专利名称：一种斑点杂交检测方法
技术领域：
本发明属于病毒检测领域，尤其涉及一种斑点杂交检测方法。
背景技术：
绵羊肺腺瘤病是由一种反转录病毒引起，在世界范围内发生。主要呈地方性散发，在英国、德国、法国、荷兰、意大利、南斯拉夫、希腊、以色列、保加利亚、土耳其、俄罗斯、南非、秘鲁、印度及中国内蒙古和新疆等地均有绵羊肺腺瘤病发病报道，特别是在苏格兰绵羊肺腺瘤病呈顽固的地方性散发，年发病率为20%左右，死亡率很高，可达100%。苏格兰的黑脸皮绵羊易感性最强，多呈单独感染(而在有些国家如南非、美国绵羊肺腺瘤病多与绵羊进行性肺炎及巴氏杆菌引起的肺炎混合感染)。绵羊肺腺瘤病主要感染绵羊，山羊有一定的抵抗力。各品种和年龄的绵羊均能发病，本病的潜伏期长，多为2-4岁成年绵羊。在苏格兰，绵羊肺腺瘤病的发病率有时在一牧群中最高可达20%左右，潜伏期也大大缩短，绵羊肺腺瘤病在一个地区或一个牧场一旦发生，很难彻底消灭。本病一般都以死亡而告终。目前也有关于绵羊肺腺瘤病毒的分子生物学技术检测的报道，但因检测样品的选择容易造成污染和假阳性出现等原因而没有推广。绵羊肺腺瘤病的病原是外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒，但在所有已研究过的正常绵羊基因组内都含有27拷贝与外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒密切相关的内源性绵羊肺腺瘤反转录序列。由于内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒的存在，使得特异性检测该病病原困难更大。针对绵羊肺腺瘤病的诊断方法，目前，全世界都没有建立统一特异性诊断绵羊肺腺瘤病的方法。其原因有三个方面:一是该病的潜伏期较长，病程较长，对处于潜伏期或临床症状不明显的病羊很难发现。二是病羊体内检测不到循环抗体，很难用常规的免疫学方法进行诊断，三是引起该病的病原绵羊肺腺瘤病毒仍未建立体外培养体系，所以常规的病毒分离鉴定方法无法利用。目前对该病的诊断还主要依靠临床症状和病理组织学检查。
发明内容
本发明实施例提供一种绵羊肺腺瘤病毒斑点杂交检测方法，旨在解决现有技术依靠临床症状和病理组织学检查，操作复杂，条件要求高。本发明实施例是这样实现的，一种斑点杂交检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:将含有DNA样品的杂交膜封入杂交袋中并加入杂交溶液，封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点；将所述杂交膜置于烧杯，加入冲洗溶液于摇床中洗膜，洗去未结合的探针并封闭所述杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点；取出所述杂交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗体的马来酸缓冲液中，使酶联抗体与地高辛相结合并洗去未结合的酶联抗体；将所述杂交膜置于显色液中显色，使用无酶水终止反应。
本发明实施例提供的方法操作方便，耗时相对较短，无需特殊的仪器设备，试剂成本较低，阳性信号清晰，具有更高的准确率和灵敏性，可用于实验室和临床样品中绵羊肺腺瘤病毒的快速准确检测。
图1表示本发明实施例提供的一种斑点杂交检测方法的实现流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例通过针对外源性绵羊肺腺瘤病毒前病毒DNA的特定片段，用反转录聚合酶链式反应方法制备与此特定片段互补的cDNA探针，并用地高辛标记此探针并确定该探针的灵敏度和特异性，利用斑点杂交技术，来检测组织细胞内或待检DNA样本中外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒的存在。 图1示出了本发明实施例提供的一种斑点杂交检测方法的实现流程，详述如下:在步骤SlOl中，将含有DNA样品的杂交膜封入杂交袋中并加入杂交溶液，封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点；在本发明的实施例中，杂交膜根据大小剪取尼龙膜，置于无酶水中漂洗，将尼龙膜完全湿润，取出后再浸泡于柠檬酸钠冲洗缓冲液中，并置于灭菌纸上于室温干燥。在本发明的实施例中，柠檬酸钠冲洗缓冲液由氯化钠及柠檬酸钠构成，溶于无酶水中，用氢氧化钠固体将PH调至7.0，于室温保存。作为本发明的优选实施例，DNA样品经过14mins的煮沸，快速放入冰水中，骤冷IOmins后置于杂交膜的毛面上并放在120°C的烘箱中30mins。在本发明的实施例中，加入的杂交溶液至杂交膜漂起为止，除去气泡，置于37 42°C恒温摇床，振摇I小时。杂交溶液包括去离子甲酰胺、柠檬酸钠冲洗缓冲液、阻断溶液、十二烷基磺酸钠、磷酸氢二钠及硫酸葡聚糖。在步骤S102中，将杂交膜置于烧杯，加入冲洗溶液于摇床中洗膜，洗去未结合的探针并封闭杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点；在本发明的实施例中，洗去未结合的探针并封闭所述杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点具体包括:1.将杂交膜放入烧杯中，加入冲洗溶液，在摇床中洗膜；2.取出杂交膜，在含有预热冲洗缓冲液的平皿中浸泡，转入10%马来酸缓冲液中，室温作用I小时。在步骤S103中，取出杂交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗体的马来酸缓冲液中，使酶联抗体与地高辛相结合并洗去未结合的酶联抗体；作为本发明的实施例，马来酸缓冲液包括马来酸及氯化钠，溶于无酶水中，用氢氧化钠固体将PH调为7.5并用无酶水定容，室温保存。
