专利名称：一种环氧水解酶突变体及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及ー种环氧水解酶突变体及其基因和应用。
背景技术：
生物催化是ー个由有机化学、生物化学、微生物学和过程工程学等多个学科交叉的研究領域。生物催化剂具有高效、特异的催化活力，其最大优势在于无可比拟的化学选择性和立体选择性，在酶的作用下，产物的光学纯度可高达99%ee，在医药中间体合成中显得尤为重要。生物催化的反应条件很温和，适宜在常温常压、中性PH和水相中进行反应，这与“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”等エ业发展的目标相符。生物催化技术已被看 作是对传统生物发酵与化学合成产业改造极为重要的、很有吸引力的技术之一。目前已实现エ业化的生物转化过程中，水解酶由于其高活性和稳定性以及不需要额外添加辅因子等优点成为主要的一大类应用于有机合成的生物催化剂，大约占生物催化剂总量的44%，而其中的大部分水解酶应用于手性化合物的合成(參见Curr. Org.Chem. 2010，14，1447-1460)。在大量的手性化合物中，手性环氧化物是ー类非常重要的手性合成砌块，由于环氧化物及其开环产物邻ニ醇能与各种亲核试剂反应，因而广泛应用于手性药物、农药、液晶、香料以及其他手性化学品的合成。通过化学法或生物法催化外消旋环氧化物的动力学拆分可以制备光学活性环氧化物。其中环氧水解酶是用于高光学活性手性环氧化物和手性ニ醇制备的ー类重要的生物催化剂。它具有以下一些优点1)酶的来源广泛、底物谱广、选择性高；2)反应不需要添加任何辅因子；3)环氧水解酶在非水相介质中仍能保留一定活性；4)反应条件温和，无污染，符合“緑色化学”趋势；5)具有对映选择性和位置选择性互补的环氧水解酶可实现对映归ー性水解，理论上能以100%的转化率获得单一构型的光学纯邻位ニ醇，具有很高的原子经济性，因此该方法在光学纯的环氧化物或邻位ニ醇制备中具有很高的应用潜力。目前市场上已有来源于黑曲霉(Aspergillrs niger)和红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的环氧水解酶实现了商品化酶制剂的销售(Sigma)。然而真正实现エ业化的环氧水解酶应用实例还很少，许多重要的环氧化合物找不到合适的环氧水解酶进行拆分。一大类重要的心血管药物-洛尔类药物(也称P-blocker，￠-肾上腺素阻断剂)，发挥功能的主要是它们的(S)-对映体，而(R)-对映体不具备药理活性甚至会产生副作用，如普萘洛尔的(S)-对映体的药理活性是(R)-对映体药理活性的130倍(參见Br. J.Pharmacol. 1968，34，13-55)。洛尔类药物可通过其相应构型的环氧化物作为前体合成得至IJ，如(S)-普萘洛尔可通过(S)-萘基缩水甘油醚作为前体合成得到。但由于洛尔类药物的合成前体往往分子结构比较大，因此具有较大的空间位阻，目前已发现的环氧水解酶对它们的活性和选择性往往很低。从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) CGMCC1293克隆得到的环氧水解酶BmEH可催化多种缩水甘油芳基醚的对映选择性水解拆分制备高光学活性的手性环氧化物，该酶已经在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组过量表达(Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 1510-1518;CN102242085A)。该酶对苯基缩水甘油醚底物具有高达83U/mg纯酶的比活力，并且优先催化(R)-构型底物水解。对于萘基缩水甘油醚，由于其苯环上有大取代基团的底物，因此该重组酶对该底物的活性和选择性较低，活性不足lU/mg纯酶，从而限制了它在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。通过解析环氧水解酶的晶体结构，并利用分子动カ学模拟等手段，从分子水平解析酶的催化过程，通过定点突变技术提高环氧水解酶对目标底物的催化活性和选择性，将具有较强的エ业应用价值。
发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题是，针对目前已发现的环氧水解酶对萘基底物的催化活性和选择性都较低的问题，提供一种环氧水解酶突变体蛋白质及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，所述环氧水解酶突变体蛋白质、含有该环氧水解酶突变体蛋白质的细胞的制备方法，以及该环氧水解酶突变体蛋白质或表达该环氧水解酶突变体蛋白质的重组转化体作为催化剂在催化消旋环氧化物水解拆分反应，制备光学纯手性化合物中的应用。与野生型环氧水解酶相比，本发明提供的环氧水解酶突变体蛋白质具有更高的催化底物反应活性和选择性。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之ー是一种分离的蛋白质，所述蛋白质是在具有如序列表中SEQ IDNo:1所示氨基酸序列的蛋白质的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位经过取代ー个氨基酸且具有环氧水解酶活性的由其衍生的蛋白质。其中所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。具有序列表中SEQ ID No:1所不氣基酸序列的蛋白质命名为BmEh蛋白。其中所述的取代的位点较佳地为序列表中SEQ ID No:l所示氨基酸序列的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221氨基酸中的一位或多位。