专利名称：引物及该引物质谱检测pik3ca基因热点突变的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及引物及该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法。
背景技术：
(I)、单核苷酸多态性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500 1000个碱基对中就有I个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单 个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。一般而言，SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。(2)、PIK3CA 基因PIK3CA是PI3K家族的关键成员-1A类磷脂酰肌醇_3激酶的ρ110 α催化亚基。PIK3CA是一个34kb的基因，定位于染色体3q26. 32，含20个外显子，编码1068个氨基酸，生成124kDa蛋白质，它是逆转录病毒v-p3k癌基因在细胞内的同系物。PIK3CA的功能是催化4，5-PIP2成为3，4, 5-PIP3。研究已经发现在多种人类癌症(结肠癌，乳癌，脑癌，肝癌，胃癌和肺癌等)中存在PIK3CA的扩增、缺失、及体细胞突变。体细胞突变的PIK3CA其激酶活性增加并导致细胞转化。PIK3CA基因在癌症中呈现高频突变人们对PIK3CA在多种癌症中的突变进行了检测，大量的数据表明PIK3CA有3个热点突变区，即第9外显子的E542K和E545K，以及第20号外显子的H1047R。PI3K作为EGFR下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物的耐药。所以，检测PIK3CA基因突变可以预测肿瘤患者对EGFR-TKI等药物的耐药性。(3)、目前的PIK3CA突变的检测方法目前PIK3CA突变的检测方法有直接测序法，实时定量PCR法，液态芯片法等。其中，直接测序法的灵敏度低，要求受检材料的突变比例大于20%，且检测成本也较高；实时定量PCR法的灵敏度较直接测序法高，可达5%左右，但其通量低，且需面对其假阳性高的问题。液态芯片法的特异性和准确率高，但是需要针对突变位点设计探针和相应的微球，成本较闻。因此，我们需要找到一种灵敏度高，操作简便，成本低的方法，以求可以实现对PIK3CA热点突变快速简便准确的检测。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种引物及该引物质谱检测PIK3CA热点突变的方法；旨在解决现有技术灵敏度低，通量低，准确度不高，成本高的问题。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是引物，包括扩增引物和测序引物，所述的扩增引物序列如下SEQ ID N0:15’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’SEQ ID N0:25’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’
SEQ ID N0:35’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’SEQ ID N0:45’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’SEQ ID N0:55’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’SEQ ID NO: 65 ’ -ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3，SEQ ID N0:75，-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’SEQ ID NO:85’ -ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’ ；所述的延伸引物序列如下SEQ ID NO:95’ -TCCAGCCACCATGAT-3’SEQ ID NO: 105’-CCTCTCTCTGAAATCACT-3’SEQ ID NO: 115’-CACGAGATCCTCTCTCT-3’SEQ ID NO: 125’-GAAACAAATGAATGATGCAC-3’。进一步的所述的引物是具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 12任一项所示序列的核
苷酸序列。本发明的另一目的是利用该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，包括如下步骤⑴、确定PIK3CA热点突变在基因序列中的位置；⑵、根据突变位点及其两端的序列设计用于扩增反应的引物对和用于延伸反应的引物；⑶、使用扩增引物对进行扩增反应以获得包含突变位点及其两端序列的扩增产物；(4)、使用SAP酶处理扩增产物，去除残留在反应体系中多余的脱氧核苷酸；(5)、使用延伸引物进行延伸反应；(6)、然后使用树脂纯化延伸产物；(7)、将延伸产物转移到芯片上；(8)、将芯片放置于质谱仪中，运行程序进行检测；⑶、读取并分析检测数据，确认样本PIK3CA基因目的位点的基因型。进一步的所述步骤⑴热点突变定位于PIK3CA基因的第542位、545位、1047位密码子中的一种或几种；所述步骤⑵扩增反应所使用的扩增引物包括SEQID NO:1至SEQ IDN0:8所示序列中的一对组合或多对组合；所述步骤⑵延伸引物包括SEQ ID N0:9至SEQ IDNO: 12所示序列中的一条或多条。
进一步的所述第542位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基上，为错义突变，扩增引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，延伸引物为SEQ ID N0:9。进一步的所述第545位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基上，为错义突变，扩增引物为SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4，延伸引物为SEQ ID NO: 10。进一步的所述第1047位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基和第二位碱基上，均为错义突变，扩增引物分别为SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的组合以及SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的组合，延伸引物分别为SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12。本发明的有益技术效果是与现有技术相比，本发明的优势在于(I)、检测灵敏度高，质谱仪将不同质量的产物加以区分，可以检测出PIK3CA突变比率低于1%的样本。
(2)、通量高，使用384孔板进行实验，可一次性对190例样本同时进行检测。( 3 )、准确率高，不出现假阳性的检测结果。(4)、检测成本低。
图1、使用延伸引物SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10对测试样本PIK3CA基因545位密码子的第一位碱基以及1047位密码子的第一位碱基进行检测的结果；图2、使用延伸引物SEQ ID N0:11和SEQ ID NO: 12对测试样本PIK3CA基因542位密码子的第二位碱基以及1047位密码子的第二位碱基进行检测的结果。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面结合具体样本对本发明进行具体说明(I)、确定PIK3CA热点突变在基因序列中的位置；人们对PIK3CA在多种癌症中的突变进行了检测，大量的数据表明PIK3CA有3个热点突变区，分别是第9号外显子的542位密码子和545位密码子以及第20号外显子的1047位密码子；这3个热点突变位置共包括4个碱基的错义突变(其中1047位密码子的第一和第二位碱基均为突变位点；542、545位密码子则均为第一位碱基发生突变)，每一个突变对应一个SNP号(rs号)；具体如下542位密码子第一位碱基对应rs号为rsl21913273 ；545位密码子第一位碱基对应rs号为rsl04886003 ；1047位密码子第一位碱基对应rs号为rsl21913281 ；1047位密码子第二位碱基对应rs号为rsl21913279。为了避免延伸反应中延伸引物之间形成二聚体，将这个4个突变检测分为两组rsl04886003 和 rsl21913281 一组；rsl21913273 和 rsl21913279 一组，在扩增反应和延伸反应中，始终分为这两组进行。
