mol /L NaCl溶液。
[0016]所述的溶解液3为去离子水或者为采用10 mmol /L的Tris _HC1，1 mmol /L的EDTA配制成的水溶液。
[0017]本【具体实施方式】具有以下有益效果:它简化了提取步骤，只需要经过细胞裂解、漂洗和溶解三个步骤，针对前有方法提出的DNA质量不佳，含有杂质太多做了更进一步改进，使提取质量和纯度得到大幅提升，并适用于多种不同样本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度减少核酸的损失，最终DNA得率高，质量好。
[0018]【具体实施方式】二:本【具体实施方式】的与【具体实施方式】一的不同之处在于它的样本预处理过程不同，它的样本的预处理过程为:采用钥匙将血凝块转入干净的玻璃研磨器中，加入380-410ul的溶液4，充分研磨直到没有明显的血凝块，吸取0.4-0.5ml的研磨液到新的1.5ml的Ep管中，然后加入适量的溶解液4补充体积到1.5ml，室温静置10_15min，然后采用离心机进行离心，吸弃上清液，重复上步骤2-3次，得到白细胞沉淀。其它处理方法与【具体实施方式】一相同。
[0019]所述的溶解液4采用1.0g的KHC03，8.3g的NH4CL和0.037 g的EDTA_Na2，加入1000ml双蒸水配制成的工作液。
[0020]【具体实施方式】三:本【具体实施方式】与【具体实施方式】一的不同之处在于样本的预处理过程不同，它的样本的预处理过程为:将抗凝血吹吸均匀，取出0.3-0.5ml的血液到
1.5ml的Ep管中，然后加入 适量的溶解液4补充体积到1.5ml，室温静置10_15min，采用离心机进行离心3min，吸弃上清液，重复上步骤2-3次，得到白细胞沉淀。其它处理方法与【具体实施方式】一相同。
【权利要求】
1.适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于:(1)、样本的预处理过程为:刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀；(2)、DNA样本的提取过程为:在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液I和10-15ul的20 mg /ml蛋白酶K涡旋混匀30-40min，温度为60_80°C，期间每隔IOmin震荡一次；(3)、DNA样本的纯化处理及检测过程为:取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80°C保温10_15min，将Ep管中的液体转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6_8min，抽吸上清液到另一个Ep管中，然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min,缓缓倒出上清液，在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入l-3ml的70%乙醇洗涤沉淀，采用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5-8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测OD值。
2.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液I为IOmmol /L的Tris -HCl, 10 mmol /L的KCl, 10 mmol /L的MgCl2, 2 mmol /L 的 EDTA，0.4 mo I /L 的 NaCl，1% 的 SDS 配合而成的水溶液。
3.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液2为5 mol /L NaCl溶液。
4.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液3为去离子水或者为采用10 mmol /L的Tris _HC1，1 mmol /L的EDTA配制成的水溶液。
5.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的样本的预处理过程为:采用钥匙将血凝块转入干净的玻璃研磨器中，加入,380-410ul的溶液4，充 分研磨直到没有明显的血凝块，吸取0.4-0.5ml的研磨液到新的,1.5ml的Ep管中，然后加入适量的溶解液4补充体积到1.5ml，室温静置10_15min，然后采用离心机进行离心，吸弃上清液，重复上步骤2-3次，得到白细胞沉淀。
6.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解 液4采用1.0g的KHC03，8.3g的NH4CL和0.037 g的EDTA_Na2，加入,1000rnl双蒸水配制成的工作液。
7.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的样本的预处理过程为:它的样本的预处理过程为:将抗凝血吹吸均匀，取出,0.3-0.5ml的血液到1.5ml的Ep管中，然后加入适量的溶解液4补充体积到1.5ml，室温静置10-15min,采用离心机进行离 心3min,吸弃上清液,重复上步骤2_3次,得到白细胞沉淀。
【文档编号】C12N15/10GK103882006SQ201210554081
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2012年12月19日
【发明者】杨利霞, 修贺明 申请人:河北省健海生物芯片技术有限责任公司