其中所述蛋白质较佳地为将具有序列表中SEQ IDNo:1所不氣基酸序列的蛋白质的第98位的色氨酸突变为苯丙氨酸(W98F);所述氨基酸序列中第101位的甘氨酸突变为亮氨酸(GlOlL);所述氨基酸序列中第123位的脯氨酸突变为色氨酸(P123W);所述氨基酸序列中第128位的苯丙氨酸突变为丙氨酸(F128A)、缬氨酸(F128V)或异亮氨酸 (F128I)，其中更佳地是突变为缬氨酸(F128V);所述氨基酸序列中第132位的亮氨酸突变为丙氨酸(L132A);所述氨基酸序列中第144位的酪氨酸突变为苯丙氨酸(Y144F);所述氨基酸序列中的第145位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M145A)、缬氨酸(M145V)、异亮氨酸(M145I)、亮氨酸(M145L)、半胱氨酸(M145C)、苏氨酸(M145T)或组氨酸(M145H)，其中更佳地是突变为丙氨酸(M145A);所述氨基酸序列中第168位的亮氨酸突变为丙氨酸(L168A)；所述氨基酸序列中第169位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(V169F);所述氨基酸序列中第203位的酪氨酸突变为苯丙氨酸(Y203F);所述氨基酸序列中第206位的亮氨酸突变为丙氨酸(L206A);所述氨基酸序列中第208位的异亮氨酸突变为丙氨酸(I208A);所述氨基酸序列中第219位的亮氨酸突变为丙氨酸(L219A);所述氨基酸序列中第220位的苯丙氨酸突变为丙氨酸(F220A);所述氨基酸序列中第221位的脯氨酸突变为甘氨酸(P221G);所述氨基酸序列中第242位的苯丙氨酸突变为丙氨酸(F242A);所述氨基酸序列中第268位的丙氨酸突变为苯丙氨酸(A268F)所得的蛋白质。本发明所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之ニ是一种分离的核酸，所述核酸是编码上述蛋白质的核酸分子。其中所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括从自然界中提取天然存在的编码环氧水解酶的核酸分子，通过基因克隆技术获得编码环氧水解酶突变体的基因核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码环氧水解酶突变体 的核酸分子。如本领域技术人员所知编码SEQ IDNo:1的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或増加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。本发明所述核酸较佳地为具有点突变的核酸分子，所述具有点突变的核酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地为以来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) CGMCC1293中的环氧水解酶基因(该基因名称bmeh，请參考GenBank:HQ436037.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取需要进行突变的氨基酸位点上下游各15 20bp的一段碱基序列，将突变位点的碱基替换为突变后氨基酸的密码子，作为PCR正向引物，其反向互补序列即为PCR反向引物)，通过PCR方法扩增，即得到带有点突变的核酸分子。其中所述含有突变点的突变引物的序列如序列表中SEQ ID N0:2 SEQ ID NO:43 所示。其中所述含有突变点的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成。利用所得PCR引物进行PCR扩增程序，即得编码所述环氧水解酶突变体的核酸分子。其中所述PCR扩增为本领域常规技术，其中所述PCR反应的体系(50iU)较佳地为上述模板 0. 5 20ng，5ii 110XK0D plus buffer, 5 u I dNTP (各 2. OmM)，2 y IMgS04(25mM)，一对突变引物各liil(20iiM)，l个单位的KOD酶，加灭菌蒸馏水至50u I0所述PCR扩增的程序较佳地为(1)94° C变性5min ;(2)94° C变性30sec，
(3)55° C退火lmin，(4)68° C延伸7min，步骤⑵ ⑷共进行30个循环，最后68° C延伸10min，4° C保藏产物。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是ー种包含上述核酸的重组表达载体。其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即将本发明所述的环氧水解酶基因突变体的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选地为质粒pET-28a(+)。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是ー种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携帯的环氧水解酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(E. coli)，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5a。将前述重组表达质粒转化至E. coli BL21 (DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五是一种重组环氧水解酶的制备方法，其中包括如下步骤培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得重组环氧水解酶。