一种高通量真菌的分离方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，本发明公提供了一种强寄生病原真菌的分离方法，以便于今后研究。单孢分离是分离强寄生病原真菌的有效方法，特别适合分离用传统的组织分离法污染严重，难以分离成功的病原真菌，如梨黑星病菌、苹果褐斑病菌、尾孢属真菌等。传统的单孢分离技术由于操作复杂，技术要求高，限制了其应用。改用直径1mm的毛细管打孔后，大大简化了操作过程，使单孢分离的可操作性更强，速度更快，一般的技术人员经简单的训练可掌握此项技术，从而扩大了其应用范围。主要采用该方法对强寄生真菌和子囊孢子进行分离，获得良好的效果。
【专利说明】一种高通量真菌的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，主要涉及一种强寄生病原真菌的分离方法。
【背景技术】
[0002]强寄生真菌主要寄生在活体植物上，从活体的寄主组织中获取必要的养份，在人工培养基上生长缓慢。除了病原菌外，发病的寄主组织内还有内生菌、腐生菌等杂菌。由于这些杂菌在人工培养基上生长快，用常规的病组织分离法分离强寄生真菌，常被杂菌污染，分离成功率非常低。单孢分离能够避免病组织所带杂菌造成的污染，用于强寄生真菌的分离，成功率录取较高。
[0003]单孢分离是真菌分离与纯化的基本技术，广泛用于真菌的遗传和变异、生理生化特性研究和菌种的纯化与保存工作。国外已发明专门的“单孢子分离器，而国内主要靠手工操作。常用的单孢分离方法有:小玻片单孢子分离法，印痕移取单孢子分离法，琼脂平板稀释法:即将孢子悬浮液涂在琼脂平板表面，然后直接挑取单孢，连续变倍体视显微镜单孢分离法及眉毛挑针挑取单孢子法等。这些单孢分离方法操作复杂，对技术要求较高，从而限制了其应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种对强寄生病原真菌的分离方法，以便于今后研究。在多年实验室工作的基础上，对琼脂平板稀释单孢分离法进行了改进，改进的毛细管打孔单孢分离法，具有操作简便、分离速度快、污染低等优点。
【具体实施方式】
[0005]毛细管打孔法单孢分离的基本步骤是:直接从病斑上获取孢子，涂布到水琼脂片上，在显微镜下找到所需孢子，用毛细管打孔，最后将有单个孢子的琼脂饼转入培养基中培养，具体方法如下:
(O水琼脂制备:将琼脂粉直接加入无菌水中，在微波炉中加热至熔化；或者，将琼脂粉加入自来水中，灭菌后备用。单孢分离常用2%水琼脂。
[0006](2)琼脂片制备:用1 ml灭菌移液枪吸取2%的无菌水琼脂涂布在无菌的载玻片上，厚度均匀。
[0007](3)孢子涂布:用灭菌挑针挑取病斑上的孢子，沾附到水琼脂片上，用灭菌玻棒或毛细管沾取无菌水，稀释涂布孢子。或者，用直径I mm的毛细管，在酒精灯下烧软后拉丝，折断后制作成细针(简称“毛细管针”)，用毛细管针挑取孢子，直接涂布到水琼脂片上。
[0008](4)孢子选取:显微镜检(常用10倍物镜)涂有孢子的水琼脂片，找到典型孢子后，移入视野中央(视野内仅此1个孢子)，然后下移载物台。
[0009](5)琼脂打孔:取内径为1mm的毛细管，在酒精灯上烧软后弯成直角，短臂长度约Icm0短臂端部在酒精灯上加热灭菌后，对准显微镜物镜头下的光斑中央压下，在水琼脂上打一个直径Imm的圆饼。提升载物台到原来的位置，观察目标孢子是否在琼脂饼上，如果不在，重新选取孢子。
[0010](6)单孢转移:用无菌挑针或毛细管针，挑取带有目标孢子的琼脂饼，转入相应的培养基中，有孢子的一面紧贴培养基。每皿可放3飞个单孢。
[0011]第2到第6步，都需在超净工作台上或无菌室内完成。
[0012]实施例1
干腐病菌孢子的获取:将10ml，1%无菌的水琼脂倒入无菌培养皿中，冷却。自田间采集带有小黑点的干腐病枝，用70%的酒精擦拭表面消毒后，切取病皮，粘贴在水琼脂上。倒置培养皿，在病皮的正下方，放置一片用于单孢分离的琼脂片，有琼脂的面对准病皮。密封培养皿，在室温下保湿2~12 h，病皮上成熟子囊中的子囊孢子会喷射到水琼脂片上，在显微镜下挑取单孢，转入PAD中培养。
[0013]实施例2
干腐病菌分生孢子自田间采集带有小黑点的干腐病枝，用70%的酒精擦拭表面消毒。切取消毒病皮，用无菌水浸湿，置于无菌的培养皿中，室温下(2(T25 °C)保湿12 h，白色细长的分生孢子角即可自孢子器中挤出，用毛细管针，挑取孢子角，涂布到水琼脂片上，挑取单孢，转入PDA中培 养。
【权利要求】
1.一种强寄生病原真菌的采样、分离方法，其特征是:通过以下步骤实现:(1)样品采集:直接从病斑上获取孢子，涂布到水琼脂片上，在显微镜下找到所需孢子；(2)样品分离:用毛细管打孔，将有单个孢子的琼脂饼转入培养基中培养。
2.如权利要求1所述的干腐病菌孢子的获取:将IOml,1%无菌的水琼脂倒入无菌培养皿中，冷却；自田间采集带有小黑点的干腐病枝，用70%的酒精擦拭表面消毒后，切取病皮，粘贴在水琼脂上。
3.如权利要求2所述的用灭菌挑针挑取病斑上的孢子，沾附到水琼脂片上，用灭菌玻棒或毛细管沾取无菌水，稀释涂布孢子；或者，用直径I mm的毛细管，在酒精灯下烧软后拉丝，折断后制作成细针(简称“毛细管针”)，用毛细管针挑取孢子，直接涂布到水琼脂片上。
4.如权利要求1、2、3所述的通过对琼脂平板稀释单孢分离法进行了改进，改进的毛细管打孔单孢分离法，具有操 作简便、分离速度快、污染低等优点。
【文档编号】C12N1/14GK103881924SQ201210554055
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2012年12月19日
【发明者】王英俊, 邱梅 申请人:青岛康地恩药业股份有限公司