在步骤S104中，将杂交膜置于显色液中显色，使用无酶水终止反应。在本发明的实施例中，探针为特异性引物，其制备方法具体包括如下步骤:1.将绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因与长末端重复区的U3基因序列反转录聚合酶链式反应产物纯化并测定含量，于-20°C保存；2.依据地高辛标记及试剂盒检测进行囊膜基因和U3基因序列探针的标记，并于-20°C保存；3.检测标记特异性探针的灵敏度。在本发明的实施例中，检测标记特异性探针的灵敏度的步骤具体包括:1.将地高辛标记的产物和DNA样品进行浓度梯度稀释；2.取不同浓度I μ L平行点至尼龙膜上，120°C烘焙30mins后显色,根据尼龙膜上出现的斑点与DNA样品出现的斑点对照，确定探针的灵敏度。实施例一:特异性探针的制备如下:1.env基因与LTR的U3区反转录聚合酶链式反应产物的纯化及含量的测定(I) env基因的产物用env基因巢式反转录聚合酶链式反应产物，长度是730bp，进行纯化后，用紫外风光光度计测得含量为753ng/y L，_20°C保存；(2)U3的产物用U3巢式外侧引物的反转录聚合酶链式反应产物，长度是354bp，进行纯化后，用紫外风光光度计测得含量为324ng/y L，_20°C保存；2.按照地高辛标记及试剂盒的检测说明书进行，具体步骤如下:(I)取env基因和U3的反转录聚合酶链式反应产物分别16 μ L放入微量离心管中作为模板。(2)将微量离心管在沸水浴中变性lOmins，然后迅速将其转移到冰水浴中冷却IOmins0(3)在变性的DNA中加入4 μ L的地高辛，混匀并瞬时离心。(4) 37°C孵育20h。孵育时间越长越有利于提高DIG-DNA的产量。(5)加入65°C的乙二胺四乙酸2μ L(0.2M，ρΗ8.0)，65°C水浴lOmins，以终止标记反应，置于-20°C保存。
权利要求
1.一种斑点杂交检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 将含有DNA样品的杂交膜封入杂交袋中并加入杂交溶液，封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点； 将所述杂交膜置于烧杯，加入冲洗溶液于摇床中洗膜，洗去未结合的探针并封闭所述杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点； 取出所述杂交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗体的马来酸缓冲液中，使酶联抗体与地高辛相结合并洗去未结合的酶联抗体； 将所述杂交膜置于显色液中显色，使用无酶水终止反应。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交膜根据大小剪取的尼龙膜，置于无酶水中漂洗，将尼龙膜完全湿润，取出后再浸泡于柠檬酸钠冲洗缓冲液中，并置于灭菌纸上于室温干燥，所述柠檬酸钠冲洗缓冲液由氯化钠及柠檬酸钠构成，溶于无酶水中，用氢氧化钠固体将pH调至7.0，于室温保存。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA样品经过14mins的煮沸,快速放入冰水中，骤冷IOmins后置于杂交膜的毛面上并放在120°C的烘箱中30mins。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入的杂交溶液至杂交膜漂起为止，除去气泡，置于37 42°C恒温摇床,振摇I小时。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述杂交溶液包括去离子甲酰胺、柠檬酸钠冲洗缓冲液、阻断溶液、十二烷基磺酸钠、磷酸氢二钠及硫酸葡聚糖。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗去未结合的探针并封闭所述杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点具体包括: 将所述杂交膜放入烧杯中，加入冲洗溶液，在摇床中洗膜； 取出所述杂交膜，在含有预热冲洗缓冲液的平皿中浸泡，转入10%马来酸缓冲液中，室温作用I小时。
7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述马来酸缓冲液包括马来酸及氯化钠，溶于无酶水中，用氢氧化钠固体将PH调为7.5并用无酶水定容，室温保存。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针为特异性引物，其制备方法具体包括如下步骤: 将绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因与长末端重复区的U3基因序列反转录聚合酶链式反应产物纯化并测定含量，于-20°C保存； 依据地高辛标记及试剂盒检测进行 囊膜基因和U3基因序列探针的标记，并于_20°C保存； 检测标记特异性探针的灵敏度。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测所述标记特异性探针的灵敏度的步骤具体包括: 将地高辛标记的产物和DNA样品进行浓度梯度稀释； 取不同浓度I μ L平行点至尼龙膜上，120°C烘焙30mins后显色，根据所述尼龙膜上出现的斑点与所述DNA样品出现的斑点对照，确定探针的灵敏度。
全文摘要
本发明适用于病毒检测领域，提供了一种斑点杂交检测方法，所述方法包括将含有DNA样品的杂交膜封入杂交袋中并加入杂交溶液，封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点；将所述杂交膜置于烧杯，加入冲洗溶液于摇床中洗膜，洗去未结合的探针并封闭所述杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点；取出所述杂交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗体的马来酸缓冲液中，使酶联抗体与地高辛相结合并洗去未结合的酶联抗体；将所述杂交膜置于显色液中显色，使用无酶水终止反应。本发明可同时检测多个样品，操作方便，节省时间，无需特殊仪器设备，阳性信号清晰，试剂成本较低，可做半定量分析并可检测出病毒载量低的病毒。
文档编号C12R1/93GK103146843SQ20131006805
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者刘淑英, 赵泽赟, 齐景伟, 梁化春, 王宇 申请人:内蒙古农业大学