其中所述制备方法较佳地为将上述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素(100 u g/ml)的LB培养基中，30 40° C，150 200rpm培养，培养液的吸光密度OD6tltl达到0. 5^1. 0 (优选0. 8)，加入0. 05^1. OmmoI/L (优选地为0. 2mmol/L)的异丙基-P -D-硫代 吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16 30° C(优选25° C)，诱导12 16小时即可得到高效表达的重组环氧水解酶。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六是上述蛋白质或上述重组表达转化体作为催化剂在消旋环氧化物水解拆分制备光学纯手性环氧化物以及手性邻位ニ醇中的应用。其中所述消旋环氧化物的化学通式较佳地如式I或式2所示式I式 2其中取代基R为本领域常规使用的取代基，其中取代基R为H、羟基、腈基、酰胺基、甲氧こ基、甲砜氨基、烷基、硝基、卤素基团、2，3-芳香基取代、2，3-芳烷杂环基取代或2，3-环状杂烷基取代。其中所述消旋环氧化物更佳地为苯基缩水甘油醚、a-萘基缩水甘油醚、2-こ基-苯基缩水甘油醚、2-烯丙基-苯基缩水甘油醚、对硝基氧化苯こ烯、4-环氧丙氧基咔唑、4-环氧丙氧基苯こ酰胺、对氯苯基缩水甘油醚、4-甲砜氨基苯基缩水甘油醚、2-腈基苯基缩水甘油醚、4-羟甲苯基缩水甘油醚、4-甲氧こ基苯基缩水甘油醚、2-烯丙氧基苯基缩水甘油醚、2R，3S-1, 2，3，4-四氢萘基-2，3- ニ醇缩水甘油醚、2-羰基-3，4- ニ氢喹啉缩水甘油醚或吲哚缩水甘油醚。其中所述光学纯手性环氧化物的化学通式较佳地如式3或式4所示
B n 、丁p I* r式3式 4
其中所述手性邻位ニ醇的化学通式如式5或式6所示
权利要求
1.一种分尚的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质是在具有如序列表中SEQ ID No:1所不氨基酸序列的蛋白质的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸且具有环氧水解酶活性的由其衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列中第123位的脯氨酸突变为色氨酸；所述蛋白质的氨基酸序列中第128位的苯丙氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸； 所述蛋白质的氨基酸序列中第144位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；所述蛋白质的氨基酸序列中第145位的甲硫氨酸突变为丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸或缬氨酸；所述蛋白质的氨基酸序列中第168位的亮氨酸突变为丙氨酸；所述蛋白质的氨基酸序列中第219位的亮氨酸突变为丙氨酸；所述蛋白质的氨基酸序列中第221位的脯氨酸突变为甘氨酸。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
4.一种包含如权利要求3所述的核酸的重组表达载体。
5.一种包含如权利要求4所述的重组表达载体的重组表达转化体。
6.一种重组环氧水解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤培养如权利要求5所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组环氧水解酶。
7.如权利要求1所述蛋白质或如权利要求5所述重组表达转化体作为催化剂在催化消旋环氧化物水解拆分反应，制备光学纯手性环氧化物以及手性邻位二醇中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述消旋环氧化物的化学通式如式I或式2 所示
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述消旋环氧化物为苯基缩水甘油醚、 α -萘基缩水甘油醚、2-乙基-苯基缩水甘油醚、2-烯丙基-苯基缩水甘油醚或对硝基氧化苯乙烯、4-环氧丙氧基咔唑、4-环氧丙氧基苯乙酰胺、对氯苯基缩水甘油醚、4-甲砜氨基苯基缩水甘油醚、2-腈基苯基缩水甘油醚、4-羟甲苯基缩水甘油醚、4-甲氧乙基苯基缩水甘油醚、2-烯丙氧基苯基缩水甘油醚、2R，3S-1, 2，3，4-四氢萘基_2，3-二醇缩水甘油醚、2-羰基_3，4- 二氢喹啉缩水甘油醚或吲哚缩水甘油醚。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述光学纯手性环氧化物如式3或式4所示
全文摘要
本发明公开了一种环氧水解酶突变体及其基因和应用。该环氧水解酶突变体是在具有如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白质的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸且具有环氧水解酶活性的由其衍生的蛋白质。本发明所述环氧水解酶突变体与野生型环氧水解酶相比，对消旋环氧化物的水解活性和对映选择性均有大幅度提高，所述环氧水解酶突变体尤其适合拆分催化消旋萘基缩水甘油醚拆分反应，制备(S)-萘基缩水甘油醚，并可进一步合成手性药物(S)-普萘洛尔，该水解酶突变体具有很好的工业应用前景。
文档编号C12N15/55GK103013945SQ20131001177
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者孔旭东, 许建和, 周佳海, 潘江 申请人:华东理工大学, 中国科学院上海有机化学研究所