(2)、根据步骤(I)中的SNP位点设计扩增引物，遵循引物间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则；rsl21913273 使用扩增引物 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID NO:6;rsl04886003 使用扩增引物 SEQ ID N0:3 和 SEQ IDN0:4;rsl21913281 使用扩增引物 SEQ ID N0:1 和 SEQ ID NO:2;rsl21913279 使用扩增引物 SEQ ID N0:7 和 SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4混合为一管扩增引物工作液，工作液浓度为I μ M ;SEQ ID Ν0:5至SEQ ID NO:8混合为一管扩增引物工作液，工作液浓度为I μ M ;
(3)、根据步骤(I)中的SNP位点设计延伸引物，遵循每条延伸引物的分子量相互间的差别要大于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量要在4500-8500Da之间的原则。rsl21913273 使用延伸引物 SEQ ID NO: 11;rsl04886003 使用延伸引物 SEQ ID NO: 10;rsl21913281 使用延伸引物 SEQ ID NO:9;rsl21913279 使用延伸引物 SEQ ID NO: 12;(4)、使用扩增引物对进行扩增反应以获得包含突变位点及其两端序列的扩增产物；扩增体系为
试剂终浓度加样体积(μι)ilFLC 级纯水__/__1.3
PCR反应缓冲液
2mi MgCL-0.5
(含 20nM MgCLO25mM MgCl22mM().4---
25mM dNTP 混合液 500___CL I I uM引物混介液O. μ\1__0.5
5 /μ| PCR _ I1:/反应 ().2 5ng/ μ L DNA IOng/反说 2 总体积[μι]__/__B. ()()()反应条件
权利要求
1.引物，包括扩增引物和延伸引物，其特征在于所述的扩增引物序列如下SEQ ID NO:15’ -ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’SEQ ID NO:25’ -ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’SEQ ID NO:35’ -ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’SEQ ID NO:45’ -ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’SEQ ID NO:55’ -ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’SEQ ID NO:65’ -ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’S EQ I D NO:75’ -ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’SEQ ID NO:85’ -ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’ ；所述的延伸引物序列如下SEQ ID NO:95’ -TCCAGCCACCATGAT-3’SEQ ID NO:105’ -CCTCTCTCTGAAATCACT-3’SEQ ID NO:115’ -CACGAGATCCTCTCTCT-3’SEQ ID NO:125’ -GAAACAAATGAATGATGCAC-3’。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述的引物是具有SEQID NO:1至SEQ ID NO: 12任一项所示序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求1、2所述该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，其特征在于 包括如下步骤⑴、确定PIK3CA热点突变在基因序列中的位置；⑵、根据突变位点及其两端的序列设计用于扩增反应的引物对和用于延伸反应的引物；⑶、使用扩增引物对进行扩增反应以获得包含突变位点及其两端序列的扩增产物；⑷、使用SAP酶处理扩增产物，去除残留在反应体系中多余的脱氧核苷酸；(5)、使用延伸引物进行延伸反应；(6)、然后使用树脂纯化延伸产物；⑴、将延伸产物转移到芯片上；(8)、将芯片放置于质谱仪中，运行程序进行检测；⑶、读取并分析检测数据，确认样本PIK3CA基因目的位点的基因型。
4.根据权利要求3所述该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，其特征在于所述步骤⑴热点突变定位于PIK3CA基因的第542位、545位、1047位密码子中的一种或几种； 所述步骤⑵扩增反应所使用的扩增引物包括SEQ IDNO:l至SEQ ID NO:8所示序列中的一对组合或多对组合；所述步骤⑵延伸引物包括SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:12所示序列中的一条或多条。
5.根据权利要求4所述该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，其特征在于所述第542位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基上，为错义突变，扩增引物为SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2，延伸引物为 SEQ ID NO:9。
6.根据权利要求4所述该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，其特征在于所述第545位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基上，为错义突变，扩增引物为SEQID N0:3 和 SEQ ID NO:4，延伸引物为 SEQ ID NO: 10。
7.根据权利要求4所述该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，其特征在于所述第1047位密码子热点突变发生在此密码子的第一位碱基和第二位碱基上，均为错义突变，扩增引物分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的组合以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 的组合，延伸引物分别为SEQ ID ΝΟ:11和SEQ ID NO:12。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，提供了一种引物及该引物质谱检测PIK3CA基因热点突变的方法，包括如下步骤⑴定位PIK3CA基因的热点突变位点；⑵根据这些突变位点两端的DNA序列设计出用于扩增反应的引物和用于延伸反应的引物；⑶扩增反应；⑷SAP酶(碱性磷酸酶)处理；⑸延伸反应；⑹使用树脂纯化延伸反应的产物；⑺将树脂纯化过的产物转移到芯片上；⑻将芯片置于质谱仪中，运行检测程序；⑼读取并分析检测数据，确定PIK3CA基因目的位点的基因型。相对于传统的检测方法，本发明具有灵敏度高，准确率高，通量高，成本低的特点。
文档编号C12N15/11GK103013993SQ20121057458
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者郝玮, 陈然, 张聪, 李金欢, 李小青, 周蕊, 梁超, 韩韬, 黄士昂, 涂赞兵, 陈忠, 方国伟 申请人:武汉康圣达医学检验所有限公司